Huidig†adres: OX11 0DE, VK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, VK, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Het reactiecentrum-lichtoogstcomplex 1 (RC-LH1) is de kern van de fotosynthese in paarse fototrofe bacteriën. We hebben twee cryo-elektronenmicroscopiestructuren van het RC-LH1-complex uit Rhodopseudomonas palustris geïntroduceerd. De structuur van het RC-LH114-W-complex met een resolutie van 2,65 Å bestaat uit 14 subunits van LH1 die het RC omringen, onderbroken door proteïne W. Het complex zonder proteïne W bestaat volledig uit RC, omgeven door een gesloten LH1-lus van 16 subunits. De vergelijking van deze structuren geeft inzicht in de dynamiek van chinon in het RC-LH1-complex, inclusief voorheen onbekende conformationele veranderingen bij de binding van chinon aan de RC QB-site, evenals de locatie van hulpbindingsplaatsen voor chinon, die helpen bij de overdracht ervan naar het RC. De unieke structuur van het W-proteïne voorkomt de sluiting van de LH1-lus, waardoor een kanaal ontstaat voor het versnellen van de chinon/chinolon-uitwisseling.
De energie die door fotosynthese wordt geleverd, kan bijna al het leven op aarde in stand houden en heeft een groot potentieel voor zonnebiotechnologie. Naast het bevorderen van wereldwijde fotosynthese vertonen paarse fototrofe bacteriën ook verschillende energiemodi en metabolische capaciteiten. Ze kunnen fotosynthese vermijden en als heterotrofe bacteriën in het donker groeien, stikstof en koolstofdioxide fixeren, waterstof produceren en aromatische verbindingen afbreken (1-3). Om energie voor deze processen te leveren, moet licht snel en efficiënt worden omgezet in chemische energie. Dit proces begint wanneer het lichtvangende antennecomplex licht absorbeert en de opgevangen energie overdraagt ​​aan het reactiecentrum (RC), waardoor ladingsscheiding op gang komt (4-7). De basiseenheid van fotosynthese in paarse fototrofe bacteriën bestaat uit een type 2 RC, omgeven door lichtoogstcomplex 1 (LH1), dat het RC-LH1-kerncomplex vormt. LH1 wordt gevormd door een reeks gebogen αβ-heterodimeren, die elk twee bacteriële chlorofyl (BChl) a-moleculen en één of twee carotenoïden binden (8-12). De eenvoudigste LH1-antenne bestaat uit 16 of 17 αβ-heterodimeren die RC (9-13) omringen in een gesloten lus, maar in andere kerncomplexen onderbreken transmembraanpeptiden de continuïteit van de omringende LH1, waardoor de chinol/chinon-diffusie tussen RC en het cytochroom bc1-complex wordt bevorderd (11, 13-15). De paarse fototrofe plant Rhodopseudomonas (Rps.) is een modelorganisme dat inzicht kan geven in de energie- en elektronenoverdracht die fotosynthese ondersteunt. De eerste kristalstructuur van Rps. Het model van het palustris RC-LH1-complex bestaat uit RC, omgeven door 15 heterodimere LH1-lussen, die worden onderbroken door een onbekend eiwit genaamd "Proteïne W" (14). Proteïne W werd later geïdentificeerd als RPA4402, een ongekarakteriseerd eiwit van 10,5 kDa met drie voorspelde transmembraanhelices (TMH) (16). We stellen voor om het gen rpa4402, dat codeert voor proteïne W, te hernoemen naar pufW, om consistent te zijn met de nomenclatuur die wordt gebruikt voor genen die coderen voor RC-L, M (pufL, pufM) en LH1α, β (pufA, pufB) subunits. Interessant is dat proteïne W slechts in ongeveer 10% van RC-LH1 voorkomt, wat aantoont dat Rps. palustris twee verschillende RC-LH1-complexen produceert. Hier rapporteren we de cryo-EM-structuren met hoge resolutie van twee kerncomplexen: één met proteïne W en 14 αβ-heterodimeren, en de andere zonder proteïne W en een gesloten LH1-lus met 16 heterodimeren. Onze structuur vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts in het begrip van het RC-LH1-complex van Rps. palustris, omdat we de homogene populatie van elke variant hebben geanalyseerd en voldoende resolutie hebben om elk peptide en de gebonden pigmenten, evenals verwante lipiden en chinonen, duidelijk te identificeren. De vergelijking van deze structuren laat zien dat de drie TMH-eiwitten-W, die tot nu toe in geen enkel ander RC-LH1-complex zijn aangetroffen, een chinonkanaal genereren om de chinon/chinolon-uitwisseling te versnellen. Een aantal geconserveerde lipide- en chinonbindingsplaatsen zijn geïdentificeerd, en we hebben een nieuwe conformationele verandering onthuld na de combinatie van chinon en RC, die mogelijk geschikt is voor het fotosysteem II (PSII) RC van zuurstofrijke fototrofe organismen. Onze bevindingen bieden nieuwe inzichten in de kinetiek van chinon/chinolon-binding en -uitwisseling in het RC-LH1-kerncomplex van paarse fototrofe bacteriën.
Om een ​​gedetailleerde studie van de twee complexen die in Rps. palustris voorkomen te vergemakkelijken, isoleren we elk RC-LH1 met behulp van biochemische methoden. Het eiwit W-deficiënte complex (hierna aangeduid als ΔpufW) werd gezuiverd uit de stam die het pufW-gen mist (16), en er kan slechts één RC-LH1-complex worden geproduceerd. Het eiwit W-bevattende complex wordt geproduceerd door een stam. Het eiwit W van deze stam is gemodificeerd met een 10x His-tag aan de C-terminus, zodat het eiwit W-bevattende complex effectief kan worden gecombineerd met het meeste eiwit W-deficiënte complex door middel van metaalimmobilisatie. Het complex wordt effectief gescheiden (16) Affiniteitschromatografie (IMAC).
Zoals weergegeven in Figuur 1, bevatten beide complexen een RC met drie subeenheden (RC-L, RC-M en RC-H) omgeven door een LH1-antenne. De structuur van het complex zonder proteïne-W (2,80 Å) toont 16 αβ-heterodimeren, die een gesloten LH1-lus vormen die RC volledig omringt; hierna aangeduid als het RC-LH116-complex. De structuur van het complex met proteïne-W (2,65 Å) heeft een LH1 met 14 heterodimeren, onderbroken door proteïne-W; hierna aangeduid als RC-LH114-W.
(A en B) Oppervlakteweergave van de verbinding. (C en D) Gebonden pigmenten weergegeven in staafjes. (E en F) De complexen die vanaf het cytoplasmatische oppervlak worden waargenomen, hebben de peptiden en LH1-subeenheden weergegeven in cartoons en zijn met de klok mee genummerd vanaf de proteïne-W-opening [conform de nummering van Rba. sphaeroides-complex (13)]. Voor LH1-α is de kleur van de proteïnesubeenheid geel; voor LH1-β is de kleur van de proteïnesubeenheid blauw; voor proteïne-W is het proteïne rood; voor RC-H is het cyaan; voor RC-L is het oranje; voor RC-M is het magenta. Cofactoren worden weergegeven door staafjes, groen staat voor BChl- en BPh a-moleculen, paars voor carotenoïden en geel voor UQ10-moleculen. (G en H) Vergrote weergave van de proteïne-W-opening in het equivalente gebied van het RC-LH114-W-complex (G) en het RC-LH116-complex (H). Cofactoren worden weergegeven als ruimteopvulling, gechelateerd chinon wordt in blauw weergegeven. De proteïne-W-opening is gemarkeerd met een blauwe stippellijn in (G), en de kleine openingen waar chinon/chinolol diffundeert op de LH116-ring zijn gemarkeerd met een zwarte stippellijn in (H).
Figuur 1 (A en B) toont de RC omgeven door open of gesloten arrays van LH1αβ-heterodimeren, die elk twee BChl en één carotenoïde binden (Figuur 1, C en D). Eerdere studies hebben aangetoond dat Rps het LH1-complex is. In de biosynthetische route van spirulina-xanthine bevatten deze soorten gemengde populaties van carotenoïden (17). Spiropyrroxanthine is echter de dominante carotenoïde en de dichtheid ervan is bevredigend. Daarom hebben we ervoor gekozen om spiroxanthine te modelleren op alle LH1-bindingsplaatsen. De alfa- en bèta-polypeptiden zijn enkelvoudige TMH's met korte membraan-buitenregio's (Figuur 1, A, B, E en F). Hoewel de dichtheid van 17 residuen aan de C-terminus niet werd waargenomen, werd het alfa-polypeptide in beide complexen gesplitst van Met1 tot Ala46. Het β-polypeptide werd gereduceerd van Gly4 tot Tyr52 in RC-LH116 en van Ser5 tot Tyr52 in RC-LH114-W. Er werd geen dichtheid van 3 of 4 N-terminale of 13 C-terminale residuen waargenomen (Figuur S1). Massaspectrometrische analyse van het gemengde RC-LH1-complex, bereid uit de wildtype-stam, toonde aan dat het ontbrekende gebied het gevolg was van heterologe splitsing van deze peptiden (Figuur S1 en S2). De N-terminale formylering van α-Met1 werd ook waargenomen (f). De analyse toonde aan dat het α-peptide bestaat uit de residuen fMet1 tot Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 en het β-peptide uit de residuen Ser2 tot Ala53, wat goed overeenkomt met de EM-dichtheidskaart bij lage temperatuur.
