Dit artikel maakt deel uit van het onderzoeksthema "Geavanceerde bioremediatietechnologieën en recyclingprocessen voor synthetische organische verbindingen (SOC)". Bekijk alle 14 artikelen.
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) met een laag moleculair gewicht, zoals naftaleen en gesubstitueerde naftalenen (methylnaftaleen, naftoezuur, 1-naftyl-N-methylcarbamaat, enz.), worden veelvuldig gebruikt in diverse industrieën en zijn genotoxisch, mutageen en/of carcinogeen voor organismen. Deze synthetische organische verbindingen (SOC's) of xenobiotica worden beschouwd als prioritaire verontreinigende stoffen en vormen een ernstige bedreiging voor het wereldwijde milieu en de volksgezondheid. De intensiteit van menselijke activiteiten (bijv. kolenvergassing, olieraffinage, voertuigemissies en landbouwtoepassingen) bepaalt de concentratie, het lot en het transport van deze alomtegenwoordige en persistente verbindingen. Naast fysische en chemische behandelings-/verwijderingsmethoden zijn groene en milieuvriendelijke technologieën zoals bioremediatie, waarbij micro-organismen worden gebruikt die in staat zijn om POC's volledig af te breken of om te zetten in niet-toxische bijproducten, naar voren gekomen als een veilig, kosteneffectief en veelbelovend alternatief. Verschillende bacteriesoorten die behoren tot de fyla Proteobacteria (Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia en Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus en Paenibacillus) en Actinobacteria (Rhodococcus en Arthrobacter) in de bodemmicrobiota hebben aangetoond dat ze diverse organische verbindingen kunnen afbreken. Metabolische studies, genomica en metagenomische analyses helpen ons de katabolische complexiteit en diversiteit van deze eenvoudige levensvormen te begrijpen, wat verder kan worden toegepast voor efficiënte biodegradatie. De langdurige aanwezigheid van PAK's heeft geleid tot het ontstaan ​​van nieuwe afbraakfenotypen door horizontale genoverdracht met behulp van genetische elementen zoals plasmiden, transposons, bacteriofagen, genomische eilanden en integratieve conjugatieve elementen. Systeembiologie en genetische modificatie van specifieke isolaten of modelgemeenschappen (consortia) kunnen een alomvattende, snelle en efficiënte bioremediatie van deze PAK's mogelijk maken door synergetische effecten. In dit overzicht richten we ons op de verschillende metabolische routes en diversiteit, de genetische samenstelling en diversiteit, en de cellulaire reacties/aanpassingen van bacteriën die naftaleen en gesubstitueerd naftaleen afbreken. Dit levert ecologische informatie op voor toepassing in het veld en voor stamoptimalisatie ten behoeve van efficiënte bioremediatie.
De snelle ontwikkeling van industrieën (petrochemie, landbouw, farmaceutica, textielverf, cosmetica, enz.) heeft bijgedragen aan de wereldwijde economische welvaart en een verbeterde levensstandaard. Deze exponentiële ontwikkeling heeft geleid tot de productie van een groot aantal synthetische organische verbindingen (SOC's), die worden gebruikt bij de vervaardiging van diverse producten. Deze vreemde verbindingen of SOC's omvatten polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), pesticiden, herbiciden, weekmakers, kleurstoffen, farmaceutische producten, organofosfaten, vlamvertragers, vluchtige organische oplosmiddelen, enz. Ze worden uitgestoten in de atmosfeer, aquatische en terrestrische ecosystemen, waar ze multidimensionale effecten hebben en schadelijke gevolgen hebben voor diverse biovormen door veranderingen in fysisch-chemische eigenschappen en de gemeenschapsstructuur (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Veel aromatische verontreinigende stoffen hebben een sterke en destructieve impact op veel intacte ecosystemen/biodiversiteitshotspots (bijv. koraalriffen, Arctische/Antarctische ijskappen, hooggelegen bergmeren, diepzeebodemafzettingen, enz.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Recente geomicrobiologische studies hebben aangetoond dat de afzetting van synthetische organische stoffen (bijv. aromatische verontreinigende stoffen) en hun derivaten op de oppervlakken van kunstmatige structuren (gebouwde omgeving) (bijv. cultureel erfgoed en monumenten van graniet, steen, hout en metaal) hun degradatie versnelt (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Menselijke activiteiten kunnen de biologische degradatie van monumenten en gebouwen intensiveren en verergeren door luchtvervuiling en klimaatverandering (Liu et al. 2020). Deze organische verontreinigingen reageren met waterdamp in de atmosfeer en slaan neer op de structuur, waardoor fysieke en chemische degradatie van het materiaal optreedt. Biodegradatie wordt algemeen erkend als ongewenste veranderingen in het uiterlijk en de eigenschappen van materialen, veroorzaakt door levende organismen, die de conservering ervan beïnvloeden (Pochon en Jaton, 1967). Verdere microbiële activiteit (metabolisme) van deze verbindingen kan de structurele integriteit, de effectiviteit van de conservering en de culturele waarde verminderen (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Aan de andere kant is in sommige gevallen gebleken dat microbiële aanpassing aan en reactie op deze structuren gunstig is, omdat ze biofilms en andere beschermende korsten vormen die de snelheid van verval/ontbinding verminderen (Martino, 2016). Daarom vereist de ontwikkeling van effectieve, duurzame conserveringsstrategieën voor stenen, metalen en houten monumenten een grondig begrip van de belangrijkste processen die hierbij betrokken zijn. In vergelijking met natuurlijke processen (geologische processen, bosbranden, vulkaanuitbarstingen, reacties van planten en bacteriën) leiden menselijke activiteiten tot de uitstoot van grote hoeveelheden polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) en andere organische koolstof (OC) in ecosystemen. Veel PAK's die worden gebruikt in de landbouw (insecticiden en pesticiden zoals DDT, atrazine, carbaryl, pentachloorfenol, enz.), de industrie (ruwe olie, olieslib/afval, van aardolie afgeleide kunststoffen, PCB's, weekmakers, detergenten, ontsmettingsmiddelen, fumiganten, geurstoffen en conserveermiddelen), persoonlijke verzorgingsproducten (zonnebrandcrèmes, ontsmettingsmiddelen, insectenwerende middelen en polycyclische muskusverbindingen) en munitie (explosieven zoals 2,4,6-TNT) zijn potentiële xenobiotica die de gezondheid van de planeet kunnen beïnvloeden (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna en Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Deze lijst kan worden uitgebreid met van aardolie afgeleide verbindingen (stookolie, smeermiddelen, asfaltenen), bioplastics met een hoog moleculair gewicht en ionische vloeistoffen (Amde et al., 2015). Tabel 1 geeft een overzicht van verschillende aromatische verontreinigende stoffen en hun toepassingen in diverse industrieën. De afgelopen jaren is de antropogene uitstoot van vluchtige organische stoffen, evenals koolstofdioxide en andere broeikasgassen, toegenomen (Dvorak et al., 2017). De antropogene impact is echter aanzienlijk groter dan de natuurlijke impact. Bovendien bleek dat een aantal van deze organische verontreinigende stoffen in veel milieus aanwezig blijven en zijn geïdentificeerd als opkomende verontreinigende stoffen met nadelige effecten op ecosystemen (Figuur 1). Milieuagentschappen zoals het Amerikaanse Environmental Protection Agency (USEPA) hebben veel van deze verontreinigende stoffen opgenomen in hun prioriteitenlijst vanwege hun cytotoxische, genotoxische, mutagene en carcinogene eigenschappen. Daarom zijn strikte afvalverwerkingsvoorschriften en effectieve strategieën voor afvalverwerking/verwijdering uit verontreinigde ecosystemen noodzakelijk. Diverse fysische en chemische behandelingsmethoden zoals pyrolyse, oxidatieve thermische behandeling, luchtbeluchting, storting, verbranding, enz. zijn ineffectief en kostbaar en genereren corrosieve, giftige en moeilijk te behandelen bijproducten. Met de toenemende wereldwijde aandacht voor het milieu, krijgen micro-organismen die in staat zijn deze verontreinigende stoffen en hun derivaten (zoals gehalogeneerde, nitro-, alkyl- en/of methylverbindingen) af te breken steeds meer belangstelling (Fennell et al., 2004; Haritash en Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Het gebruik van deze inheemse micro-organismen, afzonderlijk of in gemengde culturen (kolonies), voor de verwijdering van aromatische verontreinigende stoffen biedt voordelen op het gebied van milieuvriendelijkheid, kosten, efficiëntie, effectiviteit en duurzaamheid. Onderzoekers onderzoeken ook de integratie van microbiële processen met elektrochemische redoxmethoden, met name bio-elektrochemische systemen (BES), als een veelbelovende technologie voor de behandeling/verwijdering van verontreinigende stoffen (Huang et al., 2011). BES-technologie heeft steeds meer aandacht gekregen vanwege de hoge efficiëntie, lage kosten, milieuvriendelijkheid, werking bij kamertemperatuur, biocompatibele materialen en de mogelijkheid om waardevolle bijproducten terug te winnen (bijv. elektriciteit, brandstof en chemicaliën) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). De komst van high-throughput genoomsequencing en omics-tools/methoden heeft een schat aan nieuwe informatie opgeleverd over de genetische regulatie, proteomics en fluxomics van de reacties van verschillende afbrekende micro-organismen. De combinatie van deze tools met systeembiologie heeft ons begrip van de selectie en fijnafstemming van doelgerichte katabolische routes in micro-organismen (d.w.z. metabolisch ontwerp) verder vergroot om efficiënte en effectieve biodegradatie te bereiken. Om effectieve bioremediatiestrategieën te ontwerpen met behulp van geschikte kandidaat-micro-organismen, moeten we het biochemische potentieel, de metabolische diversiteit, de genetische samenstelling en de ecologie (auto-ecologie/synecologie) van micro-organismen begrijpen.
Figuur 1. Bronnen en verspreidingsroutes van laagmoleculaire PAK's door verschillende milieus en diverse factoren die de biota beïnvloeden. Gestippelde lijnen geven interacties tussen ecosysteemelementen weer.
