Huidig ​​adres: Keulen 50931, Duitsland, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
De neurodegeneratie bij mitochondriale ziekten wordt als onomkeerbaar beschouwd, omdat de metabolische plasticiteit van neuronen beperkt is. Het effect van mitochondriale disfunctie op de celautonomie van het neuronale metabolisme in het lichaam is echter nog onvoldoende begrepen. In dit onderzoek introduceren we het celspecifieke proteoom van Purkinje-neuronen met een progressief tekort aan oxidatieve fosforylatie (OXPHOS), veroorzaakt door een verstoring van de mitochondriale fusiedynamiek. We ontdekten dat mitochondriale disfunctie een ingrijpende verandering teweegbracht op het gebied van de proteomics, wat uiteindelijk leidde tot de sequentiële activering van specifieke metabolische programma's vóór de celdood. Onverwacht vonden we een duidelijke inductie van pyruvaatcarboxylase (PCx) en andere anti-verouderingsenzymen die de intermediairen van de citroenzuurcyclus aanvullen. Remming van PCx verergerde oxidatieve stress en neurodegeneratie, wat erop wijst dat atherosclerose een beschermend effect heeft op neuronen met een tekort aan OXPHOS. Het herstel van de mitochondriale fusie in terminaal gedegenereerde neuronen keert deze metabolische kenmerken volledig om, waardoor celdood wordt voorkomen. Onze bevindingen brengen voorheen onbekende mechanismen aan het licht die weerstand bieden tegen mitochondriale disfunctie en tonen aan dat neurodegeneratie zelfs in de late stadia van de ziekte omkeerbaar is.
De centrale rol van mitochondriën bij het in stand houden van het neuronale energiemetabolisme wordt benadrukt door de uitgebreide neurologische symptomen die gepaard gaan met mitochondriale ziekten bij de mens. De meeste van deze ziekten worden veroorzaakt door genmutaties die de mitochondriale genexpressie reguleren (1, 2) of door genvernietiging gerelateerd aan mitochondriale dynamiek, wat indirect de stabiliteit van mitochondriaal DNA (mtDNA) beïnvloedt (3, 4). Onderzoek met diermodellen heeft aangetoond dat als reactie op mitochondriale disfunctie in omliggende weefsels conservatieve metabolische routes (5-7) geactiveerd kunnen worden, wat belangrijke informatie oplevert voor een diepgaand begrip van de pathogenese van deze complexe ziekten. Daarentegen is ons begrip van de metabolische veranderingen in specifieke celtypen, veroorzaakt door het algemene falen van de mitochondriale adenosinetrifosfaat (ATP)-productie in de hersenen, fundamenteel (8), wat de noodzaak benadrukt om therapeutische doelen te identificeren die gebruikt kunnen worden om neurodegeneratie te voorkomen (9). Het gebrek aan informatie is het feit dat zenuwcellen over het algemeen worden beschouwd als cellen met een zeer beperkte metabolische flexibiliteit in vergelijking met de celtypen van omliggende weefsels (10). Aangezien deze cellen een centrale rol spelen in de coördinatie van de aanvoer van metabolieten naar neuronen om de synaptische transmissie te bevorderen en te reageren op letsel en ziekte, is het vermogen van gliacellen om het celmetabolisme aan te passen aan de uitdagende omstandigheden van hersenweefsel vrijwel uitsluitend voorbehouden aan gliacellen (11-14). Bovendien belemmert de inherente cellulaire heterogeniteit van hersenweefsel de studie van metabolische veranderingen die optreden in specifieke neuronale subgroepen. Daardoor is er weinig bekend over de precieze cellulaire en metabolische gevolgen van mitochondriale disfunctie in neuronen.