De coördinatie van α-His29 en β-His36 zorgt ervoor dat BChls tegenover elkaar komen te staan; elk αβ-heterodimeer assembleert met zijn buren om een ​​open lus (RC-LH114-W) of een gesloten lus (RC-LH116) te vormen rond de RC-exciton-gekoppelde pigmentarray (Figuur 1, C en D). Vergeleken met de 877 nm-band van RC-LH114-W is de roodverschuiving van de absorptie bij 880 nm van RC-LH116 3 nm (Figuur 2A). Het circulaire dichroïsmespectrum is echter vrijwel hetzelfde (Figuur 2B), wat aangeeft dat, hoewel er een duidelijk verschil is tussen open en gesloten lussen, de lokale omgeving van BChls zeer vergelijkbaar is. De roodverschuiving van de absorptie kan het gevolg zijn van verminderde thermische beweging en verhoogde stabiliteit in de gesloten lus (18, 19), de verandering in pigmentkoppeling veroorzaakt door de gesloten lus (20, 21), of een combinatie van deze twee effecten (11).
(A) Ultraviolet/zichtbaar/nabij-infrarood absorptiespectrum, waarvan de pieken zijn gemarkeerd met hun corresponderende pigmenten en genormaliseerd ten opzichte van de BPh-piek bij 775 nm. (B) Circulair dichroïsmespectrum genormaliseerd ten opzichte van de BChl-absorptie bij 805 nm. (C en D) Geselecteerde ΔA-spectra uit de tijdsafhankelijke absorptiespectra van het RC-LH114-W-complex (C) en het RC-LH116-complex (D). Voor een betere vergelijkbaarheid zijn alle spectra genormaliseerd ten opzichte van ∆A van −A bij 0,2 ps. (E) De snelheid van cytochroom c2-oxidatie na bestraling in aanwezigheid van verschillende concentraties UQ2 (zie figuur S8 voor de ruwe data). (F) In cellen gekweekt onder lage, gemiddelde of hoge lichtintensiteit (respectievelijk 10, 30 of 300 μM m-2 s-1), de verhouding van de proteïne W- en RC-L-subeenheden in het gezuiverde complex en het gescheiden membraan. Bepaal het proteïneniveau door middel van SDS-polyacrylamidegelelektroforese en immuunassay (zie figuur S9 voor ruwe data). Bepaal de verhouding ten opzichte van het gezuiverde RC-LH114-W-complex. De stoichiometrische verhouding van RC-L tot proteïne W van het complex is 1:1.
De BChls op positie 1 in de vervormde αβ14-lus van RC-LH114-W (Figuur 1, A, C en E) bevinden zich 6,8 Å dichter bij de primaire donor (P) van RC dan de equivalente BChls in RC-LH116 (Figuur 1, B, D en F, en Figuur S3). De transiënte absorptiekinetiek van de twee complexen laat echter zien dat voor RC-LH114-W en RC-LH116 de tijdconstanten voor de overdracht van excitatie-energie van LH1 naar RC respectievelijk 40 ± 4 en 44 ± 3 ps bedragen (Figuur 2, C en D, Figuur S4 en Tabel S2). Er is ook geen significant verschil in elektronenoverdracht binnen RC (Figuur S5 en bijbehorende aanvullende tekst). We vermoeden dat de nauwe overeenkomst in de energieoverdrachtstijd tussen LH1 en RC-P te wijten is aan de vergelijkbare afstand, hoek en potentiële energie van de meeste BChls in de twee LH1-lussen. Het lijkt erop dat het verkennen van het LH1-energiepatroon om de minimale afstand te bereiken niet sneller is dan directe energieoverdracht van suboptimale locaties naar RC. De open-lus LH1 in RC-LH114-W ondergaat mogelijk ook een verwaarloosbare thermische beweging bij lage temperaturen voor structurele analyse, en er is een langere αβ14-ringconformatie bij kamertemperatuur als gevolg van de pigmentatieafstand van βBChls op de positie van RC 1.
Het RC-LH116-complex bevat 32 BChls en 16 carotenoïden, en de algehele structuur ervan is hetzelfde als die verkregen uit Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stam (PDB ID 7C9R) (12) en groene algen (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Na uitlijning werden slechts kleine afwijkingen in de posities van αβ-heterodimeren waargenomen, met name 1-5, 15 en 16 (Figuur S6). De aanwezigheid van proteïne-W heeft een significante invloed op de structuur van LH1. De drie TMH's zijn verbonden door korte lussen, waarbij de N-terminale zich aan de lumenzijde van het complex bevindt en de C-terminale aan de cytoplasmatische zijde (Figuren 1A en 3, A tot en met D). Proteïne-W is grotendeels hydrofoob (Figuur 3B), en TMH2 en TMH3 interageren met LH1αβ-14 om een ​​transmembraanoppervlak te vormen (Figuur 3, B en E tot G). Het grensvlak bestaat voornamelijk uit Phe-, Leu- en Val-residuen in het transmembraangebied. Deze residuen zijn gestapeld met hydrofobe aminozuren en αβ-14-pigmenten. Ook enkele polaire residuen dragen bij aan de interactie, waaronder de waterstofbrug tussen W-Thr68 en β-Trp42 op het oppervlak van de complexholte (Figuur 3, F en G). Aan het oppervlak van het cytoplasma bevindt Gln34 zich naast de ketogroep van αβ-14-carotenoïden. Bovendien werd het n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM)-molecuul waargenomen, waarvan de hydrofobe staart zich uitstrekt tot het grensvlak tussen proteïne-W en αβ-14, terwijl de lipide staart zich mogelijk in het lichaam bevindt. We merkten ook op dat de C-terminale resolutieregio's van proteïne W en RCH zeer dicht bij elkaar liggen, maar niet binnen het bereik van specifieke interacties (Figuur 1, A en E). Er kunnen echter interacties plaatsvinden in de niet-opgeloste C-terminale aminozuren van deze twee proteïnen, wat een mechanisme zou kunnen bieden voor de rekrutering van proteïne W tijdens de assemblage van het RC-LH114-W-complex.
(A) Proteïne-W, dat in cartoonvorm tegenover het grensvlak met LH1αβ14 staat, heeft een staafvormige zijketen (rood), weergegeven in een deel van het elektrostatische potentiaaldiagram (transparant grijs oppervlak met een contourniveau van 0,13). (B) Proteïne-W weergegeven door een hydrofoob gekleurd oppervlak. Polaire en geladen gebieden worden weergegeven in cyaan, hydrofobe gebieden in wit en sterk hydrofobe gebieden in oranje. (C en D) Proteïne-W weergegeven in cartoonvorm, met dezelfde oriëntatie als in (A) (C) en 180° gedraaid (D). Afhankelijk van de positie in de sequentie hebben de onderscheidbare residuen een regenboogkleurenschema, waarbij de N-terminus blauw en de C-terminus rood is. (E) Proteïne-W in dezelfde weergave als in (A), waarbij de residuen op het grensvlak van proteïne-W:LH1 worden weergegeven door staven met aangehechte markeringen. (F) Proteïne-W is 90° gedraaid ten opzichte van (E) en LH1αβ14 in de cartoonweergave, en ten opzichte van de grensvlakresiduen in de staafdiagramweergave. De overhangende residuen van het bèta-polypeptide zijn gelabeld. De cofactor wordt weergegeven als een staaf met dezelfde kleur als Figuur 1, het ontlede β-DDM is grijs weergegeven en de zuurstof is rood weergegeven. (G) De weergave in (F) is 180° gedraaid, met de prominente residuen van het gelabelde alfa-polypeptide.
Proteïne-W vervangt een αβ-heterodimeer (de 15e in Figuur 1F), waardoor lusvorming wordt voorkomen en de eerste drie αβ-heterodimeren kantelen. Er werd waargenomen dat de maximale hellingshoek van het eerste αβ-1-heterodimeer ten opzichte van de filmnormaal 25° tot 29° bedroeg (Figuur 1, A en E), die werd gevormd door de helling van 2° tot 8° van αβ-1 in RC A scherp contrast-LH116 (Figuur 1, B en F). De tweede en derde heterodimeren hellen respectievelijk 12° tot 22° en 5° tot 10°. Door de sterische hindering van RC omvat de kanteling van αβ-1 niet het tweede paar αβ (wat overeenkomt met de 16e αβ in Figuur 1F), waardoor een duidelijke opening in de LH1-ring ontstaat (Figuur 1, A en E). Door het ontbreken van twee αβ-heterodimeren, gepaard gaande met het verlies van vier BChl en twee carotenoïden, binden geen van de carotenoïden aan de gedraaide αβ-1-subeenheid, wat resulteert in een LH114-W-ring die 13 carotenoïden (Vegetable) en 28 BChls bevat. De lokale resolutieschattingen van de twee complexen in de αβ1 tot 7-regio's zijn lager dan die van de rest van de LH1-lus, wat mogelijk de inherente plasticiteit van de LH1-subeenheid naast de RC QB-site weerspiegelt (Figuur 4).