In dit overzicht hebben we geprobeerd de gegevens samen te vatten over de afbraak van eenvoudige PAK's zoals naftaleen en gesubstitueerde naftalenen door verschillende bacteriële isolaten. We hebben daarbij gekeken naar metabolische routes en diversiteit, enzymen die betrokken zijn bij de afbraak, genensamenstelling/inhoud en diversiteit, cellulaire reacties en verschillende aspecten van bioremediatie. Inzicht in de biochemische en moleculaire processen zal helpen bij het identificeren van geschikte gastheerstammen en de verdere genetische modificatie ervan voor effectieve bioremediatie van dergelijke prioritaire verontreinigende stoffen. Dit zal bijdragen aan de ontwikkeling van strategieën voor de oprichting van locatiespecifieke bacteriële consortia voor effectieve bioremediatie.
De aanwezigheid van een groot aantal giftige en gevaarlijke aromatische verbindingen (die voldoen aan de Huckel-regel 4n + 2π elektronen, n = 1, 2, 3, …) vormt een ernstige bedreiging voor diverse milieumedia zoals lucht, bodem, sedimenten en oppervlakte- en grondwater (Puglisi et al., 2007). Deze verbindingen hebben een enkele benzeenring (monocyclisch) of meerdere benzeenringen (polycyclisch) die lineair, hoekig of in clustervorm gerangschikt zijn en vertonen stabiliteit (stabiliteit/instabiliteit) in het milieu vanwege een hoge negatieve resonantie-energie en inertheid (inertheid), wat verklaard kan worden door hun hydrofobiciteit en gereduceerde toestand. Wanneer de aromatische ring verder wordt vervangen door methyl (-CH3), carboxyl (-COOH), hydroxyl (-OH) of sulfonaat (-HSO3) groepen, wordt deze stabieler, heeft een sterkere affiniteit voor macromoleculen en is bioaccumulatief in biologische systemen (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Sommige polycyclische aromatische koolwaterstoffen met een laag moleculair gewicht (LMWAH's), zoals naftaleen en zijn derivaten [methylnaftaleen, naftoezuur, naftaleensulfonaat en 1-naftyl N-methylcarbamaat (carbaryl)], zijn door het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) opgenomen in de lijst van prioritaire organische verontreinigende stoffen vanwege hun genotoxische, mutagene en/of carcinogene eigenschappen (Cerniglia, 1984). Het vrijkomen van deze klasse NM-PAH's in het milieu kan leiden tot bioaccumulatie van deze verbindingen op alle niveaus van de voedselketen, waardoor de gezondheid van ecosystemen wordt aangetast (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
De bronnen en verspreidingsroutes van PAK's naar de biota verlopen voornamelijk via migratie en interacties tussen verschillende ecosysteemcomponenten zoals bodem, grondwater, oppervlaktewater, gewassen en de atmosfeer (Arey en Atkinson, 2003). Figuur 1 toont de interacties en verspreiding van verschillende PAK's met een laag moleculair gewicht in ecosystemen en hun verspreidingsroutes naar de biota/menselijke blootstelling. PAK's worden afgezet op oppervlakken als gevolg van luchtvervuiling en door de migratie (drift) van uitlaatgassen van voertuigen, industriële uitlaatgassen (kolenvergassing, verbranding en cokesproductie) en de daaropvolgende depositie. Industriële activiteiten zoals de productie van synthetisch textiel, kleurstoffen en verf; houtconservering; rubberverwerking; cementproductie; pesticidenproductie; en landbouwtoepassingen zijn belangrijke bronnen van PAK's in land- en watersystemen (Bamforth en Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studies hebben aangetoond dat bodems in voorstedelijke en stedelijke gebieden, nabij snelwegen en in grote steden gevoeliger zijn voor polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) als gevolg van emissies van energiecentrales, verwarming van woningen, lucht- en wegverkeer en bouwactiviteiten (Suman et al., 2016). (2008) toonde aan dat de PAK-concentraties in de bodem nabij wegen in New Orleans, Louisiana, VS, opliepen tot 7189 μg/kg, terwijl ze in open gebieden slechts 2404 μg/kg bedroegen. Op vergelijkbare wijze zijn PAK-niveaus tot wel 300 μg/kg gerapporteerd in gebieden nabij kolenvergassingsinstallaties in verschillende Amerikaanse steden (Kanaly en Harayama, 2000; Bamforth en Singleton, 2005). Uit onderzoek is gebleken dat bodems uit verschillende Indiase steden, zoals Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni en Venkataraman, 2000) en Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), hoge concentraties PAK's bevatten. Aromatische verbindingen worden gemakkelijker geadsorbeerd aan bodemdeeltjes, organisch materiaal en kleimineralen, waardoor ze belangrijke koolstofputten in ecosystemen vormen (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). De belangrijkste bronnen van PAK's in aquatische ecosystemen zijn neerslag (natte/droge neerslag en waterdamp), stedelijke afvoer, afvalwaterlozing, grondwateraanvulling, enz. (Srogi, 2007). Naar schatting is ongeveer 80% van de PAK's in mariene ecosystemen afkomstig van neerslag, sedimentatie en afvalwaterlozing (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Hogere concentraties PAK's in oppervlaktewater of percolaat van stortplaatsen voor vast afval lekken uiteindelijk in het grondwater, wat een grote bedreiging vormt voor de volksgezondheid, aangezien meer dan 70% van de bevolking in Zuid- en Zuidoost-Azië grondwater drinkt (Duttagupta et al., 2019). Een recente studie van Duttagupta et al. (2020) naar rivier- (32) en grondwateranalyses (235) in West-Bengalen, India, toonde aan dat naar schatting 53% van de stedelijke bevolking en 44% van de plattelandsbewoners (in totaal 20 miljoen inwoners) mogelijk blootgesteld worden aan naftaleen (4,9–10,6 μg/L) en de daarvan afgeleide stoffen. Verschillende landgebruikspatronen en toegenomen grondwaterwinning worden beschouwd als de belangrijkste factoren die het verticale transport (advectie) van PAK's met een laag moleculair gewicht in de ondergrond bepalen. Er is vastgesteld dat afvoer van landbouwgrond, lozingen van gemeentelijk en industrieel afvalwater en lozingen van vast afval/vuilnis van invloed zijn op de aanwezigheid van PAK's in rivierbekkens en ondergrondse sedimenten. Neerslag in de atmosfeer verergert de PAH-vervuiling. Hoge concentraties PAH's en hun alkylderivaten (in totaal 51) zijn wereldwijd aangetroffen in rivieren en stroomgebieden, zoals de Fraser River, Louan River, Denso River, Missouri River, Anacostia River, Ebro River en Delaware River (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). In de sedimenten van het Gangesbekken bleken naftaleen en fenanthreen de meest voorkomende te zijn (gedetecteerd in 70% van de monsters) (Duttagupta et al., 2019). Bovendien hebben studies aangetoond dat chlorering van drinkwater kan leiden tot de vorming van giftigere geoxygeneerde en gechloreerde PAH's (Manoli en Samara, 1999). PAK's hopen zich op in granen, fruit en groenten als gevolg van opname door planten uit verontreinigde bodems, grondwater en neerslag (Fismes et al., 2002). Veel waterorganismen, zoals vissen, mosselen, venusschelpen en garnalen, raken besmet met PAK's door de consumptie van verontreinigd voedsel en zeewater, maar ook via weefsels en huid (Mackay en Fraser, 2000). Kook- en verwerkingsmethoden zoals grillen, braden, roken, frituren, drogen, bakken en koken op houtskool kunnen ook leiden tot aanzienlijke hoeveelheden PAK's in voedsel. Dit hangt grotendeels af van de keuze van het rookmateriaal, het gehalte aan fenolische/aromatische koolwaterstoffen, de kookmethode, het type verwarmingselement, het vochtgehalte, de zuurstoftoevoer en de verbrandingstemperatuur (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) zijn ook in melk aangetroffen in variërende concentraties (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). De ophoping van deze PAK's in voedsel hangt ook af van de fysisch-chemische eigenschappen van het voedsel, terwijl hun toxische effecten verband houden met fysiologische functies, metabolische activiteit, absorptie, distributie en lichaamsverdeling (Mechini et al., 2011).
De toxiciteit en schadelijke effecten van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) zijn al lange tijd bekend (Cherniglia, 1984). Polycyclische aromatische koolwaterstoffen met een laag moleculair gewicht (LMW-PAK's) (twee tot drie ringen) kunnen covalent binden aan verschillende macromoleculen zoals DNA, RNA en eiwitten en zijn kankerverwekkend (Santarelli et al., 2008). Door hun hydrofobe aard worden ze gescheiden door lipide membranen. Bij mensen oxideren cytochroom P450-monooxygenasen PAK's tot epoxiden, waarvan sommige zeer reactief zijn (bijvoorbeeld baediol-epoxide) en kunnen leiden tot de transformatie van normale cellen in kwaadaardige cellen (Marston et al., 2001). Bovendien zijn de transformatieproducten van PAK's, zoals chinonen, fenolen, epoxiden, diolen, enz., giftiger dan de oorspronkelijke verbindingen. Sommige PAK's en hun metabolische tussenproducten kunnen hormonen en diverse enzymen in de stofwisseling beïnvloeden, waardoor ze een negatieve invloed hebben op de groei, het centrale zenuwstelsel, het voortplantings- en immuunsysteem (Swetha en Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Er is gemeld dat kortdurende blootstelling aan PAK's met een laag moleculair gewicht leidt tot een verminderde longfunctie en trombose bij astmapatiënten en het risico op huid-, long-, blaas- en maagkanker verhoogt (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Dierstudies hebben ook aangetoond dat blootstelling aan PAK's nadelige effecten kan hebben op de voortplantingsfunctie en -ontwikkeling en staar, nier- en leverbeschadiging en geelzucht kan veroorzaken. Van verschillende biotransformatieproducten van PAK's, zoals diolen, epoxiden, chinonen en vrije radicalen (kationen), is aangetoond dat ze DNA-adducten vormen. Het is aangetoond dat stabiele adducten het DNA-replicatiemechanisme kunnen veranderen, terwijl onstabiele adducten DNA kunnen depurineren (voornamelijk tot adenine en soms tot guanine); beide kunnen fouten veroorzaken die leiden tot mutaties (Schweigert et al. 2001). Bovendien kunnen chinonen (benzo-/pan-) reactieve zuurstofsoorten (ROS) genereren, die fatale schade toebrengen aan DNA en andere macromoleculen, waardoor de weefselfunctie/levensvatbaarheid wordt aangetast (Ewa en Danuta 2017). Chronische blootstelling aan lage concentraties pyreen, bifenyl en naftaleen zou kanker veroorzaken bij proefdieren (Diggs et al. 2012). Vanwege hun dodelijke toxiciteit is het opruimen/verwijderen van deze PAK's van getroffen/verontreinigde locaties een prioriteit.