Om de metabolische gevolgen van mitochondriale disfunctie te begrijpen, isoleerden we Purkinje-neuronen (PN's) in verschillende stadia van neurodegeneratie, veroorzaakt door de vernietiging van de fusie van de buitenste mitochondriale membraan (Mfn2). Hoewel Mfn2-mutaties bij mensen geassocieerd worden met een vorm van erfelijke motorische sensorische neuropathie die bekend staat als Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), is de conditionele vernietiging van Mfn2 bij muizen een algemeen erkende methode voor het induceren van oxidatieve fosforylatie (OXPHOS)-disfunctie. De verschillende neuronale subtypes (16-19) en het resulterende neurodegeneratieve fenotype gaan gepaard met progressieve neurologische symptomen, zoals bewegingsstoornissen (18, 19) of cerebellaire ataxie (16). Door een combinatie van labelvrije kwantitatieve (LFQ) proteomics, metabolomics, beeldvorming en virologische methoden te gebruiken, tonen we aan dat progressieve neurodegeneratie de expressie van pyruvaatcarboxylase (PCx) en andere factoren die betrokken zijn bij arteriosclerose in PNs in vivo sterk induceert. Om de relevantie van deze bevinding te verifiëren, hebben we specifiek de expressie van PCx in Mfn2-deficiënte PNs verlaagd en vastgesteld dat deze ingreep de oxidatieve stress verergerde en de neurodegeneratie versnelde, waarmee wordt bewezen dat azoospermie leidt tot metabole adaptatie van celdood. Sterke expressie van MFN2 kan de terminale degeneratie van PNs met ernstig OXPHOS-tekort, massale consumptie van mitochondriaal DNA en een ogenschijnlijk verstoord mitochondriaal netwerk volledig herstellen, wat verder benadrukt dat deze vorm van neurodegeneratie zelfs in een gevorderd stadium van de ziekte, vóór celdood, kan herstellen.
Om de mitochondriën in Mfn2-knockout PNs te visualiseren, gebruikten we een muizenstam die Cre-afhankelijke mitochondriën in staat stelt om de Cre-expressie van geel fluorescerend eiwit (YFP) (mtYFP) (20) te beïnvloeden en controleerden we de mitochondriale morfologie in vivo. We ontdekten dat de vernietiging van het Mfn2-gen in PNs zou leiden tot de geleidelijke deling van het mitochondriale netwerk (Figuur S1A), en de vroegste verandering werd waargenomen op een leeftijd van 3 weken. Daarentegen begon de substantiële degeneratie van de PN-cellaag, zoals blijkt uit het verlies van Calbindine-immunokleuring, pas op een leeftijd van 12 weken (Figuur 1, A en B). De discrepantie in tijd tussen de vroegste veranderingen in de mitochondriale morfologie en het zichtbare begin van neuronale dood bracht ons ertoe de metabolische veranderingen te onderzoeken die worden veroorzaakt door mitochondriale disfunctie vóór de celdood. We hebben een op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) gebaseerde strategie ontwikkeld om YFP (YFP+)-expresserende PN's te isoleren (Figuur 1C), en in controlemuizen (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), hierna aangeduid als CTRL (Figuur S1B). De optimalisatie van de gatingstrategie op basis van de relatieve intensiteit van het YFP-signaal stelt ons in staat om het YFP+-lichaam (YFPhigh) van PN's te zuiveren van niet-PN's (YFPneg) (Figuur S1B) of vermoedelijke fluorescerende axon-/dendritische fragmenten (YFPlow; Figuur S1D, links), bevestigd door confocale microscopie (Figuur S1D, rechts). Om de identiteit van de geclassificeerde populatie te verifiëren, hebben we LFQ-proteomics en vervolgens principale componentenanalyse uitgevoerd, en vonden we een duidelijke scheiding tussen YFPhigh- en YFPneg-cellen (Figuur S1C). YFPhigh-cellen vertoonden een netto verrijking van bekende PN-markers (d.w.z. Calb1, Pcp2, Grid2 en Itpr3) (21, 22), maar geen verrijking van eiwitten die gewoonlijk tot expressie komen in neuronen of andere celtypen (Figuur 1D). Een vergelijking tussen monsters van geclassificeerde