De afbeeldingen van RC-LH114-W (A en B) en RC-LH116 (C en D) zijn weergegeven vanuit hetzelfde bovenaanzicht/zijaanzicht (A en B) (A en C) en holteoppervlak als in Fig. 1. (B en D). De gekleurde legenda's zijn rechts weergegeven.
Het enige andere karakteristieke kerncomplex met een stoichiometrische verhouding van 1:14 is het RC-LH1-PufX-dimeer van Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Proteïne W en PufX vertonen echter geen duidelijke homologie en hebben een significante invloed op hun respectievelijke LH1-structuren. PufX is een enkel TMH met een N-terminaal cytoplasmatisch domein dat interageert met de cytoplasmatische zijde van de RC-H-subeenheid (13) op een positie die overeenkomt met Rps. palustris LH116αβ-16. PufX creëert een kanaal voor de chinon/chinolon-uitwisseling tussen RC-LH1 en het cytochroom bcl-complex en is aanwezig in alle kerncomplexen van Rba. sphaeroides (13). Hoewel de monomeer-monomeer-interface zich in Rba. Het sphaeroides RC-LH1-PufX-dimeer bevindt zich op de bindingspositie van proteïne W in RC-LH114-W, en de opening die door PufX en proteïne W wordt geïnduceerd, bevindt zich op een equivalente positie (Figuur S7A). De opening in RC-LH114-W is ook uitgelijnd met het hypothetische chinonkanaal (8) van Pseudomonas rosea LH1, dat wordt gevormd door peptiden die niet verwant zijn aan proteïne W of PufX (Figuur S7B). Bovendien bevindt het chinonkanaal in Blc. The emerald green LH1, gevormd door het uitsluiten van één γ-subeenheid (7), zich op een vergelijkbare positie (Figuur S7C). Hoewel ze worden gemedieerd door verschillende proteïnen, lijkt het verschijnen van deze chinon-/chinololkanalen op een gemeenschappelijke positie in het RC-LH1-complex een voorbeeld te zijn van convergente evolutie, wat erop wijst dat de opening die door proteïne W wordt gecreëerd, mogelijk als een chinonkanaal fungeert.
De opening in de LH114-W-lus maakt de vorming mogelijk van een continu membraangebied tussen de interne ruimte van het RC-LH114-W-complex en het bulkmembraan (Figuur 1G), in plaats van de twee domeinen te verbinden via een eiwitporie zoals bij eiwitten. Het RC-LH116-complex is vergelijkbaar met een gesloten Tch. Naaldvormig complex (22) (Figuur 1H). Omdat de diffusie van chinon door het membraan sneller is dan de diffusie door het smalle eiwitkanaal, kan de open LH114-W-lus een snellere RC-omzetting mogelijk maken dan de gesloten LH116-lus, en kan de diffusie van chinon in de RC meer beperkt zijn. Om te testen of proteïne W de omzetting van chinonen door RC beïnvloedt, hebben we een cytochroomoxidatietest uitgevoerd met een bepaalde concentratie ubiquinon 2 (UQ2) (een analoog van natuurlijk UQ10 met een kortere isopreenstaart) (Figuur 2E). Hoewel de aanwezigheid van gechelateerd chinon de nauwkeurige bepaling van de schijnbare Michaelis-constante bemoeilijkt (RC-LH114-W en RC-LH116 zijn geschikt voor respectievelijk 0,2±0,1 μM en 0,5±0,2 μM), is de maximale reactiesnelheid van RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) 28±5% hoger dan die van RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
We schatten aanvankelijk dat proteïne-W aanwezig is in ongeveer 10% van het kerncomplex (16); hier zijn de bezettingspercentages van cellen die groeien bij weinig licht, gemiddeld licht en veel licht respectievelijk 15±0,6%, 11±1% en 0,9±0,5% (Figuur 2F). Kwantitatieve vergelijking van massaspectrometrie toonde aan dat de toevoeging van een histidine-tag de relatieve abundantie van proteïne-W niet verminderde in vergelijking met wildtype stammen (P = 0,59), dus deze niveaus zijn geen artefact van gemodificeerd proteïne-W (Figuur S10). Deze lage bezetting van proteïne-W in het RC-LH1-complex kan er echter voor zorgen dat sommige RC's met een versnelde snelheid omklappen, waardoor de langzamere chinon/chinolon-uitwisseling in het RC-LH116-complex wordt afgezwakt. We merkten op dat de hoge bezettingsgraad van het licht niet strookt met de recente transcriptomics-gegevens, die aangeven dat de expressie van het pufW-gen toeneemt onder sterk licht (Figuur S11) (23). Het verschil tussen de transcriptie van pufW en de incorporatie van proteïne-W in het RC-LH1-complex is verwarrend en kan de complexe regulatie van het eiwit weerspiegelen.
In RC-LH114-W zijn 6 cardiolipine (CDL), 7 fosfatidylcholine (POPC), 1 fosfatidylglycerol (POPG) en 29 β-DDM-moleculen aanwezig en gemodelleerd in RC-LH116 (Figuur 5, A en B). In deze twee structuren bevindt CDL zich vrijwel uitsluitend aan de cytoplasmatische zijde van het complex, terwijl POPC, POPG en β-DDM zich voornamelijk aan de luminale zijde bevinden. Twee lipide- en detergentmoleculen werden geïsoleerd in het αβ-1 tot αβ-6-gebied van het RC-LH114-W-complex (Figuur 5A), en vijf werden geïsoleerd in het overeenkomstige gebied van RC-LH116 (Figuur 5B). Aan de andere kant van het complex werden meer lipiden gevonden, voornamelijk CDL, geaccumuleerd tussen RC en αβ-7 tot αβ-13 (Figuur 5, A en B). Andere structureel opgeloste lipiden en detergenten bevinden zich buiten de LH1-ring, en goed opgeloste acylketens strekken zich uit tussen LH1-subeenheden, voorlopig aangeduid als β-DDM in RC-LH114-W, en gedefinieerd als β-DDM in RC A mengsel van β-DDM en POPC-LH116. De vergelijkbare posities van chelerende lipiden en detergenten in onze structuur geven aan dat het fysiologisch relevante bindingsplaatsen zijn (Figuur S12A). De posities van equivalente moleculen in Tch vertonen ook een goede consistentie. Gentle en Trv. Stam 970 RC-LH1s (Figuur S12, B tot E) (9, 12) en de waterstofbrugvormende residuen van de lipidekopgroep vertoonden een redelijk goede conservering in de sequentie-uitlijning (Figuur S13), wat erop wijst dat geconserveerde CDL die bindt aan RC (24), deze plaatsen mogelijk geconserveerd zijn in het RC-LH1-complex.
(A en B) De peptiden RC-LH114-W (A) en RC-LH116 (B) worden weergegeven als cartoons, en de pigmenten als staafjes, volgens het kleurenschema in Figuur 1. Lipiden worden in rood weergegeven en detergenten in grijs. UQ gebonden aan de RC QA- en QB-sites is geel, terwijl geïsoleerd UQ blauw is. (C en D) Dezelfde weergaven als (A) en (B), maar zonder de lipiden. (E tot en met G) Vergrote weergave van Q1 (E), Q2 (F) en Q3 (G) van RC-LH116, met zijketens die elkaar beïnvloeden. De waterstofbruggen worden weergegeven als zwarte stippellijnen.