Er zijn diverse fysische en chemische methoden gebruikt om PAK's te verwijderen uit verontreinigde locaties/omgevingen. Processen zoals verbranding, dechlorering, UV-oxidatie, fixatie en solventextractie hebben veel nadelen, waaronder de vorming van giftige bijproducten, procescomplexiteit, veiligheids- en regelgevingskwesties, lage efficiëntie en hoge kosten. Microbiële afbraak (bioremediatie genoemd) is echter een veelbelovende alternatieve aanpak waarbij micro-organismen in de vorm van zuivere culturen of kolonies worden gebruikt. In vergelijking met fysische en chemische methoden is dit proces milieuvriendelijk, niet-invasief, kosteneffectief en duurzaam. Bioremediatie kan worden uitgevoerd op de aangetaste locatie (in situ) of op een speciaal geprepareerde locatie (ex situ) en wordt daarom beschouwd als een duurzamere saneringsmethode dan traditionele fysische en chemische methoden (Juhasz en Naidu, 2000; Andreoni en Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Inzicht in de microbiële metabolische stappen die betrokken zijn bij de afbraak van aromatische verontreinigende stoffen heeft enorme wetenschappelijke en economische implicaties voor ecologische en milieuduurzaamheid. Wereldwijd wordt naar schatting 2,1 × 10¹⁸ gram koolstof (C) opgeslagen in sedimenten en organische verbindingen (zoals olie, aardgas en steenkool, oftewel fossiele brandstoffen), wat een aanzienlijke bijdrage levert aan de mondiale koolstofcyclus. Snelle industrialisatie, de winning van fossiele brandstoffen en menselijke activiteiten putten deze lithosferische koolstofreservoirs echter uit, waardoor jaarlijks naar schatting 5,5 × 10¹⁵ gram organische koolstof (als verontreinigende stoffen) in de atmosfeer terechtkomt (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Het grootste deel van deze organische koolstof komt via sedimentatie, transport en afvoer in land- en mariene ecosystemen terecht. Daarnaast vervuilen nieuwe synthetische verontreinigende stoffen afkomstig van fossiele brandstoffen, zoals plastics, weekmakers en plasticstabilisatoren (ftalaten en hun isomeren), de mariene, bodem- en aquatische ecosystemen en hun biota ernstig, waardoor de mondiale klimaatrisico's worden verergerd. Verschillende soorten microplastics, nanoplastics, plasticfragmenten en hun giftige monomeerproducten, afkomstig van polyethyleentereftalaat (PET), hebben zich opgehoopt in de Stille Oceaan tussen Noord-Amerika en Zuidoost-Azië, waar ze de "Grote Pacific Vuilnisbelt" vormen en het leven in zee schaden (Newell et al., 2020). Wetenschappelijke studies hebben aangetoond dat het niet mogelijk is om dergelijke verontreinigende stoffen/afval te verwijderen met fysische of chemische methoden. In deze context zijn de meest nuttige micro-organismen die welke in staat zijn om verontreinigende stoffen oxidatief te metaboliseren tot kooldioxide, chemische energie en andere niet-giftige bijproducten die uiteindelijk in andere nutriëntenkringloopprocessen terechtkomen (H, O, N, S, P, Fe, enz.). Het begrijpen van de microbiële ecofysiologie van de mineralisatie van aromatische verontreinigende stoffen en de milieubeheersing ervan is daarom cruciaal voor het beoordelen van de microbiële koolstofkringloop, de netto koolstofbalans en toekomstige klimaatrisico's. Gezien de dringende noodzaak om dergelijke verbindingen uit het milieu te verwijderen, zijn er diverse eco-industrieën ontstaan ​​die zich richten op schone technologieën. Als alternatief wordt de valorisatie van industrieel afval/afvalchemicaliën die zich in ecosystemen hebben opgehoopt (oftewel de 'waste-to-wealth'-benadering) beschouwd als een van de pijlers van de circulaire economie en de doelstellingen voor duurzame ontwikkeling (Close et al., 2012). Daarom is het van cruciaal belang om de metabolische, enzymatische en genetische aspecten van deze potentiële afbraakkandidaten te begrijpen voor de effectieve verwijdering en bioremediatie van dergelijke aromatische verontreinigende stoffen.
Van de vele aromatische verontreinigende stoffen besteden we bijzondere aandacht aan PAK's met een laag moleculair gewicht, zoals naftaleen en gesubstitueerde naftalenen. Deze verbindingen zijn belangrijke componenten van brandstoffen op basis van aardolie, textielverfstoffen, consumentenproducten, pesticiden (mottenballen en insectenwerende middelen), weekmakers en tannines en komen daarom veelvuldig voor in diverse ecosystemen (Preuss et al., 2003). Recente rapporten wijzen op de accumulatie van naftaleenconcentraties in aquifer sedimenten, grondwater en ondergrondse bodems, onverzadigde zones en rivierbedden, wat suggereert dat het zich in het milieu bioaccumuleert (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabel 2 vat de fysisch-chemische eigenschappen, toepassingen en gezondheidseffecten van naftaleen en zijn derivaten samen. Vergeleken met andere PAK's met een hoog moleculair gewicht zijn naftaleen en zijn derivaten minder hydrofoob, beter oplosbaar in water en wijdverspreid in ecosystemen. Daarom worden ze vaak gebruikt als modelsubstraten om het metabolisme, de genetica en de metabolische diversiteit van PAK's te bestuderen. Een groot aantal micro-organismen is in staat naftaleen en zijn derivaten te metaboliseren, en er is uitgebreide informatie beschikbaar over hun metabolische routes, enzymen en regulerende kenmerken (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Bovendien worden naftaleen en zijn derivaten, vanwege hun hoge abundantie en biologische beschikbaarheid, beschouwd als prototypeverbindingen voor de beoordeling van milieuvervuiling. Het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) schat dat de gemiddelde concentratie naftaleen in sigarettenrook 5,19 μg per kubieke meter bedraagt, voornamelijk door onvolledige verbranding, en 7,8 tot 46 μg in zijstroomrook, terwijl de blootstelling aan creosoot en naftaleen 100 tot 10.000 keer hoger ligt (Preuss et al. 2003). Van naftaleen is met name vastgesteld dat het soort-, regio- en geslachtsspecifieke respiratoire toxiciteit en carcinogeniciteit vertoont. Op basis van dierstudies heeft het International Agency for Research on Cancer (IARC) naftaleen geclassificeerd als een "mogelijk kankerverwekkende stof voor de mens" (Groep 2B)¹. Blootstelling aan gesubstitueerde naftaleen, voornamelijk door inhalatie of parenterale (orale) toediening, veroorzaakt schade aan het longweefsel en verhoogt de incidentie van longtumoren bij ratten en muizen (National Toxicology Program 2). Acute effecten zijn onder andere misselijkheid, braken, buikpijn, diarree, hoofdpijn, verwardheid, overmatig zweten, koorts en tachycardie. Aan de andere kant is gemeld dat het breedspectrum carbamaat-insecticide carbaryl (1-naftyl N-methylcarbamaat) giftig is voor waterinvertebraten, amfibieën, honingbijen en mensen, en dat het acetylcholinesterase remt, wat verlamming veroorzaakt (Smulders et al., 2003; Bulen en Distel, 2011). Daarom is inzicht in de mechanismen van microbiële afbraak, genetische regulatie, enzymatische en cellulaire reacties cruciaal voor de ontwikkeling van bioremediatiestrategieën in verontreinigde omgevingen.
Tabel 2. Gedetailleerde informatie over de fysisch-chemische eigenschappen, toepassingen, identificatiemethoden en geassocieerde ziekten van naftaleen en zijn derivaten.
In vervuilde niches kunnen hydrofobe en lipofiele aromatische verontreinigende stoffen een verscheidenheid aan cellulaire effecten veroorzaken op het microbioom (de microbiële gemeenschap), zoals veranderingen in membraanvloeibaarheid, membraanpermeabiliteit, zwelling van de lipide dubbellaag, verstoring van de energieoverdracht (elektronentransportketen/protonmotieve kracht) en de activiteit van membraangeassocieerde eiwitten (Sikkema et al., 1995). Daarnaast genereren sommige oplosbare intermediairen, zoals catecholen en chinonen, reactieve zuurstofsoorten (ROS) en vormen ze adducten met DNA en eiwitten (Penning et al., 1999). De overvloed aan dergelijke verbindingen in ecosystemen oefent dus selectieve druk uit op microbiële gemeenschappen om efficiënte afbrekers te worden op verschillende fysiologische niveaus, waaronder opname/transport, intracellulaire transformatie, assimilatie/gebruik en compartimentalisatie.
Uit een zoekopdracht in het Ribosomal Database Project-II (RDP-II) bleek dat in totaal 926 bacteriesoorten werden geïsoleerd uit media of verrijkingsculturen die besmet waren met naftaleen of derivaten daarvan. De Proteobacteria-groep had het hoogste aantal vertegenwoordigers (n = 755), gevolgd door Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) en ongeclassificeerde bacteriën (8) (Figuur 2). Vertegenwoordigers van γ-Proteobacteria (Pseudomonadales en Xanthomonadales) domineerden alle Gram-negatieve groepen met een hoog G+C-gehalte (54%), terwijl Clostridiales en Bacillales (30%) Gram-positieve groepen waren met een laag G+C-gehalte. Er is gerapporteerd dat Pseudomonas (het grootste aantal, 338 soorten) in staat is om naftaleen en de methylderivaten ervan af te breken in diverse vervuilde ecosystemen (koolteer, aardolie, ruwe olie, slib, olievlekken, afvalwater, organisch afval en stortplaatsen) en in intacte ecosystemen (bodem, rivieren, sedimenten en grondwater) (Figuur 2). Bovendien hebben verrijkingsstudies en metagenomische analyses van sommige van deze regio's aangetoond dat niet-gekweekte Legionella- en Clostridium-soorten mogelijk ook afbraakcapaciteit bezitten, wat de noodzaak aangeeft om deze bacteriën te kweken om nieuwe routes en metabolische diversiteit te bestuderen.