YFPhigh-cellen verzameld in onafhankelijke experimenten toonde een correlatiecoëfficiënt > 0,9, wat een goede reproduceerbaarheid tussen biologische replicaten aantoont (Figuur S1E). Samenvattend valideerden deze gegevens ons plan voor acute en specifieke isolatie van haalbare PN's. Omdat het gebruikte L7-cre-driversysteem mozaïekrecombinatie induceert in de eerste week na de geboorte (23), begonnen we muizen te selecteren uit de CTRL- en conditionele (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) groep om neuronen te verzamelen. Nadat de recombinatie is voltooid, wordt dit op een leeftijd van 4 weken Mfn2cKO genoemd. Als eindpunt kozen we een leeftijd van 8 weken, toen de PN-laag intact was ondanks de duidelijke mitochondriale fragmentatie (Figuur 1B en Figuur S1A). In totaal kwantificeerden we 3013 eiwitten, waarvan ongeveer 22% gebaseerd was op MitoCarta 2.0-annotaties op basis van het mitochondriale proteoom als mitochondriën (Figuur 1E) (24). De differentiële genexpressieanalyse die in week 8 werd uitgevoerd, toonde aan dat slechts 10,5% van alle eiwitten significante veranderingen vertoonde (Figuur 1F en Figuur S1F), waarvan 195 eiwitten omlaag gereguleerd waren en 120 eiwitten omhoog gereguleerd (Figuur 1F). Het is belangrijk op te merken dat de "innovatieve pathway-analyse" van deze dataset laat zien dat de differentieel tot expressie gebrachte genen voornamelijk tot een beperkte set van specifieke metabolische pathways behoren (Figuur 1G). Interessant genoeg bevestigt de downregulatie van pathways gerelateerd aan OXPHOS en calciumsignalering de inductie van mitochondriale disfunctie in fusie-deficiënte PNs, terwijl andere categorieën, die voornamelijk betrekking hebben op aminozuurmetabolisme, significant worden opgereguleerd. Dit is in lijn met de metabolische disfunctie die optreedt bij mitochondriale PNs.
(A) Representatieve confocale foto's van cerebellaire doorsneden van CTRL- en Mfn2cKO-muizen die progressief verlies van PN's (calbindine, grijs) laten zien; kernen werden tegengekleurd met DAPI. (B) Kwantificering van (A) (eenrichtingsvariantieanalyse, ***P<0,001; n = 4 tot 6 cirkels van drie muizen). (C) Experimentele workflow. (D) Heatmap-distributie van markers specifiek voor Purkinje (boven) en andere celtypen (midden). (E) Venn-diagram dat het aantal geïdentificeerde mitochondriale eiwitten in de geclassificeerde PN weergeeft. (F) Vulkaanplot van differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in Mfn2cKO-neuronen na 8 weken (significantiedrempelwaarde van 1,3). (G) De creativiteitspadanalyse toont de vijf belangrijkste opregulatie- (rood) en neerregulatie- (blauw) paden in de Mfn2cKO PN geclassificeerd na 8 weken. Het gemiddelde expressieniveau van elk gedetecteerd eiwit wordt weergegeven. Grijsschaal hittekaart: aangepaste P-waarde. ns, niet belangrijk.
Proteomicsgegevens toonden aan dat de eiwitexpressie van complexen I, III en IV geleidelijk afnam. Complexen I, III en IV bevatten alle essentiële mtDNA-gecodeerde subeenheden, terwijl complex II, dat alleen nucleair gecodeerd was, in principe onaangetast bleef (Figuur 2A en Figuur S2A). In overeenstemming met de proteomicsresultaten toonde immunohistochemie van cerebellaire weefselcoupes aan dat het niveau van de MTCO1 (mitochondriale cytochroom C-oxidase-subeenheid 1) subeenheid van complex IV in PN geleidelijk afnam (Figuur 2B). De mtDNA-gecodeerde subeenheid Mtatp8 was significant verminderd (Figuur S2A), terwijl het steady-state niveau van de nucleair gecodeerde ATP-synthase-subeenheid onveranderd bleef, wat consistent is met de bekende stabiele ATP-synthase-subassemblage F1-complex wanneer de mtDNA-expressie stabiel is. De vorming is consistent. Onderbreking (7). Evaluatie van het mtDNA-niveau in de gesorteerde Mfn2cKO PNs door middel van real-time polymerasekettingreactie (qPCR) bevestigde de geleidelijke afname van het aantal mtDNA-kopieën. Vergeleken met de controlegroep was op een leeftijd van 8 weken nog maar ongeveer 20% van het mtDNA-niveau behouden (Figuur 2C). In overeenstemming met deze resultaten werd confocale microscopiekleuring van Mfn2cKO PNs gebruikt om DNA te detecteren, wat de tijdsafhankelijke consumptie van mitochondriale nucleotiden aantoonde (Figuur 2D). We vonden dat slechts enkele kandidaten die betrokken zijn bij mitochondriale eiwitafbraak en stressrespons werden opgereguleerd, waaronder Lonp1, Afg3l2 en Clpx, en assemblagefactoren van het OXPHOS-complex. Er werden geen significante veranderingen in de niveaus van eiwitten die betrokken zijn bij apoptose gedetecteerd (Figuur S2B). Evenzo vonden we dat de mitochondriale en endoplasmatische reticulumkanalen die betrokken zijn bij calciumtransport slechts kleine veranderingen vertoonden (Figuur S2C). Bovendien werden bij de evaluatie van autofagie-gerelateerde eiwitten geen significante veranderingen gevonden, wat consistent is met de zichtbare inductie van autofagosomen die in vivo werd waargenomen door middel van immunohistochemie en elektronenmicroscopie (Figuur S3). De progressieve OXPHOS-disfunctie in PNs gaat echter gepaard met duidelijke ultrastructurele mitochondriale veranderingen. Mitochondriale clusters zijn te zien in de celkernen en dendritische bomen van Mfn2cKO PNs van 5 en 8 weken oud, en de structuur van het binnenmembraan heeft ingrijpende veranderingen ondergaan (Figuur S4, A en B). In overeenstemming met deze ultrastructurele veranderingen en een significante afname van mtDNA, toonde analyse van acute cerebrale cerebellaire plakjes met tetramethylrhodaminemethylester (TMRM) aan dat de mitochondriale membraanpotentiaal in Mfn2cKO PNs significant was verlaagd (Figuur S4C).
(A) Tijdsverloopanalyse van het expressieniveau van het OXPHOS-complex. Alleen eiwitten met P<0,05 na 8 weken worden meegenomen (tweeweg-ANOVA). Gestippelde lijn: Geen aanpassing ten opzichte van CTRL. (B) Links: Een voorbeeld van een cerebellaire doorsnede gelabeld met anti-MTCO1-antilichaam (schaalstreep, 20 μm). Het gebied dat wordt ingenomen door Purkinje-celkernen is geel gekleurd. Rechts: Kwantificering van MTCO1-niveaus (eenweg-variantieanalyse; n = 7 tot 20 cellen geanalyseerd van drie muizen). (C) qPCR-analyse van het aantal mtDNA-kopieën in de gesorteerde PN (eenweg-variantieanalyse; n = 3 tot 7 muizen). (D) Links: Een voorbeeld van een cerebellaire doorsnede gelabeld met een anti-DNA-antilichaam (schaalstreep, 20 μm). Het gebied dat wordt ingenomen door Purkinje-celkernen is geel gekleurd. Rechts: Kwantificering van mtDNA-laesies (eenrichtingsvariantieanalyse; n = 5 tot 9 cellen van drie muizen). (E) Een voorbeeld van een acute cerebellaire doorsnede met mitoYFP+ ​​Purkinje-cellen (pijl) in een whole-cell patch clamp-opname. (F) Kwantificering van de IV-curve. (G) Representatieve opnames van depolariserende stroominjectie in CTRL- en Mfn2cKO-Purkinje-cellen. Bovenste spoor: De eerste puls die een actiepotentiaal (AP) triggerde. Onderste spoor: Maximale AP-frequentie. (H) Kwantificering van postsynaptische spontane input (sPSP's). Het representatieve opnamespoor en de zoomverhouding ervan worden weergegeven in (I). Eenrichtingsvariantieanalyse analyseerde n = 5 tot 20 cellen van drie muizen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Representatieve sporen van spontane AP's opgenomen met behulp van de geperforeerde patch clamp-modus. Bovenste spoor: Maximale AP-frequentie. Onderste grafiek: detailweergave van een enkele actiepotentiaal. (K) Kwantificeer de gemiddelde en maximale actiepotentiaalfrequentie volgens (J). Mann-Whitney-toets; n = 5 cellen werden geanalyseerd van vier muizen. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM; niet significant.