In RC-LH116 zijn zowel RC QA als QB UQ, die deelnemen aan de elektronenoverdracht in het ladingsscheidingsproces, afgebroken in hun bindingsplaatsen. In RC-LH114-W is QB-chinon echter niet opgelost en zal hieronder in detail worden besproken. Naast QA- en QB-chinonen zijn in de RC-LH114-W-structuur twee gechelateerde UQ-moleculen (gelegen tussen de RC- en LH1-ringen) toegewezen op basis van hun goed opgeloste kopgroepen (respectievelijk gelegen in Q1 en Q2) (Figuur 5C). Aan Q1 zijn twee isopreen-eenheden toegewezen en de dichtheidskaart toont de volledige 10 isopreenstaarten van Q2. In de structuur van RC-LH116 zijn drie gechelateerde UQ10-moleculen (Q1 tot en met Q3, Figuur 5D) opgelost en alle moleculen hebben een duidelijke dichtheid over de gehele staart (Figuur 5, D tot en met G). In de twee structuren vertonen de posities van de chinonkopgroepen van Q1 en Q2 een uitstekende consistentie (Figuur S12F), en ze interageren alleen met RC. Q1 bevindt zich aan de ingang van de W-opening van RC-LH114-W (Figuur 1G en 5, C, D en E), en Q2 bevindt zich in de buurt van de QB-bindingsplaats (Figuur 5, C, D en F). De geconserveerde residuen L-Trp143 en L-Trp269 liggen zeer dicht bij Q1 en Q2 en bieden potentiële π-stapelingsinteracties (Figuur 5, E en F, en Figuur S12). L-Gln88, op 3,0 Å afstand van het distale zuurstofatoom van Q1, zorgt voor een sterke waterstofbrug (Figuur 5E); dit residu is geconserveerd in alle RC's, behalve in de meest verre verwantschap (Figuur S13). L-Ser91 is conservatief gesubstitueerd voor Thr in de meeste andere RC's (Figuur S13), bevindt zich op 3,8 Ångström van het methylzuurstofatoom van Q1 en kan zwakke waterstofbruggen vormen (Figuur 5E). Q3 lijkt geen specifieke interactie te hebben, maar bevindt zich in het hydrofobe gebied tussen de RC-M-subeenheid en de LH1-α-subeenheid 5 tot 6 (Figuur 5, D en G). Q1, Q2 en Q3 of nabijgelegen gechelateerde chinonen zijn ook opgelost in Tch. Gentle, Trv. Stam 970 en Blc. De irisstructuur (9, 10, 12) wijst op een geconserveerde hulp-chinonbindingsplaats in het RC-LH1-complex (Figuur S12G). De vijf ontlede UQ's in RC-LH116 komen goed overeen met de 5,8±0,7 van elk complex, bepaald met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC), terwijl de drie ontlede UQ's in RC-LH114-W lager zijn dan de gemeten waarde van 6,2±0,3 (Fig. S14), wat erop wijst dat er onopgeloste UQ-moleculen in de structuur aanwezig zijn.
De pseudo-symmetrische L- en M-polypeptiden bevatten elk vijf TMH's en vormen een heterodimeer dat één BChl-dimeer, twee BChl-monomeren, twee bacteriofaag (BPh)-monomeren, één niet-heemijzer en één of twee UQ10-moleculen combineert. Door de aanwezigheid van waterstofbruggen op de terminale ketongroep en de bekende accumulatie ervan in Rps worden carotenoïden opgenomen in de M-subeenheid, die cis-3,4-dehydroorhodopine wordt genoemd. Soort (25). Het buitenmembraandomein van RC-H is aan het membraan verankerd door een enkele TMH. De algehele RC-structuur is vergelijkbaar met de RC met drie subeenheden van verwante soorten (zoals Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). De macrocycli van BChl en BPh, de carotenoïde-ruggengraat en het niet-heemijzer overlappen binnen het resolutiebereik van deze structuren, evenals de UQ10-kopgroep op de QA-plaats en het QB-chinon op RC-LH116 (Figuur S15).
De beschikbaarheid van twee RC-structuren met verschillende bezettingsgraden van de QB-site biedt een nieuwe mogelijkheid om de consistente conformationele veranderingen te onderzoeken die gepaard gaan met de binding van QB-chinon. In het RC-LH116-complex bevindt QB-chinon zich in de volledig gebonden "proximale" positie (26), maar de scheiding van RC-LH114-W bevat geen QB-chinon. Er is geen QB-chinon in RC-LH114-W, wat verrassend is omdat het complex actief is, actiever zelfs dan het RC-LH116-complex met structureel opgelost QB-chinon. Hoewel de twee LH1-ringen ongeveer zes chinonen cheleren, zijn er vijf structureel opgelost in de gesloten RC-LH116-ring, terwijl er slechts drie structureel beperkt zijn in de open RC-LH114-W-ring. Deze toegenomen structurele wanorde kan een weerspiegeling zijn van de snellere vervanging van de QB-sites in RC-LH114-W, snellere chinonkinetiek in het complex en een grotere kans op het passeren van de LH1-lus. Wij suggereren dat het ontbreken van UQ in de RC QB-site van RC-LH114-W het gevolg kan zijn van een complexer en actiever complex, en dat de QB-site van RC-LH114-W onmiddellijk is bevroren in de UQ-omzetting. De specifieke fase (waarbij de toegang tot de QB-site is afgesloten) weerspiegelt de conformatie van deze activiteit.
Zonder QB vindt de bijbehorende rotatie van L-Phe217 plaats naar een positie die onverenigbaar is met UQ10-binding, omdat dit een ruimtelijke botsing met de eerste isopreen-eenheid van de staart zal veroorzaken (Figuur 6A). Daarnaast zijn de belangrijkste conformationele veranderingen duidelijk zichtbaar, met name in helix de (korte helix in de lus tussen TMH D en E), waarbij L-Phe217 verschuift naar de QB-bindingsholte, en de rotatie van L-Tyr223 (Figuur 6A) om de waterstofbrug met het M-Asp45-framework te verbreken en de ingang van de QB-bindingsplaats te sluiten (Figuur 6B). Helix de draait om zijn basis, de Cα van L-Ser209 verschuift met 0,33 Å, terwijl de Cα van L-Val221 verschuift met 3,52 Å. Er zijn geen waarneembare veranderingen in TMH D en E, die in beide structuren over elkaar heen te leggen zijn (Figuur 6A). Voor zover wij weten, is dit de eerste structuur in het natuurlijke RC die de QB-site sluit. Een vergelijking met de complete (QB-gebonden) structuur laat zien dat er, voordat het chinon wordt gereduceerd, een conformationele verandering nodig is om het in het chinon te laten doordringen. L-Phe217 roteert om een ​​π-stapelingsinteractie met de chinonkopgroep te vormen, en de helix verschuift naar buiten, waardoor het skelet van L-Gly222 en de zijketen van L-Tyr223 een waterstofbrugnetwerk met een stabiele waterstofbrugstructuur kunnen vormen (Figuur 6, A en C).
(A) Overlappende cartoon van hologram (L-keten, oranje/M-keten, magenta) en apo-structuur (grijs), waarin de belangrijkste residuen worden weergegeven in de vorm van een staafvormige representatie. UQ10 wordt weergegeven door een gele balk. De stippellijn geeft de waterstofbruggen aan die in de gehele structuur worden gevormd. (B en C) De oppervlakterepresentatie van het apolipoproteïne en de gehele ringstructuur, waarbij de zijketenzuurstof van L-Phe217 in blauw en L-Tyr223 in rood is gemarkeerd. De L-subeenheid is oranje; de ​​M- en H-subeenheden zijn niet gekleurd. (D en E) Apolipoproteïne (D) en gehele (E) RC QB-sites [kleur volgens (A) respectievelijk] en Thermophilus thermophilus PSII (groen, blauw met plastic chinon; PDB ID: 3WU2) Uitlijning (58).
Verrassend genoeg zijn, hoewel er verschillende structuren van QB-deficiënte RC's zonder LH1 beschikbaar zijn, de in deze studie waargenomen conformationele veranderingen niet eerder gerapporteerd. Dit omvat de QB-depletiestructuur van Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) en Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), die alle vrijwel identiek zijn aan hun algehele QB-structuur. Nauwkeurige inspectie van 3PRC onthulde dat LDAO (lauryldimethylamineoxide) detergentmoleculen binden aan de ingang van de QB-positie, wat de herschikking naar een gesloten conformatie kan voorkomen. Hoewel LDAO niet op dezelfde positie ontleedt in 1EYS of 1OGV, worden deze RC's bereid met hetzelfde detergent en kunnen daarom hetzelfde effect hebben. De kristalstructuur van Rba. Sphaeroides RC, gecokristalliseerd met cytochroom c2 (PDB ID: 1L9B), lijkt ook een gesloten QB-site te hebben. In dit geval neemt het N-terminale gebied van het RC-M-polypeptide (dat via de waterstofbrug van het tyrosineresidu op de Q-helix interactie heeft met de QB-bindingsplaats) echter een onnatuurlijke conformatie aan, en de conformationele verandering van QB wordt niet verder onderzocht (30). Geruststellend is dat we dit soort vervorming van het M-polypeptide niet hebben gezien in de RC-LH114-W-structuur, die vrijwel identiek is aan het N-terminale gebied van RC-LH116 RC. Het is ook belangrijk op te merken dat na de verwijdering van de op detergent gebaseerde LH1-antenne de apolipoproteïne-RC's in de PDB werden opgelost, waardoor de interne chinonpools en lipiden in de ruimte tussen de RC en het binnenoppervlak van de omringende LH1-ring werden geëlimineerd (31, 32). RC blijft functioneel omdat het alle cofactoren behoudt, met uitzondering van het afbreekbare QB-chinon, dat minder stabiel is en vaak verloren gaat tijdens het bereidingsproces (33). Bovendien is bekend dat de verwijdering van LH1 en natuurlijke cyclische lipiden uit RC een impact kan hebben op functies, zoals de verkorte levensduur van de ladingsgescheiden P+QB-toestand (31, 34, 35). Daarom speculeren we dat het bestaan ​​van de lokale LH1-ring rondom de RC de "gesloten" QB-plaats in stand kan houden, waardoor de lokale omgeving nabij de QB behouden blijft.