Figuur 2. Taxonomische diversiteit en ecologische verspreiding van bacteriële vertegenwoordigers in omgevingen die verontreinigd zijn met naftaleen en naftaleenderivaten.
Van de verschillende micro-organismen die aromatische koolwaterstoffen afbreken, zijn de meeste in staat om naftaleen af ​​te breken als enige koolstof- en energiebron. De opeenvolging van gebeurtenissen die betrokken zijn bij het metabolisme van naftaleen is beschreven voor Pseudomonas sp. (stammen: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 en CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 en andere stammen (ND6 en AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis en Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Het metabolisme wordt geïnitieerd door een multicomponent dioxygenase [naftaleendioxygenase (NDO), een ringhydroxylerende dioxygenase] die de oxidatie van een van de aromatische ringen van naftaleen katalyseert met moleculaire zuurstof als het andere substraat, waarbij naftaleen wordt omgezet in cis-naftaleendiol (Figuur 3). Cis-dihydrodiol wordt door een dehydrogenase omgezet in 1,2-dihydroxynaftaleen. Een ringsplitsende dioxygenase, 1,2-dihydroxynaftaleendioxygenase (12DHNDO), zet 1,2-dihydroxynaftaleen om in 2-hydroxychromeen-2-carbonzuur. Enzymatische cis-trans-isomerisatie produceert trans-o-hydroxybenzylideenpyruvaat, dat door hydratase-aldolase wordt gesplitst in salicylaldehyde en pyruvaat. Het organische zuur pyruvaat was de eerste C3-verbinding die werd afgeleid van het koolstofskelet van naftaleen en die in de centrale koolstofroute terechtkwam. Daarnaast zet NAD+-afhankelijke salicylaldehydedehydrogenase salicylaldehyde om in salicylzuur. Het metabolisme in dit stadium wordt de "bovenste route" van naftaleenafbraak genoemd. Deze route komt veel voor bij de meeste naftaleenafbrekende bacteriën. Er zijn echter enkele uitzonderingen; voor In de thermofiele bacterie Bacillus hamburgii 2 wordt de afbraak van naftaleen bijvoorbeeld geïnitieerd door naftaleen 2,3-dioxygenase, waarbij 2,3-dihydroxynaftaleen wordt gevormd (Annweiler et al., 2000).
Figuur 3. Afbraakroutes van naftaleen, methylnaftaleen, naftoezuur en carbaryl. Omcirkelde nummers geven de enzymen weer die verantwoordelijk zijn voor de sequentiële omzetting van naftaleen en zijn derivaten in de daaropvolgende producten. 1 — naftaleendioxygenase (NDO); 2, cis-dihydrodioldehydrogenase; 3, 1,2-dihydroxynaftaleendioxygenase; 4, 2-hydroxychromeen-2-carbonzuurisomerase; 5, trans-O-hydroxybenzylideenpyruvaathydratase-aldolase; 6, salicylaldehydedehydrogenase; 7, salicylaat-1-hydroxylase; 8, catechol-2,3-dioxygenase (C23DO); 9, 2-hydroxymuconaatsemialdehydedehydrogenase; 10, 2-oxopent-4-enoaathydratase; 11, 4-hydroxy-2-oxopentanoaat aldolase; 12, acetaldehyde dehydrogenase; 13, catechol-1,2-dioxygenase (C12DO); 14, muconaat cycloisomerase; 15, muconolacton delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenollacton hydrolase; 17, β-ketoadipaat succinyl-CoA transferase; 18, β-ketoadipaat-CoA thiolase; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA succinyltransferase; 20, salicylaat 5-hydroxylase; 21 – gentisaat 1,2-dioxygenase (GDO); 22, maleylpyruvaat isomerase; 23, fumarylpyruvaat hydrolase; 24, methylnaftaleenhydroxylase (NDO); 25, hydroxymethylnaftaleendehydrogenase; 26, naftaldehydedehydrogenase; 27, 3-formylsalicylzuuroxidase; 28, hydroxyisophthalatedecarboxylase; 29, carbarylhydrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hydroxylase.
Afhankelijk van het organisme en zijn genetische samenstelling wordt het resulterende salicylzuur verder gemetaboliseerd, hetzij via de catecholroute met behulp van salicylaat-1-hydroxylase (S1H), hetzij via de gentisaatroute met behulp van salicylaat-5-hydroxylase (S5H) (Figuur 3). Omdat salicylzuur het belangrijkste intermediair is in het naftaleenmetabolisme (bovenste route), worden de stappen van salicylzuur naar het TCA-intermediair vaak de onderste route genoemd, en de genen zijn georganiseerd in één operon. Het is gebruikelijk dat de genen in het operon van de bovenste route (nah) en het operon van de onderste route (sal) worden gereguleerd door gemeenschappelijke regulerende factoren; bijvoorbeeld, NahR en salicylzuur fungeren als inductoren, waardoor beide operons naftaleen volledig kunnen metaboliseren (Phale et al., 2019, 2020).
Bovendien wordt catechol cyclisch gesplitst tot 2-hydroxymuconaatsemialdehyde via de meta-route door catechol 2,3-dioxygenase (C23DO) (Yen et al., 1988) en verder gehydrolyseerd door 2-hydroxymuconaatsemialdehydehydrolase tot 2-hydroxypent-2,4-dienoïnezuur. 2-hydroxypent-2,4-dienoaat wordt vervolgens omgezet in pyruvaat en acetaldehyde door een hydratase (2-oxopent-4-enoaathydratase) en een aldolase (4-hydroxy-2-oxopentanoaataldolase) en komt dan in de centrale koolstofroute terecht (Figuur 3). Als alternatief wordt catechol cyclisch gesplitst tot cis,cis-muconaat via de ortho-route door catechol 1,2-oxygenase (C12DO). Muconaatcycloisomerase, muconolactonisomerase en β-ketoadipaat-nollactonhydrolase zetten cis,cis-muconaat om in 3-oxoadipaat, dat via succinyl-CoA en acetyl-CoA in de centrale koolstofroute terechtkomt (Nozaki et al., 1968) (Figuur 3).
In de gentisaatroute (2,5-dihydroxybenzoaatroute) wordt de aromatische ring gesplitst door gentisaat 1,2-dioxygenase (GDO) om maleylpyruvaat te vormen. Dit product kan direct gehydrolyseerd worden tot pyruvaat en malaat, of het kan isomeriseren tot fumarylpyruvaat, dat vervolgens gehydrolyseerd kan worden tot pyruvaat en fumaraat (Larkin en Day, 1986). De keuze voor de alternatieve route is waargenomen bij zowel gramnegatieve als grampositieve bacteriën op biochemisch en genetisch niveau (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegatieve bacteriën (Pseudomonas) geven de voorkeur aan salicylzuur, een inductor van het naftaleenmetabolisme, dat ze decarboxyleren tot catechol met behulp van salicylaat 1-hydroxylase (Gibson en Subramanian, 1984). Daarentegen zet salicylaat-5-hydroxylase in grampositieve bacteriën (Rhodococcus) salicylzuur om in gentisinezuur, terwijl salicylzuur geen inductief effect heeft op de transcriptie van naftaleengenen (Grund et al., 1992) (Figuur 3).
Er is gerapporteerd dat soorten zoals Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas- en Mycobacterium-soorten monomethylnaftaleen of dimethylnaftaleen kunnen afbreken (Dean-Raymond en Bartha, 1975; Cane en Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Onder deze soorten is het afbraakpad van 1-methylnaftaleen en 2-methylnaftaleen door Pseudomonas sp. CSV86 duidelijk bestudeerd op biochemisch en enzymatisch niveau (Mahajan et al., 1994). 1-Methylnaftaleen wordt via twee routes gemetaboliseerd. Ten eerste wordt de aromatische ring (de ongesubstitueerde ring van methylnaftaleen) gehydroxyleerd tot cis-1,2-dihydroxy-1,2-dihydro-8-methylnaftaleen, dat vervolgens verder wordt geoxideerd tot methylsalicylaat en methylcatechol, waarna het na ringsplitsing de centrale koolstofroute ingaat (Figuur 3). Deze route wordt de "koolstofbronroute" genoemd. In de tweede "ontgiftingsroute" kan de methylgroep door NDO worden gehydroxyleerd tot 1-hydroxymethylnaftaleen, dat verder wordt geoxideerd tot 1-naftoezuur en als eindproduct in het kweekmedium wordt uitgescheiden. Studies hebben aangetoond dat stam CSV86 niet kan groeien op 1- en 2-naftoezuur als enige koolstof- en energiebron, wat het ontgiftingspad bevestigt (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). In 2-methylnaftaleen ondergaat de methylgroep hydroxylering door hydroxylase tot 2-hydroxymethylnaftaleen. Daarnaast ondergaat de ongesubstitueerde ring van de naftaleenring ringhydroxylering tot een dihydrodiol, dat in een reeks enzymgekatalyseerde reacties wordt geoxideerd tot 4-hydroxymethylcatechol en via de meta-ringsplitsingsroute in het centrale koolstofpad terechtkomt. Op vergelijkbare wijze werd gerapporteerd dat S. paucimobilis 2322 NDO gebruikt om 2-methylnaftaleen te hydroxyleren, dat vervolgens verder wordt geoxideerd tot methylsalicylaat en methylcatechol (Dutta et al., 1998).
Naftoezuren (gesubstitueerd/ongesubstitueerd) zijn ontgiftings-/biotransformatiebijproducten die ontstaan ​​tijdens de afbraak van methylnaftaleen, fenanthreen en anthraceen en die in het gebruikte kweekmedium terechtkomen. Er is gerapporteerd dat de bodemisolaat Stenotrophomonas maltophilia CSV89 in staat is om 1-naftoezuur als koolstofbron te metaboliseren (Phale et al., 1995). Het metabolisme begint met de dihydroxylering van de aromatische ring tot 1,2-dihydroxy-8-carboxynaftaleen. De resulterende diol wordt geoxideerd tot catechol via 2-hydroxy-3-carboxybenzylideenpyruvaat, 3-formylsalicylzuur, 2-hydroxyisophthalzuur en salicylzuur en komt via de meta-ringsplitsingsroute in de centrale koolstofroute terecht (Figuur 3).