Er werd duidelijke schade aan de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) geconstateerd in de 8 weken oude Mfn2cKO PN, wat erop wijst dat de fysiologische functie van de neuronen ernstig verstoord is. Daarom analyseerden we de passieve elektrische eigenschappen van OXPHOS-deficiënte neuronen op 4 tot 5 weken en 7 tot 8 weken door middel van whole-cell patch clamp-metingen in acute cerebellaire plakjes (Figuur 2E). Verrassend genoeg waren de gemiddelde rustmembraanpotentiaal en de ingangsweerstand van Mfn2cKO-neuronen vergelijkbaar met die van de controle, hoewel er subtiele verschillen tussen de cellen waren (Tabel 1). Evenzo werden er op 4 tot 5 weken leeftijd geen significante veranderingen in de stroom-spanningsrelatie (IV-curve) gevonden (Figuur 2F). Geen enkele Mfn2cKO-neuron van 7 tot 8 weken oud overleefde echter het IV-regime (hyperpolarisatiestap), wat aangeeft dat er in dit late stadium een ​​duidelijke gevoeligheid voor hyperpolarisatiepotentiaal bestaat. In tegenstelling hiermee worden de depolariserende stromen die herhaalde actiepotentiaal (AP)-ontladingen veroorzaken in Mfn2cKO-neuronen goed verdragen, wat aangeeft dat hun algehele ontladingspatronen niet significant verschillen van die van 8 weken oude controleneuronen (Tabel 1 en Figuur 2G). Evenzo waren de frequentie en amplitude van spontane postsynaptische stromen (sPSCs) vergelijkbaar met die van de controlegroep, en de frequentie van gebeurtenissen nam toe van 4 weken naar 5 weken naar 7 weken naar 8 weken met een vergelijkbare toename (Figuur 2, H en I). De periode van synaptische rijping in PNs (25). Vergelijkbare resultaten werden verkregen na het aanbrengen van patches op geperforeerde PNs. Deze configuratie voorkomt de mogelijke compensatie van cellulaire ATP-defecten, zoals zou kunnen gebeuren bij whole-cell patch clamp-registratie. In het bijzonder werden de rustmembraanpotentiaal en de spontane vuurfrequentie van Mfn2cKO-neuronen niet beïnvloed (Figuur 2, J en K). Samenvattend wijzen deze resultaten erop dat PNs met duidelijke OXPHOS-disfunctie goed kunnen omgaan met hoogfrequente ontladingspatronen, wat aangeeft dat er een compensatiemechanisme bestaat waarmee ze nagenoeg normale elektrofysiologische reacties kunnen behouden.
De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (eenrichtingsvariantieanalyse, Holm-Sidak's meervoudige vergelijkingstest; *P<0,05). Het eenheidsnummer wordt tussen haakjes aangegeven.
We wilden onderzoeken of er in de proteomics-dataset (Figuur 1G) een categorie is die pathways bevat die een ernstig tekort aan OXPHOS kunnen tegengaan, en zo verklaren waarom aangetaste PN een bijna normale elektrofysiologie kan behouden (Figuur 2, E tot K). Proteomics-analyse toonde aan dat de enzymen die betrokken zijn bij de afbraak van vertakte aminozuren (BCAA) significant verhoogd waren (Figuur 3A en Figuur S5A), en dat het eindproduct acetyl-CoA (CoA) of succinyl-CoA de tricarboxylaten in de TCA-cyclus (tricarboxylzuurcyclus) kan aanvullen. We ontdekten dat de hoeveelheid BCAA-transaminase 1 (BCAT1) en BCAT2 beide was toegenomen. Deze enzymen katalyseren de eerste stap van de BCAA-afbraak door glutamaat te genereren uit α-ketoglutaraat (26). Alle subeenheden waaruit het vertakte ketozuurdehydrogenase (BCKD)-complex bestaat, worden opgereguleerd (het complex katalyseert de daaropvolgende en irreversibele decarboxylatie van het resulterende BCAA-koolstofskelet) (Figuur 3A en Figuur S5A). Er werden echter geen duidelijke veranderingen in BCAA zelf gevonden in de gesorteerde PN, wat mogelijk te wijten is aan de verhoogde cellulaire opname van deze essentiële aminozuren of het gebruik van andere bronnen (glucose of melkzuur) ter aanvulling van de TCA-cyclus (Figuur S5B). PN's zonder OXPHOS vertoonden ook verhoogde glutamine-afbraak- en transaminatieactiviteiten op een leeftijd van 8 weken, wat kan worden weerspiegeld door de opregulatie van de mitochondriale enzymen glutaminase (GLS) en glutaminepyruvaattransaminase 2 (GPT2) (Figuur 3, A en C). Het is de moeite waard op te merken dat de opregulatie van GLS beperkt is tot de gesplicede isovorm glutaminase C (GLS-GAC) (de verandering van Mfn2cKO/CTRL is ongeveer 4,5-voudig, P = 0,05), en dat de specifieke opregulatie ervan in kankerweefsels de mitochondriale bio-energie kan ondersteunen. (27).