Hoewel apolipoproteïne (zonder QB-chinon) en de complete structuur slechts twee momentopnamen van de omzetting van de QB-site vertegenwoordigen, in plaats van een reeks gebeurtenissen, zijn er aanwijzingen dat de binding kan worden gereguleerd om herbinding door hydrochinon te voorkomen en zo substraatremming te remmen. De interactie van chinolol en chinon nabij de QB-site van apolipoproteïne kan anders zijn, wat leidt tot afstoting door RC. Er wordt al lang verondersteld dat conformationele veranderingen een rol spelen bij de binding en reductie van chinonen. Het vermogen van bevroren RC's om chinonen te reduceren na donkeradaptatie is verminderd (36); röntgenkristallografie toont aan dat deze schade te wijten is aan QB-chinonen die vastzitten in een "distale" conformatie op ongeveer 4,5 Å van de actieve proximale positie (26), 37). Wij suggereren dat deze distale bindingsconformatie een momentopname is van de tussenliggende toestand tussen apolipoproteïne en de volledige ringstructuur, die volgt op de initiële interactie met chinon en de opening van de QB-site.
Het type II RC dat voorkomt in het PSII-complex van bepaalde fototrofe bacteriën en cyanobacteriën, algen en planten vertoont structurele en functionele conservering (38). De structurele uitlijning weergegeven in Figuur 6 (D en E) benadrukt de gelijkenis tussen PSII RC's en de QB-site van het bacteriële RC-complex. Deze vergelijking is al lange tijd een model voor het bestuderen van de nauw verwante systemen van chinonbinding en -reductie. Eerdere publicaties suggereerden dat conformationele veranderingen gepaard gaan met PSII-reductie van chinonen (39, 40). Gezien de evolutionaire conservering van RC, zou dit voorheen niet waargenomen bindingsmechanisme dus ook van toepassing kunnen zijn op de QB-site van PSII RC in zuurstofrijke fototrofe planten.
Rps ΔpufW (ongelabelde pufW-deletie) en PufW-His (C-terminaal 10x His-gelabeld proteïne-W, tot expressie gebracht vanuit de natuurlijke pufW-locus) stammen. palustris CGA009 werd beschreven in ons eerdere werk (16). Deze stammen en de isogene wildtype ouderstam werden uit de vriezer gehaald door een klein aantal cellen uit te strijken op een PYE-agarplaat (elk 5 g liter -1) (bewaard in LB bij -80 °C, met 50% (w/v) glycerol), proteïne, gistextract en succinaat [1,5% (w/v)]. De plaat werd een nacht in het donker bij kamertemperatuur onder anaerobe omstandigheden geïncubeerd en vervolgens gedurende 3 tot 5 dagen belicht met wit licht (~50 μmolm-2 s-1) van OSRAM 116-W halogeenlampen (RS Components, VK) totdat een enkele kolonie verscheen. Een enkele kolonie werd gebruikt om 10 ml M22+ medium (41) te enten, aangevuld met 0,1% (w/v) casaminozuren (hierna M22 genoemd). De kweek werd gedurende 48 uur in het donker bij 34 °C onder lage zuurstofomstandigheden en met schudden op 180 rpm gekweekt. Vervolgens werd 70 ml van de kweek gedurende 24 uur onder dezelfde omstandigheden geënt. Een semi-aërobe kweek met een volume van 1 ml werd gebruikt om 30 ml M22 medium te enten in een transparante glazen fles met schroefdop van 30 ml en gedurende 48 uur bestraald met roeren (~50 μmol m⁻² s⁻¹) met een steriele magnetische roerstaaf. Vervolgens werd 30 ml van de kweek geënt met ongeveer 1 liter kweek onder dezelfde omstandigheden. Deze geënt kweek werd vervolgens gebruikt om ongeveer 9 liter kweek te enten, die gedurende 72 uur werd belicht met een lichtintensiteit van ~200 μmolm-2 s-1. De cellen werden geoogst door centrifugatie bij 7132 RCF gedurende 30 minuten, geresuspendeerd in ongeveer 10 ml 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) en bewaard bij -20 °C tot gebruik.
Voeg na het ontdooien enkele kristallen van deoxyribonuclease I (Merck, VK), lysozym (Merck, VK) en twee Roche holoenzym protease-remmertabletten (Merck, VK) toe aan de geresuspendeerde cellen. In een drukvat van 20.000 psi (Aminco, VS) werden de cellen 8 tot 12 keer verstoord. Nadat intacte cellen en onoplosbaar materiaal waren verwijderd door centrifugatie bij 18.500 RCF gedurende 15 minuten bij 4°C, werd het membraan uit het gepigmenteerde lysaat geprecipiteerd door centrifugatie bij 113.000 RCF gedurende 2 uur bij 43.000°C. Gooi de oplosbare fractie weg en resuspendeer het gekleurde membraan in 100 tot 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en homogeniseer totdat er geen zichtbare aggregaten meer zijn. Het gesuspendeerde membraan werd gedurende 1 uur in het donker bij 4°C onder zacht roeren geïncubeerd in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) met 2% (w/v) β-DDM. Vervolgens werd het membraan gedurende 1 uur bij 70°C gecentrifugeerd om 150.000 RCF op te lossen en resterende onoplosbare bestanddelen te verwijderen.
Het oplosbaar makende membraan van de ΔpufW-stam werd aangebracht op een 50 ml DEAE Sepharose ionenwisselingskolom met drie kolomvolumes (CV) bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8,0) met 0,03% (w/v) β-DDM]. De kolom werd gewassen met twee CV bindingsbuffers en vervolgens met twee bindingsbuffers die 50 mM NaCl bevatten. Het RC-LH116-complex werd geëlueerd met een lineaire gradiënt van 150 tot 300 mM NaCl (in bindingsbuffer) op 1,75 CV, en het resterende bindingscomplex werd geëlueerd met een bindingsbuffer die 300 mM NaCl bevatte op 0,5 CV. Verzamel het absorptiespectrum tussen 250 en 1000 nm, behoud de fractie met een absorptieverhouding (A880/A280) groter dan 1 bij 880 tot 280 nm, verdun deze tweemaal in de bindingsbuffer en herhaal dezelfde procedure op de DEAE-kolom voor zuivering. Verdun de fracties met een A880/A280-verhouding hoger dan 1,7 en een A880/A805-verhouding hoger dan 3,0, voer de derde ronde ionenuitwisseling uit en behoud de fracties met een A880/A280-verhouding hoger dan 2,2 en een A880/A805-verhouding hoger dan 5,0. Het gedeeltelijk gezuiverde complex werd geconcentreerd tot ~2 ml in een Amicon centrifugaalfilter met een moleculair gewicht afsnijding (MWCO) van 100.000 (Merck, VK) en geladen op een Superdex 200 16/600 size exclusion kolom (GE Healthcare, VS) met 200 mM NaCl-buffer. Vervolgens werd geëlueerd in dezelfde buffer bij 1,5 CV. Verzamel de absorptiespectra van de size exclusion fractie en concentreer de absorptiespectra met A880/A280-verhoudingen boven 2,4 en A880/A805-verhoudingen boven 5,8 tot 100 A880. Gebruik deze spectra direct voor de preparatie van cryo-TEM-roosters of voor opslag. Bewaar bij -80 °C tot gebruik.
Het oplosbaar makende membraan van de PufW-His-stam werd aangebracht op een 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolom (20 mM tris-HCl (pH 8,0) met 200 mM NaCl en 0,03% (w/w)) in IMAC-buffer (GE Healthcare). v) β-DDM]. De kolom werd gewassen met vijf kolomvolumes IMAC-buffer en vervolgens met vijf kolomvolumes IMAC-buffer met 10 mM histidine. Het kerncomplex werd van de kolom geëlueerd met vijf IMAC-buffers met 100 mM histidine. De fractie die het RC-LH114-W-complex bevat, wordt geconcentreerd tot ongeveer 10 ml in een geroerde tank voorzien van een Amicon 100.000 MWCO-filter (Merck, VK), 20 keer verdund met bindingsbuffer en vervolgens toegevoegd aan 25 ml. In de DEAE Sepharose-kolom worden vooraf vier CV's gebruikt die gebonden zijn aan de buffer. Spoel de kolom met vier CV-bindingsbuffers en elueer vervolgens het complex op acht CV's met een lineaire gradiënt van 0 tot 100 mM NaCl (in bindingsbuffer). De resterende vier CV's bevatten 100 mM bindingsbuffer. De resterende complexen die geëlueerd werden op de natriumchloridefracties met een A880/A280-ratio hoger dan 2,4 en een A880/A805-ratio hoger dan 4,6 werden geconcentreerd tot ongeveer 2 ml in een Amicon 100.000 MWCO centrifugaalfilter en gevuld met 1,5 CV IMAC in een vooraf met buffer geëquilibreerde Superdex 200 16/600 size exclusion kolom. Vervolgens werd geëlueerd in dezelfde buffer over 1,5 CV. Verzamel de absorptiespectra van de grootte-uitsluitingsfracties en concentreer de absorptiespectra met A880/A280-verhoudingen boven 2,1 en A880/A805-verhoudingen boven 4,6 tot 100 A880. Deze worden direct gebruikt voor de preparatie van bevroren TEM-roosters of bewaard bij -80 °C tot ze nodig zijn.