Carbaryl is een naftylcarbamaat-pesticide. Sinds de Groene Revolutie in India in de jaren zeventig heeft het gebruik van chemische meststoffen en pesticiden geleid tot een toename van de uitstoot van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) door diffuse landbouwbronnen (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Naar schatting 55% (85.722.000 hectare) van het totale landbouwoppervlak in India wordt behandeld met chemische pesticiden. In de afgelopen vijf jaar (2015-2020) heeft de Indiase landbouwsector gemiddeld 55.000 tot 60.000 ton pesticiden per jaar gebruikt (Department of Cooperatives and Farmers Welfare, Ministry of Agriculture, Government of India, augustus 2020). In de noordelijke en centrale Gangesvlakte (de staten met de hoogste bevolkingsdichtheid) is het gebruik van pesticiden op gewassen wijdverbreid, waarbij insecticiden de boventoon voeren. Carbaryl (1-naftyl-N-methylcarbamaat) is een breedspectrum, matig tot zeer giftig carbamaat-insecticide dat in de Indiase landbouw gemiddeld 100-110 ton per jaar gebruikt. Het wordt vaak verkocht onder de handelsnaam Sevin en wordt gebruikt voor de bestrijding van insecten (bladluizen, vuurmieren, vlooien, mijten, spinnen en vele andere plagen in de buitenlucht) die verschillende gewassen aantasten (maïs, sojabonen, katoen, fruit en groenten). Sommige micro-organismen, zoals Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus en Arthrobacter, kunnen ook worden gebruikt voor de bestrijding van andere plagen. Er is gerapporteerd dat RC100 carbaryl kan afbreken (Larkin en Day, 1986; Chapalamadugu en Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha en Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Het afbraakpad van carbaryl is uitgebreid bestudeerd op biochemisch, enzymatisch en genetisch niveau in bodemisolaten van Pseudomonas sp. stammen C4, C5 en C6 (Swetha en Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). Het metabolische pad begint met de hydrolyse van de esterbinding door carbarylhydrolase (CH) om 1-naftol, methylamine en koolstofdioxide te vormen. 1-naftol wordt vervolgens omgezet in 1,2-dihydroxynaftaleen door 1-naftolhydroxylase (1-NH), dat verder wordt gemetaboliseerd via de centrale koolstofroute via salicylaat en gentisaat. Van sommige carbaryl-afbrekende bacteriën is gemeld dat ze het metaboliseren tot salicylzuur door splitsing van de catechol-orthoring (Larkin en Day, 1986; Chapalamadugu en Chaudhry, 1991). Opvallend is dat naftaleen-afbrekende bacteriën salicylzuur voornamelijk metaboliseren via catechol, terwijl carbaryl-afbrekende bacteriën er de voorkeur aan geven salicylzuur te metaboliseren via de gentisaatroute.
Naftaleensulfonzuur/disulfonzuur en naftylaminesulfonzuurderivaten kunnen worden gebruikt als tussenproducten bij de productie van azokleurstoffen, bevochtigingsmiddelen, dispergeermiddelen, enz. Hoewel deze verbindingen een lage toxiciteit voor de mens hebben, hebben cytotoxiciteitsonderzoeken aangetoond dat ze dodelijk zijn voor vissen, watervlooien en algen (Greim et al., 1994). Van vertegenwoordigers van het geslacht Pseudomonas (stammen A3, C22) is gerapporteerd dat ze het metabolisme initiëren door dubbele hydroxylering van de aromatische ring die de sulfonzuurgroep bevat, waarbij een dihydrodiol wordt gevormd. Dit wordt vervolgens omgezet in 1,2-dihydroxynaftaleen door spontane splitsing van de sulfietgroep (Brilon et al., 1981). Het resulterende 1,2-dihydroxynaftaleen wordt gekatalyseerd via de klassieke naftaleenroute, d.w.z. de catechol- of gentisaatroute (Figuur 4). Er is aangetoond dat aminonaftaleensulfonzuur en hydroxynaftaleensulfonzuur volledig kunnen worden afgebroken door gemengde bacteriële consortia met complementaire katabolische routes (Nortemann et al., 1986). Het is aangetoond dat één lid van het consortium aminonaftaleensulfonzuur of hydroxynaftaleensulfonzuur desulfureert door 1,2-dioxygenatie, terwijl aminosalicylaat of hydroxysalicylaat als een doodlopend metaboliet in het kweekmedium vrijkomt en vervolgens wordt opgenomen door andere leden van het consortium. Naftaleendisulfonzuur is relatief polair maar slecht biologisch afbreekbaar en kan daarom via verschillende routes worden gemetaboliseerd. De eerste desulfurering vindt plaats tijdens regioselectieve dihydroxylering van de aromatische ring en de sulfonzuurgroep; De tweede ontzwaveling vindt plaats tijdens de hydroxylering van 5-sulfosalicylzuur door salicylzuur-5-hydroxylase tot gentisinezuur, dat vervolgens in de centrale koolstofroute terechtkomt (Brilon et al., 1981) (Figuur 4). De enzymen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van naftaleen zijn ook verantwoordelijk voor het metabolisme van naftaleensulfonaat (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figuur 4. Metabolische routes voor de afbraak van naftaleensulfonaat. De nummers in de cirkels geven de enzymen weer die verantwoordelijk zijn voor het metabolisme van naftylsulfonaat, vergelijkbaar met/identiek aan de enzymen beschreven in figuur 3.
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAH's) met een laag moleculair gewicht (LMW-PAH's) zijn reduceerbaar, hydrofoob en slecht oplosbaar, en daardoor niet vatbaar voor natuurlijke afbraak. Aerobe micro-organismen kunnen ze echter oxideren door moleculaire zuurstof (O₂) op te nemen. Deze enzymen behoren voornamelijk tot de klasse van oxidoreductasen en kunnen verschillende reacties uitvoeren, zoals hydroxylering van aromatische ringen (mono- of dihydroxylering), dehydrogenering en splitsing van aromatische ringen. De producten die bij deze reacties ontstaan, bevinden zich in een hogere oxidatietoestand en worden gemakkelijker gemetaboliseerd via de centrale koolstofroute (Phale et al., 2020). Er is gerapporteerd dat de enzymen in de afbraakroute induceerbaar zijn. De activiteit van deze enzymen is zeer laag of verwaarloosbaar wanneer cellen worden gekweekt op eenvoudige koolstofbronnen zoals glucose of organische zuren. Tabel 3 vat de verschillende enzymen (oxygenasen, hydrolasen, dehydrogenasen, oxidases, enz.) samen die betrokken zijn bij het metabolisme van naftaleen en zijn derivaten.
Tabel 3. Biochemische kenmerken van enzymen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van naftaleen en zijn derivaten.
Radio-isotopenonderzoek (18O2) heeft aangetoond dat de incorporatie van moleculaire O2 in aromatische ringen door oxygenasen de belangrijkste stap is in het activeren van verdere biodegradatie van een verbinding (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). De incorporatie van één zuurstofatoom (O) van moleculaire zuurstof (O2) in het substraat wordt geïnitieerd door endogene of exogene monooxygenasen (ook wel hydroxylasen genoemd). Een ander zuurstofatoom wordt gereduceerd tot water. Exogene monooxygenasen reduceren flavine met NADH of NADPH, terwijl bij endomonooxygenasen flavine wordt gereduceerd door het substraat. De positie van de hydroxylering resulteert in diversiteit in de productvorming. Salicylaat-1-hydroxylase hydroxyliseert bijvoorbeeld salicylzuur op de C1-positie, waardoor catechol ontstaat. Aan de andere kant hydroxyliseert het multicomponent salicylaat 5-hydroxylase (dat reductase-, ferredoxine- en oxygenase-subeenheden bevat) salicylzuur op de C5-positie, waardoor gentisinezuur ontstaat (Yamamoto et al., 1965).
Dioxygenasen incorporeren twee O2-atomen in het substraat. Afhankelijk van de gevormde producten worden ze onderverdeeld in ringhydroxylerende dioxygenasen en ringsplitsende dioxygenasen. Ringhydroxylerende dioxygenasen zetten aromatische substraten om in cis-dihydrodiolen (bijvoorbeeld naftaleen) en komen veel voor bij bacteriën. Tot nu toe is aangetoond dat organismen die ringhydroxylerende dioxygenasen bevatten, kunnen groeien op verschillende aromatische koolstofbronnen. Deze enzymen worden geclassificeerd als NDO (naftaleen), tolueendioxygenase (TDO, tolueen) en bifenyldioxygenase (BPDO, bifenyl). Zowel NDO als BPDO kunnen de dubbele oxidatie en zijketenhydroxylering van diverse polycyclische aromatische koolwaterstoffen katalyseren (tolueen, nitrotolueen, xyleen, ethylbenzeen, naftaleen, bifenyl, fluoreen, indool, methylnaftaleen, naftaleensulfonaat, fenanthreen, anthraceen, acetofenon, enz.) (Boyd en Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO is een meercomponentensysteem dat bestaat uit een oxidoreductase, een ferredoxine en een oxygenasecomponent met een actief centrum (Gibson en Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). De katalytische eenheid van NDO bestaat uit een grote α-subeenheid en een kleine β-subeenheid, gerangschikt in een α3β3-configuratie. NDO behoort tot een grote familie van oxygenasen en de α-subeenheid ervan bevat een Rieske-site [2Fe-2S] en een mononucleair non-heemijzer, wat de substraatspecificiteit van NDO bepaalt (Parales et al., 1998). Typisch worden in één katalytische cyclus twee elektronen van de reductie van pyridinenucleotide overgedragen aan het Fe(II)-ion in de actieve site via een reductase, een ferredoxine en een Rieske-site. De reducerende equivalenten activeren moleculaire zuurstof, wat een voorwaarde is voor de dihydroxylering van het substraat (Ferraro et al., 2005). Tot nu toe zijn slechts enkele NDO's gezuiverd en gedetailleerd gekarakteriseerd uit verschillende stammen en is de genetische controle van de routes die betrokken zijn bij de afbraak van naftaleen uitgebreid bestudeerd (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ringsplitsende dioxygenasen (endo- of ortho-ringsplitsende enzymen en exodiol- of meta-ringsplitsende enzymen) werken in op gehydroxyleerde aromatische verbindingen. Zo is catechol-1,2-dioxygenase een ortho-ringsplitsend dioxygenase, terwijl catechol-2,3-dioxygenase een meta-ringsplitsend dioxygenase is (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Naast diverse oxygenasen zijn er ook verschillende dehydrogenasen die verantwoordelijk zijn voor de dehydrogenering van aromatische dihydrodiolen, alcoholen en aldehyden en die NAD+/NADP+ als elektronenacceptoren gebruiken. Dit zijn enkele van de belangrijke enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme (Gibson en Subramanian, 1984; Shaw en Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzymen zoals hydrolasen (esterasen, amidases) vormen een tweede belangrijke klasse enzymen die water gebruiken om covalente bindingen te verbreken en een brede substraatspecificiteit vertonen. Carbarylhydrolase en andere hydrolasen worden beschouwd als componenten van het periplasma (transmembraan) bij leden van Gram-negatieve bacteriën (Kamini et al., 2018). Carbaryl heeft zowel een amide- als een esterbinding; daarom kan het door zowel esterase als amidase worden gehydrolyseerd tot 1-naftol. Van carbaryl in Rhizobium rhizobium stam AC10023 en Arthrobacter stam RC100 is gerapporteerd dat het respectievelijk als esterase en amidase functioneert. Carbaryl in Arthrobacter stam RC100 functioneert ook als amidase. Er is aangetoond dat RC100 vier insecticiden uit de N-methylcarbamaatklasse hydrolyseert, zoals carbaryl, methomyl, mefenaminezuur en XMC (Hayaatsu et al., 2001). Er werd gerapporteerd dat CH in Pseudomonas sp. C5pp kan inwerken op carbaryl (100% activiteit) en 1-naftylacetaat (36% activiteit), maar niet op 1-naftylacetaatamide, wat erop wijst dat het een esterase is (Trivedi et al., 2016).