(A) De heatmap toont de vouwverandering in eiwitniveau voor de gespecificeerde route na 8 weken. (B) Voorbeeld van een cerebellaire plak gelabeld met anti-PCx-antilichaam (schaalstreep, 20 μm). De gele pijl wijst naar het Purkinje-cellichaam. (C) Analyse van de eiwitexpressie in de tijd, geïdentificeerd als een belangrijke kandidaat voor atherosclerose (meervoudige t-test, *FDR <5%; n = 3-5 muizen). (D) Boven: Een schematisch diagram dat de verschillende manieren laat zien waarop de gelabelde koolstof in de [1-13C]pyruvaat-tracer wordt opgenomen (d.w.z. via PDH of transarteriële route). Onder: Het viooldiagram toont het percentage enkelvoudig gelabelde koolstof (M1) dat wordt omgezet in asparaginezuur, citroenzuur en appelzuur na labeling van acute cerebellaire plakken met [1-13C]pyruvaat (gepaarde t-test; ** P <0,01). (E) Uitgebreide tijdgeschiedenisanalyse van het aangegeven pad. Houd alleen rekening met eiwitten met P<0,05 na 8 weken. Gestippelde lijn: geen correctiewaarde (tweeweg-variantieanalyse; * P <0,05; *** P <0,001). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM.
In onze analyse is BCAA-katabolisme een van de belangrijkste upregulatiepaden gebleken. Dit feit suggereert sterk dat het ventilatievolume dat de TCA-cyclus binnenkomt, mogelijk veranderd is in PN zonder OXPHOS. Dit kan een belangrijke vorm van neuronale metabole herbedrading vertegenwoordigen, die een directe impact kan hebben op de neuronale fysiologie en overleving tijdens het in stand houden van ernstige OXPHOS-disfunctie. In overeenstemming met deze hypothese vonden we dat het belangrijkste anti-atherosclerotische enzym PCx is opgereguleerd (Mfn2cKO/CTRL verandert ongeveer 1,5 keer; Figuur 3A), dat de omzetting van pyruvaat naar oxaloacetaat katalyseert (28), waarvan wordt aangenomen dat de expressie in hersenweefsel beperkt is tot astrocyten (29, 30). In overeenstemming met de proteomicsresultaten toonde confocale microscopie aan dat de PCx-expressie specifiek en significant verhoogd was in OXPHOS-deficiënte PNs, terwijl de PCx-reactiviteit voornamelijk beperkt was tot de aangrenzende Bergmann-gliacellen van de controle (Figuur 3B). Om de waargenomen opregulatie van PCx functioneel te testen, behandelden we acute cerebellaire plakjes met de tracer [1-13C]pyruvaat. Wanneer pyruvaat werd geoxideerd door pyruvaatdehydrogenase (PDH), verdween het isotooplabel, maar wordt het opgenomen in de intermediairen van de TCA-cyclus wanneer pyruvaat wordt gemetaboliseerd door vasculaire reacties (Figuur 3D). Ter ondersteuning van onze proteomicsgegevens observeerden we een groot aantal markers van deze tracer in het asparaginezuur van Mfn2cKO-plakjes, terwijl citroenzuur en appelzuur ook een matige trend vertoonden, hoewel niet significant (Figuur 3D).