Een Leica EM GP immersievriezer werd gebruikt om TEM-roosters voor lage temperaturen te prepareren. Het complex werd verdund in IMAC-buffer tot een A880 van 50, waarna 5 μl werd aangebracht op een nieuw, met koolstof bekleed QUANTIFOIL 1.2/1.3-gaas (Agar Scientific, VK), dat met een gloeiontlading was behandeld. Het rooster werd 30 seconden geïncubeerd bij 20 °C en 60% relatieve vochtigheid, vervolgens 3 seconden drooggedept en daarna afgekoeld in vloeibaar ethaan bij -176 °C.
De data van het RC-LH114-W-complex werden vastgelegd met een Titan Krios-microscoop (EBICI) in het eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source). Deze microscoop werkt met een versnellingsspanning van 300 kV, een nominale vergroting van 130.000× en een energie van 20 eV. Een Gatan 968 GIF Quantum met K2-piekdetector werd gebruikt om beelden in telmodus vast te leggen en data te verzamelen. De gekalibreerde pixelgrootte is 1,048 Å en de dosisrate is 3,83 e-Å-2s-1. De opname duurde 11 seconden en werd verdeeld in 40 delen. Met behulp van een met koolstof bekleed gebied werd de microscoop opnieuw scherpgesteld, waarna per deel drie opnames werden gemaakt. In totaal werden 3130 opnames gemaakt, met defocuswaarden tussen -1 en -3 μm.
De gegevens voor het RC-LH116-complex werden verzameld met dezelfde microscoop in het Asterbury Biostructure Laboratory (Universiteit van Leeds, VK). De gegevens werden verzameld in telmodus met een vergroting van 130k, en de pixelgrootte werd gekalibreerd op 1,065 Å met een dosis van 4,6 e-Å-2s-1. De film werd opgenomen in 12 seconden en verdeeld in 48 delen. In totaal werden 3359 films verzameld, met defocuswaarden tussen -1 en -3 μm.
Alle gegevensverwerking wordt uitgevoerd in de Relion 3.0-pipeline (42). Motioncorr 2 (43) wordt gebruikt om de bundelbeweging te corrigeren door middel van dosisweging, en vervolgens wordt CTFFIND 4.1 (44) gebruikt om de CTF-parameter (contrastoverdrachtsfunctie) te bepalen. Typische fotomicrografieën na deze eerste verwerkingsstappen worden weergegeven in Figuur 2. S16. De automatische selectiesjabloon wordt gegenereerd door handmatig ongeveer 250 pixels van 1000 deeltjes te selecteren in een frame van 250 pixels en zonder referentie tweedimensionale (2D) classificatie, waarbij classificaties die voldoen aan de criteria voor monsterverontreiniging of geen waarneembare kenmerken hebben, worden afgewezen. Vervolgens werd automatische selectie uitgevoerd op alle microfoto's, waarbij het RC-LH114-W-complex 849.359 deeltjes telde en het RC-LH116-complex 476.547 deeltjes. Alle geselecteerde deeltjes hebben twee rondes van niet-referentie 2D-classificatie ondergaan. Na elke ronde werden de deeltjes die voldeden aan de criteria voor koolstofgebied, monsterverontreiniging, geen duidelijke kenmerken of sterk overlappende deeltjes afgewezen. Dit resulteerde in 772.033 (90,9%) en 359.678 (75,5%) deeltjes die respectievelijk werden gebruikt voor de 3D-classificatie van RC-LH114-W en RC-LH116. Het initiële 3D-referentiemodel werd gegenereerd met behulp van de stochastische gradiëntafdalingsmethode. Met behulp van dit initiële model als referentie werden de geselecteerde deeltjes in vier categorieën in 3D ingedeeld. Met het model in elke categorie als referentie werd 3D-verfijning uitgevoerd op de deeltjes in de grootste categorie. Vervolgens werd een initieel 15 Å laagdoorlaatfilter gebruikt om het oplosmiddelgebied te bedekken, werden 6 pixels met zachte randen toegevoegd en werden de pixels nabewerkt om de Gatan K2-piekmodulatieoverdrachtsfunctie van de topdetector te corrigeren. Voor de RC-LH114-W-dataset werd dit initiële model aangepast door de sterke dichtheid aan de randen van het masker te verwijderen (losgekoppeld van de dichtheid van het kerncomplex in UCSF Chimera). De resulterende modellen (de resoluties van RC-LH114-W en RC-LH116 zijn respectievelijk 3,91 en 4,16 Å) werden gebruikt als referentie voor de tweede ronde van 3D-classificatie. De gebruikte deeltjes werden gegroepeerd in de initiële 3D-klasse en vertoonden geen sterke correlatie met de omgeving. Overlapping of gebrek aan duidelijke structurele kenmerken. Na de tweede ronde van 3D-classificatie werd de categorie met de hoogste resolutie geselecteerd [Voor RC-LH114-W is één categorie 377.703 deeltjes (44,5%), voor RC-LH116 zijn er twee categorieën, in totaal 260.752 deeltjes (54,7%), waarbij ze alleen na de initiële rotatie, na uitlijning, identiek zijn met een klein verschil]. De geselecteerde deeltjes worden opnieuw geëxtraheerd in een box van 400 pixels en verfijnd door middel van 3D-verfijning. Het oplosmiddelmasker wordt gegenereerd met behulp van het initiële 15 Å laagdoorlaatfilter, een kaartuitbreiding van 3 pixels en een zacht masker van 3 pixels. Na elke stap worden CTF-verfijning per deeltje, bewegingscorrectie per deeltje en een tweede ronde CTF-verfijning per deeltje, 3D-verfijning, oplosmiddelmaskering en nabewerking uitgevoerd om de resulterende textuur verder te verfijnen. Met een FSC-afkapwaarde (Fourier Shell Correlation Coefficient) van 0,143 zijn de resoluties van de uiteindelijke modellen van RC-LH114-W en RC-LH116 respectievelijk 2,65 en 2,80 Å. De FSC-curve van het uiteindelijke model is weergegeven in Figuur 2. S17.
Alle eiwitsequenties zijn gedownload van UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) werd gebruikt om een ​​homologie-model van RC te construeren, dat de eiwitsequenties van RC-L, RC-M en RC-H bevat, en de kristalstructuur van Rba. sphaeroides RC werd als sjabloon gebruikt (PDB ID: 5LSE) (46). Gebruik de tool “fit map” in UCSF Chimera om het gegenereerde model aan de kaart aan te passen (47), de eiwitstructuur te verbeteren en cofactoren [4×BChl a (naam van het residu uit de monomeerbibliotheek = BCL), 2×BPh a (BPH), een of twee soorten UQ10 (U10), een niet-heemijzer (Fe) en een 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] toe te voegen met behulp van Coot (48). Omdat QAK niet beschikbaar is in de monomeerbibliotheek, werd het geparametriseerd met behulp van de eLBOW-tool in PHENIX (49).
Vervolgens werd de LH1-subeenheid geconstrueerd. Aanvankelijk werd de automatische constructietool in PHENIX (49) gebruikt om automatisch een deel van de LH1-sequentie te construeren met behulp van de kaart en de LH1-α- en LH1-β-eiwitsequenties als invoer. Selecteer de meest complete LH1-subeenheid, extraheer deze en laad deze in Coot, voeg handmatig de ontbrekende sequentie toe en verfijn handmatig de gehele structuur voordat twee BCls a (BCL) en een spirilloxanthine (CRT) worden toegevoegd [volgens de relevante Rps-dichtheid van het LH1-complex en het bekende carotenoïdegehalte. Soorten (17)]. Kopieer de complete LH1-subeenheid en gebruik de UCSF Chimera “Docking Map Tool” om te docken in het aangrenzende niet-modelgebied van de LH1-dichtheid, en verfijn deze vervolgens in Coot; herhaal dit proces totdat alle LH1-subeenheden zijn gemodelleerd. Voor de RC-LH114-W-structuur wordt, door de niet-toegewezen dichtheid in Coot te extraheren, het eiwit gesegmenteerd van de resterende niet-eiwitcomponenten in de USCF Chimera-kaart. De Autobuild-tool wordt gebruikt om het initiële model en de resterende subeenheden (eiwit-W) te modelleren in PHENIX (49). Voeg eventuele ontbrekende sequenties toe aan het resulterende model in Coot (48) en verfijn vervolgens handmatig de gehele subeenheid. De resterende niet-toegewezen dichtheid past bij de combinatie van lipiden (PDB-monomeerbibliotheek-ID van CDL = CDL, POPC = 6PL en POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) en UQ10-moleculen (U10). Gebruik PHENIX-optimalisatie (49) en handmatige optimalisatie in Coot (48) om het complete initiële model te perfectioneren totdat de modelstatistieken en de visuele kwaliteit van de fit niet verder kunnen worden verbeterd. Gebruik tot slot LocScale (50) om de lokale kaart te verscherpen en voer vervolgens verschillende andere cycli uit voor het modelleren van de niet-toegewezen dichtheid en automatische en handmatige optimalisatie.