Biochemische studies, enzymregulatiepatronen en genetische analyses hebben aangetoond dat de genen voor de afbraak van naftaleen bestaan ​​uit twee induceerbare regulerende eenheden of "operons": nah (de "stroomopwaartse route", die naftaleen omzet in salicylzuur) en sal (de "stroomafwaartse route", die salicylzuur via catechol omzet in de centrale koolstofroute). Salicylzuur en zijn analogen kunnen als inductoren fungeren (Shamsuzzaman en Barnsley, 1974). In aanwezigheid van glucose of organische zuren wordt het operon onderdrukt. Figuur 5 toont de volledige genetische organisatie van de naftaleenafbraak (in operonvorm). Verschillende benoemde varianten/vormen van het nah-gen (ndo/pah/dox) zijn beschreven en blijken een hoge sequentiehomologie (90%) te hebben tussen alle Pseudomonas-soorten (Abbasian et al., 2016). De genen van de stroomopwaartse route van naftaleen waren over het algemeen in een consensusvolgorde gerangschikt, zoals weergegeven in Figuur 5A. Er werd ook gemeld dat een ander gen, nahQ, betrokken is bij het naftaleenmetabolisme en zich meestal tussen nahC en nahE bevindt, maar de precieze functie ervan moet nog worden opgehelderd. Op dezelfde manier werd het nahY-gen, verantwoordelijk voor naftaleengevoelige chemotaxis, bij sommige leden aan het distale uiteinde van het nah-operon gevonden. Bij Ralstonia sp. werd het U2-gen, dat codeert voor glutathion S-transferase (gsh), gevonden tussen nahAa en nahAb, maar dit had geen invloed op de kenmerken van het naftaleengebruik (Zylstra et al., 1997).
Figuur 5. Genetische organisatie en diversiteit waargenomen tijdens de afbraak van naftaleen bij bacteriële soorten; (A) Bovenste naftaleenroute, metabolisme van naftaleen tot salicylzuur; (B) Onderste naftaleenroute, salicylzuur via catechol naar de centrale koolstofroute; (C) salicylzuur via gentisaat naar de centrale koolstofroute.
Het "lagere pad" (sal-operon) bestaat doorgaans uit nahGTHINLMOKJ en zet salicylaat om in pyruvaat en acetaldehyde via het catechol-metaring-splitsingspad. Het nahG-gen (coderend voor salicylaathydroxylase) bleek geconserveerd te zijn aan het proximale uiteinde van het operon (Fig. 5B). In vergelijking met andere naftaleen-afbrekende stammen zijn de nah- en sal-operons in P. putida CSV86 tandem en zeer nauw verwant (ongeveer 7,5 kb). In sommige Gram-negatieve bacteriën, zoals Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 en P. putida AK5, wordt naftaleen gemetaboliseerd als een centraal koolstofmetaboliet via het gentisaatpad (in de vorm van het sgp/nag-operon). De genencassette wordt doorgaans weergegeven in de vorm nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, waarbij nagR (coderend voor een LysR-achtige regulator) zich aan het bovenste uiteinde bevindt (Figuur 5C).
Carbaryl komt in de centrale koolstofcyclus terecht via het metabolisme van 1-naftol, 1,2-dihydroxynaftaleen, salicylzuur en gentisinezuur (Figuur 3). Op basis van genetische en metabolische studies is voorgesteld om deze route te verdelen in "stroomopwaarts" (omzetting van carbaryl naar salicylzuur), "midden" (omzetting van salicylzuur naar gentisinezuur) en "stroomafwaarts" (omzetting van gentisinezuur naar intermediairen van de centrale koolstofcyclus) (Singh et al., 2013). Genomische analyse van C5pp (supercontig A, 76,3 kb) onthulde dat het gen mcbACBDEF betrokken is bij de omzetting van carbaryl naar salicylzuur, gevolgd door mcbIJKL bij de omzetting van salicylzuur naar gentisinezuur, en mcbOQP bij de omzetting van gentisinezuur naar intermediairen met een centrale koolstofketen (fumaraat en pyruvaat, Trivedi et al., 2016) (Figuur 6).
Er is gerapporteerd dat enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van aromatische koolwaterstoffen (waaronder naftaleen en salicylzuur) kunnen worden geïnduceerd door de overeenkomstige verbindingen en geremd door eenvoudige koolstofbronnen zoals glucose of organische zuren (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Van de verschillende metabolische routes van naftaleen en zijn derivaten zijn de regulerende kenmerken van naftaleen en carbaryl tot op zekere hoogte bestudeerd. Voor naftaleen worden genen in zowel de stroomopwaartse als de stroomafwaartse routes gereguleerd door NahR, een trans-activerende positieve regulator van het LysR-type. Deze is nodig voor de inductie van het nah-gen door salicylzuur en de daaropvolgende hoge expressie ervan (Yen en Gunsalus, 1982). Bovendien hebben studies aangetoond dat de integratieve gastheerfactor (IHF) en XylR (een sigma 54-afhankelijke transcriptionele regulator) ook cruciaal zijn voor de transcriptionele activering van genen in het naftaleenmetabolisme (Ramos et al., 1997). Studies hebben aangetoond dat enzymen van de catechol-meta-ringopeningsroute, met name catechol 2,3-dioxygenase, worden geïnduceerd in aanwezigheid van naftaleen en/of salicylzuur (Basu et al., 2006). Studies hebben aangetoond dat enzymen van de catechol-ortho-ringopeningsroute, met name catechol 1,2-dioxygenase, worden geïnduceerd in aanwezigheid van benzoëzuur en cis,cis-muconaat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
In stam C5pp coderen vijf genen, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR en mcbS, voor regulatoren die behoren tot de LysR/TetR-familie van transcriptieregulatoren die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van carbaryl. Het homologe gen mcbG bleek het nauwst verwant te zijn aan de LysR-achtige regulator PhnS (58% aminozuuridentiteit) die betrokken is bij het fenantreenmetabolisme in Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Het gen mcbH bleek betrokken te zijn bij de intermediaire route (omzetting van salicylzuur naar gentisinezuur) en behoort tot de LysR-achtige transcriptieregulator NagR/DntR/NahR in Pseudomonas en Burkholderia. Van leden van deze familie is bekend dat ze salicylzuur herkennen als een specifiek effectormolecuul voor de inductie van afbraakgenen. Aan de andere kant werden drie genen, mcbN, mcbR en mcbS, die behoren tot de transcriptionele regulatoren van het LysR- en TetR-type, geïdentificeerd in het stroomafwaartse pad (metabolieten van het gentisaat-centrale koolstofpad).
Bij prokaryoten zijn horizontale genoverdrachtsprocessen (verwerving, uitwisseling of overdracht) via plasmiden, transposons, profagen, genomische eilanden en integratieve conjugatieve elementen (ICE's) belangrijke oorzaken van plasticiteit in bacteriële genomen, wat leidt tot het verkrijgen of verliezen van specifieke functies/eigenschappen. Dit stelt bacteriën in staat zich snel aan te passen aan verschillende omgevingsomstandigheden, wat de gastheer potentiële adaptieve metabolische voordelen biedt, zoals de afbraak van aromatische verbindingen. Metabolische veranderingen worden vaak bereikt door het fijn afstemmen van afbraakoperons, hun regulatiemechanismen en enzymspecificiteiten, wat de afbraak van een breder scala aan aromatische verbindingen mogelijk maakt (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). De genencassettes voor de afbraak van naftaleen blijken zich te bevinden op een verscheidenheid aan mobiele elementen, zoals plasmiden (conjugatief en niet-conjugatief), transposons, genomen, ICE's en combinaties van verschillende bacteriesoorten (Figuur 5). In Pseudomonas G7 worden de nah- en sal-operons van plasmide NAH7 in dezelfde richting getranscribeerd en maken ze deel uit van een defect transposon dat transposase Tn4653 nodig heeft voor mobilisatie (Sota et al., 2006). In Pseudomonas-stam NCIB9816-4 werd het gen gevonden op het conjugatieve plasmide pDTG1 als twee operons (ongeveer 15 kb van elkaar verwijderd) die in tegengestelde richtingen werden getranscribeerd (Dennis en Zylstra, 2004). In Pseudomonas putida-stam AK5 codeert het niet-conjugatieve plasmide pAK5 voor het enzym dat verantwoordelijk is voor de afbraak van naftaleen via de gentisaatroute (Izmalkova et al., 2013). In Pseudomonas-stam PMD-1 bevindt het nah-operon zich op het chromosoom, terwijl het sal-operon zich op het conjugatieve plasmide pMWD-1 bevindt (Zuniga et al., 1981). In Pseudomonas stutzeri AN10 bevinden alle genen voor de afbraak van naftaleen (nah- en sal-operons) zich echter op het chromosoom en zijn vermoedelijk gerekruteerd via transpositie, recombinatie en herschikking (Bosch et al., 2000). In Pseudomonas sp. CSV86 bevinden de nah- en sal-operons zich in het genoom in de vorm van ICE (ICECSV86). De structuur wordt beschermd door tRNAGly, gevolgd door directe herhalingen die recombinatie-/aanhechtingsplaatsen aangeven (attR en attL) en een faagachtige integrase aan beide uiteinden van tRNAGly, waardoor de structuur vergelijkbaar is met het ICEclc-element (ICEclcB13 in Pseudomonas knackmusii voor de afbraak van chloorcatechol). Er is gerapporteerd dat genen op ICE kunnen worden overgedragen door conjugatie met een extreem lage overdrachtsfrequentie (10⁻⁸), waardoor afbraakeigenschappen worden overgedragen aan de ontvanger (Basu en Phale, 2008; Phale et al., 2019).