In de dopamine-neuronen van MitoPark-muizen met mitochondriale disfunctie, veroorzaakt doordat dopamine-neuronen specifiek het gen voor de mitochondriale transcriptiefactor A (Tfam) vernietigen (Figuur S6B), was de PCx-expressie ook significant verhoogd (31), wat aangeeft dat het ontstaan ​​van acetonzuur-geïnduceerde arteriosclerose wordt gereguleerd tijdens de disfunctie van neuronale OXPHOS in het lichaam. Het is belangrijk op te merken dat is ontdekt dat unieke enzymen (32-34) die mogelijk tot expressie komen in neuronen die geassocieerd kunnen zijn met arteriosclerose, significant verhoogd zijn in PNs met een tekort aan OXPHOS, zoals propionyl-CoA-carboxylase (PCC-A), malonyl-CoA dat propionyl-CoA omzet in succinyl-CoA en mitochondriaal malaat-enzym 3 (ME3), waarvan de belangrijkste rol is om pyruvaat uit malaat terug te winnen (Figuur 3, A en C) (33, 35). Bovendien vonden we een significante toename van het Pdk3-enzym, dat PDH fosforyleert en zo inactiveert (36), terwijl er geen veranderingen werden waargenomen in het Pdp1-enzym dat PDH activeert of in het PDH-enzymcomplex zelf (Figuur 3A). Consistent hiermee was in Mern2cKO PNs de fosforylering van de α1-subeenheid (PDHE1α) van de pyruvaatdehydrogenase E1-component van het PDH-complex in Ser293 (bekend om de enzymactiviteit van PDH te remmen) verhoogd (Figuur S6C). Pyruvaat heeft geen toegang tot de bloedvaten.
Ten slotte ontdekten we dat de superroute van serine- en glycinebiosynthese, de gerelateerde mitochondriale folaatcyclus (1C) en prolinebiosynthese (Figuur 1G en Figuur S5C) allemaal significant opgereguleerd zijn, zoals gerapporteerd, tijdens het activeringsproces. De omliggende weefsels worden geactiveerd met mitochondriale disfunctie (5-7). Confocale analyse ter ondersteuning van deze proteomicsgegevens toonde aan dat in PN met ontbrekende OXPHOS, cerebellaire plakjes van 8 weken oude muizen werden blootgesteld aan serinehydroxymethyltransferase 2 (SHMT2), een sleutelenzym van de mitochondriale folaatcyclus. Significante immuunrespons (Figuur S5D). In acute cerebellaire plakjes die waren geïncubeerd met 13 CU-glucose, bevestigden metabolische traceringsexperimenten verder de opregulatie van serine- en prolinebiosynthese, wat aangeeft dat de flux van koolstofisoformen naar serine en proline is toegenomen (Figuur S5E). Aangezien de reacties die door GLS en GPT2 worden bevorderd verantwoordelijk zijn voor de synthese van glutamaat uit glutamine en de transaminatie tussen glutamaat en α-ketoglutaraat, duidt hun opregulatie erop dat OXPHOS-deficiënte neuronen een verhoogde behoefte aan glutamaat hebben. Dit kan gericht zijn op het in stand houden van de verhoogde biosynthese van proline (Figuur S5C). In tegenstelling tot deze veranderingen toonde een proteomische analyse van cerebellaire astrocyten van PN-specifieke Mfn2cKO-muizen aan dat deze routes (inclusief alle antiperoxidases) niet significant veranderden in expressie, wat aantoont dat deze metabolische omleiding selectief is voor afgebroken PN (Figuur S6, D tot G).