De respectievelijke peptiden, cofactoren en andere lipiden en chinonen die binnen hun respectievelijke dichtheden zijn gedockt, worden weergegeven in figuren 1 en 2. S18 tot en met S23. De statistische informatie van het uiteindelijke model is weergegeven in tabel S1.
Tenzij anders vermeld, werden de UV/Vis/NIR-absorptiespectra gemeten met een Cary60-spectrofotometer (Agilent, VS) met intervallen van 1 nm van 250 nm tot 1000 nm en een integratietijd van 0,1 s.
Verdun het monster in een kwartscuvet met een padlengte van 2 mm tot een A880-waarde van 1 en meet het absorptiespectrum tussen 400 en 1000 nm. De circulaire dichroïsche spectra werden gemeten met een Jasco 810 spectropolarimeter (Jasco, Japan) met intervallen van 1 nm tussen 400 nm en 950 nm bij een scansnelheid van 20 nm min⁻¹.
De molaire extinctiecoëfficiënt wordt bepaald door het kerncomplex te verdunnen tot een A880 van ongeveer 50. Verdun het volume van 10 μl in 990 μl bindingsbuffer of methanol en verzamel onmiddellijk het absorptiespectrum om BChl-degradatie te minimaliseren. Het BChl-gehalte van elk methanolmonster werd berekend aan de hand van de extinctiecoëfficiënt bij 771 nm van 54,8 mM-1 cm-1, en de extinctiecoëfficiënt werd bepaald (51). Deel de gemeten BChl-concentratie door 32 (RC-LH114-W) of 36 (RC-LH116) om de concentratie van het kerncomplex te bepalen, die vervolgens wordt gebruikt om het absorptiespectrum van hetzelfde monster te bepalen, verzameld in de buffer. Extinctiecoëfficiënt. Parallel. Voor elk monster werden drie herhaalde metingen uitgevoerd en de gemiddelde absorptie van het BChl Qy-maximum werd gebruikt voor de berekening. De extinctiecoëfficiënt van RC-LH114-W, gemeten bij 878 nm, bedraagt ​​3280±140 mM-1 cm-1, terwijl de extinctiecoëfficiënt van RC-LH116, gemeten bij 880 nm, 3800±30 mM-1 cm-1 bedraagt.
UQ10 werd gekwantificeerd volgens de methode in (52). Kort gezegd werd reversed-phase HPLC (RP-HPLC) uitgevoerd met behulp van het Agilent 1200 HPLC-systeem. Los ongeveer 0,02 nmol RC-LH116 of RC-LH114-W op in 50 μl van een 50:50 methanol:chloroform-mengsel met 0,02% (w/v) ijzer(III)chloride en injecteer de voorgeëquilibreerde Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm kolom in 1 ml-1 min-1 bij 40 °C in HPLC-oplosmiddel (80:20 methanol:2-propanol) op een kolom van ×25 cm. Voer isocratische elutie uit in een HPLC-oplosmiddel om de absorptie te meten bij 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoïden) en 780 nm (BChl) gedurende 1 uur. De piek in het chromatogram van 275 nm bij 25,5 minuten werd geïntegreerd; deze bevatte geen andere detecteerbare verbindingen. Het geïntegreerde oppervlak wordt gebruikt om de molaire hoeveelheid geëxtraheerde UQ10 te berekenen aan de hand van de kalibratiecurve die is berekend op basis van de injectie van zuivere standaarden van 0 tot 5,8 nmol (Figuur S14). Elk monster werd in drievoud geanalyseerd en de gerapporteerde fout komt overeen met de standaarddeviatie van het gemiddelde.
Een oplossing met het RC-LH1-complex met een maximale Qy-absorptie van 0,1 werd bereid met 30 μM gereduceerd cytochroom c2 uit paardenhart (Merck, VK) en 0 tot 50 μM UQ2 (Merck, VK). Van elke UQ2-concentratie werden drie monsters van 1 ml bereid en een nacht in het donker bij 4 °C geïncubeerd om volledige aanpassing aan het donker te garanderen vóór de meting. De oplossing werd in een OLIS RSM1000 modulaire spectrofotometer geladen, uitgerust met een 300 nm vlam/500 lijnrooster, een inlaatopening van 1,24 mm, een middenopening van 0,12 mm en een uitlaatopening van 0,6 mm. Een 600 nm long-pass filter werd geplaatst bij de ingang van de monsterfotobuis en de referentiefotomultiplierbuis om excitatielicht uit te sluiten. De absorptie werd gemeten bij 550 nm met een integratietijd van 0,15 s. Het excitatielicht wordt uitgezonden door de 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., VK) via een glasvezelkabel met een intensiteit van 90% via een DC2200-controller (Thorlabs Ltd., VK) en wordt onder een hoek van 90° naar de lichtbron gestuurd. De meetbundel is gericht op de spiegel om eventueel licht dat aanvankelijk niet door het monster is geabsorbeerd, terug te kaatsen. De absorptie werd 10 seconden vóór de belichting gedurende 50 seconden gemeten. Vervolgens werd de absorptie nog 60 seconden in het donker gemeten om de mate te bepalen waarin chinolol spontaan cytochroom c23+ reduceert (zie figuur S8 voor de ruwe data).
De gegevens werden verwerkt door een lineaire initiële reactiesnelheid te fitten binnen 0,5 tot 10 s (afhankelijk van de UQ2-concentratie) en de snelheden van alle drie de monsters bij elke UQ2-concentratie te middelen. De RC-LH1-concentratie, berekend aan de hand van de respectievelijke extinctiecoëfficiënt, werd gebruikt om de reactiesnelheid om te zetten in de katalytische efficiëntie. Deze werd uitgezet in Origin Pro 2019 (OriginLab, VS) en gefit aan het Michaelis-Menten-model om de schijnbare Km- en Kcat-waarden te bepalen.
Voor transiënte absorptiemetingen werd het RC-LH1-monster verdund tot ~2 μM in IMAC-buffer met 50 mM natriumascorbaat (Merck, VS) en 0,4 mM terbutine (Merck, VS). Ascorbinezuur wordt gebruikt als offer-elektronendonor en tert-butaclofen als QB-remmer om ervoor te zorgen dat de belangrijkste RC-donor gereduceerd blijft (d.w.z. niet gefoto-oxideerd wordt) gedurende het meetproces. Ongeveer 3 ml monster wordt toegevoegd aan een speciaal ontworpen roterende cel (ongeveer 0,1 m diameter, 350 RPM) met een optische padlengte van 2 mm om ervoor te zorgen dat het monster in het laserpad voldoende tijd heeft voor donkeradaptatie tussen de excitatiepulsen. Gebruik laserpulsen van ongeveer 100 fs om het Ti:Saffier-lasersysteem (Spectra Physics, VS) te versterken en het monster te exciteren bij 880 nm met een herhalingsfrequentie van 1 kHz (20 nJ voor NIR of 100 nJ voor Vis). Stel het monster vóór het verzamelen van gegevens gedurende ongeveer 30 minuten bloot aan excitatielicht. Deze blootstelling zal QA-inactivering veroorzaken (waardoor de QA-activiteit mogelijk één of twee keer afneemt). Houd er echter rekening mee dat dit proces omkeerbaar is, omdat RC na een lange periode van donkeradaptatie langzaam weer QA-activiteit zal vertonen. Een Helios-spectrometer (Ultrafast Systems, VS) werd gebruikt om transiënte spectra te meten met een vertragingstijd van -10 tot 7000 ps. Gebruik de Surface Xplorer-software (Ultrafast Systems, VS) om de datasets te ontgroepperen, samen te voegen en te standaardiseren. Gebruik het softwarepakket CarpetView (Light Conversion Ltd., Litouwen) om de gecombineerde dataset te gebruiken voor het verkrijgen van differentiële spectra die verband houden met verval, of gebruik een functie die meerdere exponenten convolueert met de instrumentrespons om de spectrale evolutie bij één golflengte te fitten in Origin (OriginLab, VS).