De meeste genen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van carbaryl bevinden zich op plasmiden. Arthrobacter sp. RC100 bevat drie plasmiden (pRC1, pRC2 en pRC300), waarvan twee conjugatieve plasmiden, pRC1 en pRC2, de enzymen coderen die carbaryl omzetten in gentisaat. De enzymen die betrokken zijn bij de omzetting van gentisaat in de centrale koolstofmetabolieten bevinden zich daarentegen op het chromosoom (Hayaatsu et al., 1999). Bacteriën van het geslacht Rhizobium, stam AC100, die gebruikt worden voor de omzetting van carbaryl in 1-naftol, bevatten plasmide pAC200, dat het cehA-gen draagt ​​dat codeert voor CH als onderdeel van het Tnceh-transposon, omgeven door insertie-elementachtige sequenties (istA en istB) (Hashimoto et al., 2002). In Sphingomonas-stam CF06 wordt aangenomen dat het gen voor de afbraak van carbaryl aanwezig is in vijf plasmiden: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 en pCF05. De DNA-homologie van deze plasmiden is hoog, wat wijst op het bestaan ​​van een genverdubbeling (Feng et al., 1997). In een carbaryl-afbrekende symbiont, bestaande uit twee Pseudomonas-soorten, bevat stam 50581 een conjugatief plasmide pCD1 (50 kb) dat codeert voor het mcd-carbarylhydrolase-gen, terwijl het conjugatieve plasmide in stam 50552 codeert voor een enzym dat 1-naftol afbreekt (Chapalamadugu en Chaudhry, 1991). In Achromobacter-stam WM111 bevindt het mcd-furadanhydrolase-gen zich op een plasmide van 100 kb (pPDL11). Dit gen is aangetoond op verschillende plasmiden (100, 105, 115 of 124 kb) in verschillende bacteriën uit verschillende geografische regio's (Parekh et al., 1995). In Pseudomonas sp. C5pp bevinden alle genen die verantwoordelijk zijn voor de afbraak van carbaryl zich in een genoom van 76,3 kb (Trivedi et al., 2016). Genoomanalyse (6,15 Mb) bracht de aanwezigheid van 42 MGE's en 36 GEI's aan het licht, waarvan 17 MGE's zich bevonden in supercontig A (76,3 kb) met een gemiddeld asymmetrisch G+C-gehalte (54-60 mol%), wat wijst op mogelijke horizontale genoverdracht (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 vertoont een vergelijkbare rangschikking van genen die carbaryl afbreken, maar deze genen bevinden zich op een plasmide (Zhu et al., 2019).
Naast metabolische efficiëntie op biochemisch en genomisch niveau vertonen micro-organismen ook andere eigenschappen of reacties, zoals chemotaxis, modificatie van het celoppervlak, compartimentalisatie, preferentiële benutting, productie van biosurfactanten, enz., die hen helpen om aromatische verontreinigende stoffen in verontreinigde omgevingen efficiënter te metaboliseren (Figuur 7).
Figuur 7. Verschillende cellulaire responsstrategieën van ideale aromatische koolwaterstofafbrekende bacteriën voor efficiënte biologische afbraak van vreemde verontreinigende stoffen.
Chemotactische responsen worden beschouwd als factoren die de afbraak van organische verontreinigende stoffen in heterogeen vervuilde ecosystemen bevorderen. (2002) toonde aan dat chemotaxis van Pseudomonas sp. G7 naar naftaleen de snelheid van naftaleenafbraak in aquatische systemen verhoogde. De wildtype stam G7 brak naftaleen veel sneller af dan een chemotaxis-deficiënte mutantstam. Het NahY-eiwit (538 aminozuren met membraantopologie) bleek samen met de genen van het metacleavage-pathway op het NAH7-plasmide te worden getranscribeerd, en net als chemotaxis-transducers lijkt dit eiwit te functioneren als een chemoreceptor voor naftaleenafbraak (Grimm en Harwood 1997). Een andere studie van Hansel et al. (2009) toonde aan dat het eiwit chemotactisch is, maar dat de afbraaksnelheid hoog is. (2011) toonden een chemotactische respons van Pseudomonas (P. putida) op gasvormig naftaleen aan, waarbij gasfasediffusie resulteerde in een constante stroom naftaleen naar de cellen, wat de chemotactische respons van de cellen controleerde. De onderzoekers maakten gebruik van dit chemotactische gedrag om microben te ontwikkelen die de afbraaksnelheid zouden verhogen. Studies hebben aangetoond dat chemosensorische routes ook andere cellulaire functies reguleren, zoals celdeling, celcyclusregulatie en biofilmvorming, en zo bijdragen aan de controle van de afbraaksnelheid. Het benutten van deze eigenschap (chemotaxis) voor efficiënte afbraak wordt echter belemmerd door verschillende knelpunten. De belangrijkste obstakels zijn: (a) verschillende paraloge receptoren herkennen dezelfde verbindingen/liganden; (b) het bestaan ​​van alternatieve receptoren, d.w.z. energetisch tropisme; (c) significante sequentieverschillen in de sensorische domeinen van dezelfde receptorfamilie; en (d) gebrek aan informatie over de belangrijkste bacteriële sensorproteïnen (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Soms produceert de biodegradatie van aromatische koolwaterstoffen meerdere metabolieten/tussenproducten, die chemotactisch kunnen zijn voor de ene groep bacteriën, maar afstotend voor andere, wat het proces verder compliceert. Om de interacties van liganden (aromatische koolwaterstoffen) met chemische receptoren te identificeren, hebben we hybride sensorproteïnen (PcaY, McfR en NahY) geconstrueerd door de sensor- en signaaldomeinen van Pseudomonas putida en Escherichia coli te fuseren, die respectievelijk de receptoren voor aromatische zuren, TCA-tussenproducten en naftaleen targeten (Luu et al., 2019).
Onder invloed van naftaleen en andere polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) ondergaan de structuur van het bacteriële membraan en de integriteit van de micro-organismen aanzienlijke veranderingen. Studies hebben aangetoond dat naftaleen de interactie van de acylketen verstoort door hydrofobe interacties, waardoor de zwelling en vloeibaarheid van het membraan toenemen (Sikkema et al., 1995). Om dit schadelijke effect tegen te gaan, reguleren bacteriën de membraanvloeibaarheid door de verhouding en vetzuursamenstelling tussen iso/anteiso vertakte vetzuren te veranderen en cis-onverzadigde vetzuren te isomeriseren tot de overeenkomstige trans-isomeren (Heipieper en de Bont, 1994). Bij Pseudomonas stutzeri, gekweekt op naftaleen, nam de verhouding tussen verzadigde en onverzadigde vetzuren toe van 1,1 tot 2,1, terwijl deze verhouding bij Pseudomonas JS150 toenam van 7,5 tot 12,0 (Mrozik et al., 2004). Wanneer Achromobacter KAs 3–5-cellen op naftaleen werden gekweekt, vertoonden ze celaggregatie rond naftaleenkristallen en een afname van de celoppervlaklading (van -22,5 tot -2,5 mV), gepaard gaande met cytoplasmatische condensatie en vacuolisatie, wat wijst op veranderingen in de celstructuur en celoppervlakte-eigenschappen (Mohapatra et al., 2019). Hoewel cellulaire/oppervlakteveranderingen direct verband houden met een betere opname van aromatische verontreinigende stoffen, zijn relevante bio-engineeringstrategieën nog niet grondig geoptimaliseerd. Manipulatie van de celvorm is zelden gebruikt om biologische processen te optimaliseren (Volke en Nikel, 2018). Het verwijderen van genen die de celdeling beïnvloeden, veroorzaakt veranderingen in de celmorfologie. In Bacillus subtilis is aangetoond dat het celseptumproteïne SepF betrokken is bij de septumvorming en nodig is voor de daaropvolgende stappen van de celdeling, maar het is geen essentieel gen. Verwijdering van genen die coderen voor peptideglycaanhydrolasen in Bacillus subtilis resulteerde in celverlenging, een verhoogde specifieke groeisnelheid en een verbeterde enzymproductiecapaciteit (Cui et al., 2018).
Er is gesuggereerd dat de afbraakroute van carbaryl gecompartmentaliseerd is om een ​​efficiënte afbraak van Pseudomonas-stammen C5pp en C7 te bewerkstelligen (Kamini et al., 2018). Er wordt verondersteld dat carbaryl via het septum van het buitenmembraan en/of via diffuse porinen naar de periplasmatische ruimte wordt getransporteerd. CH is een periplasmatisch enzym dat de hydrolyse van carbaryl tot 1-naftol katalyseert, dat stabieler, hydrofobischer en giftiger is. CH bevindt zich in het periplasma en heeft een lage affiniteit voor carbaryl, waardoor de vorming van 1-naftol wordt gecontroleerd en de accumulatie ervan in cellen wordt voorkomen en de toxiciteit ervan voor cellen wordt verminderd (Kamini et al., 2018). Het resulterende 1-naftol wordt via verdeling en/of diffusie door het binnenmembraan naar het cytoplasma getransporteerd en vervolgens door het hoog-affiniteitsenzym 1NH gehydroxyleerd tot 1,2-dihydroxynaftaleen voor verdere metabolisatie in de centrale koolstofroute.