Zoals hierboven vermeld (53), werd een fotosynthetische film bereid die het LH1-complex bevatte, maar zonder zowel RC als perifere LH2-antenne. Het membraan werd verdund in 20 mM tris (pH 8,0) en vervolgens in een kwartscuvet met een optische padlengte van 2 mm geplaatst. Een laserpuls van 30 nJ werd gebruikt om het monster te exciteren bij 540 nm met een vertragingstijd van -10 tot 7000 ps. Verwerk de dataset zoals beschreven voor het Rps. pal-monster.
Het membraan werd gepelleteerd door centrifugatie bij 150.000 RCF gedurende 2 uur bij 4°C, waarna de absorptie bij 880 nm werd geresuspendeerd in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) en 200 mM NaCl. Los het membraan op door langzaam roeren in 2% (w/v) β-DDM gedurende 1 uur in het donker bij 4°C. Het monster werd verdund in 100 mM triethylammoniumcarbonaat (pH 8,0) (TEAB; Merck, VK) tot een eiwitconcentratie van 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyse). Verdere verwerking werd uitgevoerd volgens de eerder gepubliceerde methode (54), beginnend met de verdunning van 50 μg eiwit in in totaal 50 μl TEAB met 1% (w/v) natriumlauraat (Merck, VK). Na sonificatie gedurende 60 seconden werd het gereduceerd met 5 mM tris(2-carboxyethyl)fosfine (Merck, VK) bij 37 °C gedurende 30 minuten. Voor S-alkylering werd het monster geïncubeerd met 10 mM methyl-S-methylthiomethaansulfonaat (Merck, VK) en vervolgens toegevoegd vanuit een 200 mM isopropanol-stockoplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Proteolytische digestie werd uitgevoerd door 2 μg trypsine/endoproteïnase Lys-C-mengsel (Promega, VK) toe te voegen en gedurende 3 uur bij 37 °C te incuberen. Het lauraat-surfactant werd geëxtraheerd door 50 μl ethylacetaat en 10 μl 10% (v/v) LC-kwaliteit trifluorazijnzuur (TFA; Thermo Fisher Scientific, VK) toe te voegen en gedurende 60 seconden te vortexen. De fasescheiding werd bevorderd door centrifugeren bij 15.700 RCF gedurende 5 minuten. Volgens het protocol van de fabrikant werd een C18-spincolumn (Thermo Fisher Scientific, VK) gebruikt om de onderste fase met het peptide zorgvuldig af te zuigen en te ontzouten. Na drogen door vacuümcentrifugatie werd het monster opgelost in 0,5% TFA en 3% acetonitril, en werd 500 ng geanalyseerd met nanoflow RP-chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie met behulp van de eerder beschreven systeemparameters.
Gebruik MaxQuant v.1.5.3.30 (56) voor eiwitidentificatie en -kwantificatie om te zoeken in de proteoomdatabase van Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). De massaspectrometrie-proteomicsgegevens zijn gedeponeerd bij de ProteomeXchange Alliance via de PRIDE-partnerrepository (http://proteomecentral.proteomexchange.org) onder de dataset-identificatiecode PXD020402.
Voor analyse met RPLC gekoppeld aan elektrospray-ionisatiemassaspectrometrie werd het RC-LH1-complex bereid uit wildtype Rps. Met behulp van de eerder gepubliceerde methode (16) werd de eiwitconcentratie in palustriscellen 2 mg ml-1 in 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl en 0,03% (w/v) β-DDM (Bio-Rad-analyse) gebruikt. Volgens het protocol van de fabrikant werd met behulp van een 2D-zuiveringskit (GE Healthcare, VS) 10 μg eiwit geëxtraheerd door middel van precipitatie, waarna het precipitaat werd opgelost in 20 μl 60% (v/v) mierenzuur (FA), 20% (v/v) acetonitril en 20% (v/v) water. Vijf microliter werd geanalyseerd met RPLC (Dionex RSLC) gekoppeld aan massaspectrometrie (Maxis UHR-TOF, Bruker). Gebruik een MabPac 1,2 × 100 mm kolom (Thermo Fisher Scientific, VK) voor scheiding bij 60 °C en 100 μl min⁻¹, met een gradiënt van 85% (v/v) oplosmiddel A [0,1% (v/v) mierenzuur (FA) en 0,02% (v/v) trifluorazijnzuur (TFA) waterige oplossing] naar 85% (v/v) oplosmiddel B [0,1% (v/v) mierenzuur (FA) en 0,02% (v/v) TFA in 90% (v/v) acetonitril]. Met behulp van een standaard elektrospray-ionisatiebron en standaardparameters gedurende meer dan 60 minuten verkrijgt de massaspectrometer een massaspectrum van 100 tot 2750 m/z (massa-ladingverhouding). Met behulp van de ExPASy bio-informatica-tool FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) wordt het massaspectrum gekoppeld aan de subeenheden van het complex.
De cellen werden gedurende 72 uur gekweekt onder 100 ml NF-laag (10 μM m-2 s-1), gemiddeld (30 μM m-2 s-1) of hoog (300 μM m-2 s-1) licht. M22-medium (M22-medium waarin ammoniumsulfaat is weggelaten en natriumsucinaat is vervangen door natriumacetaat) in een fles met schroefdop van 100 ml (23). In vijf cycli van 30 seconden werden glaskorrels van 0,1 micron in een volumeverhouding van 1:1 toegevoegd om de cellen te lyseren en gedurende 5 minuten op ijs gekoeld. De onoplosbare stoffen, intacte cellen en glaskorrels werden verwijderd door centrifugatie bij 16.000 RCF gedurende 10 minuten in een tafelmodel microcentrifuge. Het membraan werd gescheiden in een Ti 70.1 rotor met 100.000 RCF in 20 mM tris-HCl (pH 8,0) met een sucrosegradiënt van 40/15% (w/w) gedurende 10 uur.
Zoals beschreven in ons eerdere werk, immunodetectie van de His-tag op PufW (16). Kort gezegd, het gezuiverde kerncomplex (11,8 nM) of het membraan met dezelfde concentratie RC (bepaald door oxidatie, waarbij het gereduceerde verschilspectrum werd afgetrokken en de lading op de gekleurde gel werd vergeleken) in 2x SDS-laadbuffer (Merck, VK), tweemaal verdund. De eiwitten werden gescheiden op een replica 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, VK). Een gel werd gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, VK) om de RC-L-subeenheid te laden en te visualiseren. Het eiwit op de tweede gel werd overgebracht naar een met methanol geactiveerd polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan (Thermo Fisher Scientific, VK) voor immunoassay. Het PVDF-membraan werd geblokkeerd in 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 en 5% (w/v) magere melkpoeder, en vervolgens gedurende 4 uur geïncubeerd met het anti-His primaire antilichaam (in verdunde antilichaambuffer [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl en 0,05% (v/v) Tween-20] in een verdunning van 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA). Na driemaal 5 minuten wassen in antilichaambuffer werd het membraan gecombineerd met een secundair anti-muis antilichaam (verdund 1:10.000 in antilichaambuffer) met mierrettichperoxidase (Sigma-Aldrich, VK). Incubeer gedurende 5 minuten na driemaal wassen in antilichaambuffer om detectie mogelijk te maken met behulp van WESTAR ETA C 2.0 chemiluminescentiesubstraat (Cyanagen, Italië) en Amersham Imager 600 (GE Healthcare, VK).
Door de intensiteitsverdeling van elke gekleurde gel of immunoassay-baan te tekenen, het oppervlak onder de piek te integreren en de intensiteitsverhouding van RC-L (gekleurde gel) en Protein-W (immunoassay) te berekenen in ImageJ (57) Verwerk de afbeelding. Deze verhoudingen werden omgezet in molaire verhoudingen door aan te nemen dat de verhouding van RC-L tot Protein-W in het zuivere RC-LH114-W-monster 1:1 was en de gehele dataset dienovereenkomstig te normaliseren.
Voor aanvullend materiaal bij dit artikel kunt u terecht op http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dit is een open access-artikel dat is gepubliceerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License. Het artikel mag onbeperkt worden gebruikt, verspreid en gereproduceerd in elk medium, op voorwaarde dat het originele werk correct wordt geciteerd.
Let op: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u de pagina aanbeveelt weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat het geen spam is. We zullen geen e-mailadressen opslaan.
Deze vraag wordt gebruikt om te controleren of u een bezoeker bent en om automatische spaminzendingen te voorkomen.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
De structuur met hoge resolutie van het lichtvalcomplex 1 in het reactiecentrum biedt nieuwe inzichten in de dynamiek van chinonen.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
De structuur met hoge resolutie van het lichtvalcomplex 1 in het reactiecentrum biedt nieuwe inzichten in de dynamiek van chinonen.
©2021 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap. alle rechten voorbehouden. AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.