Hoewel micro-organismen de genetische en metabolische capaciteiten bezitten om xenobiotische koolstofbronnen af ​​te breken, vormt de hiërarchische structuur van hun gebruik (d.w.z. preferentieel gebruik van eenvoudige boven complexe koolstofbronnen) een belangrijk obstakel voor biodegradatie. De aanwezigheid en het gebruik van eenvoudige koolstofbronnen onderdrukken de expressie van genen die coderen voor enzymen die complexe/niet-voorkeurskoolstofbronnen zoals PAK's afbreken. Een goed bestudeerd voorbeeld is dat wanneer glucose en lactose samen aan Escherichia coli worden gevoerd, glucose efficiënter wordt gebruikt dan lactose (Jacob en Monod, 1965). Van Pseudomonas is gerapporteerd dat het een verscheidenheid aan PAK's en xenobiotische verbindingen als koolstofbronnen kan afbreken. De hiërarchie van koolstofbrongebruik in Pseudomonas is organische zuren > glucose > aromatische verbindingen (Hylemon en Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Er is echter een uitzondering. Interessant genoeg kan Pseudomonas sp. CSV86 vertoont een unieke hiërarchische structuur die bij voorkeur aromatische koolwaterstoffen (benzoëzuur, naftaleen, enz.) gebruikt in plaats van glucose en aromatische koolwaterstoffen samen met organische zuren metaboliseert (Basu et al., 2006). In deze bacterie worden de genen voor de afbraak en het transport van aromatische koolwaterstoffen niet onderdrukt, zelfs niet in aanwezigheid van een tweede koolstofbron zoals glucose of organische zuren. Bij groei in een medium met glucose en aromatische koolwaterstoffen werd waargenomen dat de genen voor glucosetransport en -metabolisme werden onderdrukt, dat aromatische koolwaterstoffen werden gebruikt in de eerste logaritmische groeifase en dat glucose werd gebruikt in de tweede logaritmische groeifase (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). De aanwezigheid van organische zuren had daarentegen geen invloed op de expressie van het metabolisme van aromatische koolwaterstoffen, waardoor deze bacterie een geschikte kandidaat is voor biodegradatiestudies (Phale et al., 2020).
Het is algemeen bekend dat de biotransformatie van koolwaterstoffen oxidatieve stress en een verhoogde activiteit van antioxidatieve enzymen in micro-organismen kan veroorzaken. Inefficiënte afbraak van naftaleen, zowel in stationaire cellen als in de aanwezigheid van toxische stoffen, leidt tot de vorming van reactieve zuurstofsoorten (ROS) (Kang et al. 2006). Omdat naftaleenafbrekende enzymen ijzer-zwavelclusters bevatten, zal onder oxidatieve stress het ijzer in heem en ijzer-zwavelproteïnen oxideren, wat leidt tot proteïne-inactivering. Ferredoxine-NADP+-reductase (Fpr), samen met superoxide-dismutase (SOD), bemiddelt de omkeerbare redoxreactie tussen NADP+/NADPH en twee moleculen ferredoxine of flavodoxine, waardoor ROS worden weggevangen en het ijzer-zwavelcentrum onder oxidatieve stress wordt hersteld (Li et al. 2006). Er is gerapporteerd dat zowel Fpr als SodA (SOD) in Pseudomonas geïnduceerd kunnen worden door oxidatieve stress, en verhoogde SOD- en catalase-activiteiten werden waargenomen in vier Pseudomonas-stammen (O1, W1, As1 en G1) tijdens groei onder omstandigheden met toegevoegd naftaleen (Kang et al., 2006). Studies hebben aangetoond dat de toevoeging van antioxidanten zoals ascorbinezuur of ferro-ijzer (Fe2+) de groeisnelheid in naftaleen kan verhogen. Toen Rhodococcus erythropolis groeide in een naftaleenmedium, nam de transcriptie van oxidatieve stress-gerelateerde cytochroom P450-genen, waaronder sodA (Fe/Mn superoxide dismutase), sodC (Cu/Zn superoxide dismutase) en recA, toe (Sazykin et al., 2019). Vergelijkende kwantitatieve proteomische analyse van Pseudomonas-cellen gekweekt in naftaleen toonde aan dat de opregulatie van verschillende eiwitten die geassocieerd zijn met de oxidatieve stressrespons een stresscopingstrategie is (Herbst et al., 2013).
Er is aangetoond dat micro-organismen biosurfactanten produceren onder invloed van hydrofobe koolstofbronnen. Deze surfactanten zijn amfifiele oppervlakteactieve stoffen die aggregaten kunnen vormen aan olie-water- of lucht-watergrensvlakken. Dit bevordert pseudo-solubilisatie en vergemakkelijkt de adsorptie van aromatische koolwaterstoffen, wat resulteert in efficiënte biodegradatie (Rahman et al., 2002). Dankzij deze eigenschappen worden biosurfactanten veelvuldig gebruikt in diverse industrieën. De toevoeging van chemische surfactanten of biosurfactanten aan bacterieculturen kan de efficiëntie en snelheid van koolwaterstofafbraak verhogen. Van de biosurfactanten zijn rhamnolipiden, geproduceerd door Pseudomonas aeruginosa, uitgebreid bestudeerd en gekarakteriseerd (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Daarnaast omvatten andere typen biosurfactanten lipopeptiden (mucinen van Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (van Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg en Ron, 1999), trehalosedisaccharidelipiden van Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenine van Bacillus (Saraswathy en Hallberg, 2002), en surfactant van Bacillus subtilis (Siegmund en Wagner, 1991) en Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Van deze krachtige surfactanten is aangetoond dat ze de oppervlaktespanning verlagen van 72 dynes/cm tot minder dan 30 dynes/cm, waardoor een betere absorptie van koolwaterstoffen mogelijk wordt. Er is gerapporteerd dat Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia en andere bacteriesoorten verschillende rhamnolipide- en glycolipide-gebaseerde biosurfactanten kunnen produceren wanneer ze worden gekweekt in naftaleen- en methylnaftaleenmedia (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 kan de extracellulaire biosurfactant Biosur-Pm produceren wanneer deze wordt gekweekt op aromatische verbindingen zoals naftoezuur (Phale et al., 1995). De kinetiek van de Biosur-Pm-vorming toonde aan dat de synthese ervan een groei- en pH-afhankelijk proces is. Er werd vastgesteld dat de hoeveelheid Biosur-Pm die door cellen bij een neutrale pH werd geproduceerd hoger was dan die bij pH 8,5. Cellen gekweekt bij pH 8,5 waren hydrofobischer en hadden een hogere affiniteit voor aromatische en alifatische verbindingen dan cellen gekweekt bij pH 7,0. Bij Rhodococcus spp. N6, een hogere koolstof-stikstofverhouding (C:N) en ijzerbeperking zijn optimale omstandigheden voor de productie van extracellulaire biosurfactanten (Mutalik et al., 2008). Er zijn pogingen gedaan om de biosynthese van biosurfactanten (surfactinen) te verbeteren door stammen en fermentatie te optimaliseren. De concentratie surfactant in het kweekmedium is echter laag (1,0 g/L), wat een uitdaging vormt voor grootschalige productie (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Daarom zijn genetische modificatiemethoden gebruikt om de biosynthese te verbeteren. De modificatie ervan is echter moeilijk vanwege de grote omvang van het operon (ongeveer 25 kb) en de complexe biosynthetische regulatie van het quorum sensing-systeem (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Er zijn diverse genetische modificaties uitgevoerd in Bacillus-bacteriën, voornamelijk gericht op het verhogen van de surfactineproductie door vervanging van de promotor (srfA-operon), overexpressie van het surfactine-exporteiwit YerP en de regulerende factoren ComX en PhrC (Jiao et al., 2017). Deze genetische modificatiemethoden hebben echter slechts één of enkele genetische veranderingen teweeggebracht en zijn nog niet commercieel toepasbaar. Daarom is verder onderzoek naar op kennis gebaseerde optimalisatiemethoden noodzakelijk.
Onderzoek naar de biologische afbraak van PAK's wordt voornamelijk uitgevoerd onder standaard laboratoriumomstandigheden. Op verontreinigde locaties of in verontreinigde omgevingen is echter aangetoond dat veel abiotische en biotische factoren (temperatuur, pH, zuurstof, beschikbaarheid van voedingsstoffen, biologische beschikbaarheid van substraten, andere xenobiotica, remming door eindproducten, enz.) de afbraakcapaciteit van micro-organismen beïnvloeden.
Temperatuur heeft een significant effect op de biologische afbraak van PAK's. Naarmate de temperatuur stijgt, neemt de concentratie opgeloste zuurstof af, wat het metabolisme van aerobe micro-organismen beïnvloedt, aangezien deze moleculaire zuurstof nodig hebben als een van de substraten voor oxygenasen die hydroxylatie- of ringsplitsingsreacties uitvoeren. Vaak wordt opgemerkt dat een verhoogde temperatuur de oorspronkelijke PAK's omzet in giftigere verbindingen, waardoor de biologische afbraak wordt geremd (Muller et al., 1998).
Er is vastgesteld dat veel met PAK's verontreinigde locaties extreme pH-waarden hebben, zoals locaties die verontreinigd zijn met zuur mijnwater (pH 1-4) en locaties die verontreinigd zijn met alkalisch percolaatwater van aardgas- of kolenvergassingsinstallaties (pH 8-12). Deze omstandigheden kunnen het biologische afbraakproces ernstig beïnvloeden. Daarom wordt aanbevolen om, voordat micro-organismen worden ingezet voor bioremediatie, de pH aan te passen door geschikte chemicaliën toe te voegen (met een matig tot zeer laag oxidatie-reductiepotentieel), zoals ammoniumsulfaat of ammoniumnitraat voor alkalische bodems, of door te bekalken met calciumcarbonaat of magnesiumcarbonaat voor zure locaties (Bowlen et al. 1995; Gupta en Sar 2020).
De zuurstoftoevoer naar het getroffen gebied is de snelheidsbeperkende factor voor de biologische afbraak van PAK's. Vanwege de redoxomstandigheden in de omgeving vereisen in situ bioremediatieprocessen meestal de introductie van zuurstof uit externe bronnen (ploegen, beluchting en chemische toevoeging) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) toonden aan dat de toevoeging van magnesiumperoxide (een zuurstofafgevende verbinding) aan een verontreinigde aquifer BTEX-verbindingen effectief kan bioremedieren. Een andere studie onderzocht de in situ afbraak van fenol en BTEX in een verontreinigde aquifer door injectie van natriumnitraat en de aanleg van extractieputten om effectieve bioremediatie te bereiken (Bewley en Webb, 2001).