Samenvattend onthulden deze analyses significant verschillende patronen van temporele activering van specifieke metabolische routes in PNs. Hoewel abnormale mitochondriale functie in neuronen kan leiden tot vroege atherosclerose en IC-remodellering (Figuur 3E en Figuur S5C), en zelfs voorspelbare veranderingen in de expressie van I- en IV-complexen, worden de veranderingen in de de novo serinesynthese pas in de late stadia duidelijk. OXPHOS-disfunctie (Figuur 3E en Figuur S5C). Deze bevindingen definiëren een sequentieel proces waarbij de stress-geïnduceerde mitochondriale (IC-cyclus) en cytoplasmatische (serinebiosynthese) respons synergetisch samenwerkt met de toename van atherosclerose in de TCA-cyclus om het neuronale metabolisme te hervormen.
Acht weken oude OXPHOS-deficiënte PNs kunnen hoogfrequente excitatieactiviteit behouden en een significante metabole herverbinding ondergaan om mitochondriale disfunctie te compenseren. Deze ontdekking werpt een interessante mogelijkheid op: dat deze cellen zelfs nu nog therapeutische interventie kunnen ontvangen om neurodegeneratie te vertragen of te voorkomen. We hebben deze mogelijkheid onderzocht door middel van twee onafhankelijke interventies. In de eerste methode ontwierpen we een Cre-afhankelijke adeno-geassocieerde virus (AAV)-vector waarmee MFN2 selectief tot expressie kan worden gebracht in OXPHOS-deficiënte PNs in vivo (Figuur S7A). De AAV die MFN2 en het fluorescerende reportergen mCherry (Mfn2-AAV) codeert, werd geverifieerd in primaire neuronenculturen in vitro. Dit zorgde ervoor dat MFN2 op een Cre-afhankelijke manier tot expressie kwam en de mitochondriale morfologie herstelde, waardoor neuromutatie in Mfn2cKO-neuronen werd voorkomen (Figuur S7, B, D en E). Vervolgens voerden we in vivo-experimenten uit om stereotactisch 8 weken oude Mfn2-AAV toe te dienen aan de cerebellaire cortex van Mfn2cKO- en controlemuizen, en analyseerden we 12 weken oude muizen (Figuur 4A). De behandelde Mfn2cKO-muizen stierven (Figuur 1, A en B) (16). Virale transductie in vivo resulteerde in selectieve expressie van PN in sommige cerebellaire cirkels (Figuur S7, G en H). De injectie van de controle-AAV die alleen mCherry tot expressie brengt (Ctrl-AAV) had geen significant effect op de mate van neurodegeneratie bij Mfn2cKO-dieren. Daarentegen toonde de analyse van Mfn2cKO's die getransduceerd waren met Mfn2-AAV een significant beschermend effect op de PN-cellenlaag (Figuur 4, B en C). In het bijzonder lijkt de neuronendichtheid vrijwel niet te onderscheiden van die van de controledieren (Figuur 4, B en C, en Figuur S7, H en I). De expressie van MFN1, maar niet van MFN2, is even effectief in het voorkomen van neuronale sterfte (Figuur 4C en Figuur S7, C en F), wat aangeeft dat de expressie van ectopisch MFN1 het gebrek aan MFN2 effectief kan compenseren. Verdere analyse op het niveau van individuele PN's toonde aan dat Mfn2-AAV de ultrastructuur van mitochondriën grotendeels herstelde, de mtDNA-niveaus normaliseerde en de hoge expressie van de anti-angiogenese marker PCx ​​omkeerde (Figuur 4, C tot E). Visuele inspectie van de geredde Mfn2cKO-muizen in rusttoestand toonde aan dat hun houding en motorische symptomen (beweging S1 tot S3) verbeterd waren. Concluderend tonen deze experimenten aan dat vertraagde herintroductie van MFN2 in PN's met een ernstig tekort aan OXPHOS voldoende is om mtDNA-verbruik om te keren en atherosclerose te induceren, waardoor axonale degeneratie en neuronale sterfte in vivo worden voorkomen.
(A) Een schema dat het experimentele schema toont voor het injecteren van AAV dat codeert voor MFN2 wanneer de aangegeven metabolische route wordt geactiveerd. (B) Representatieve confocale beelden van 12 weken oude cerebellaire coupes, getransduceerd in 8 weken bij Mfn2cKO-muizen en gelabeld met anti-calbindine-antilichaam. Rechts: Schaal van axonvezels. De schaal van de axonzoom is 450 en 75 μm. (C) Links: Kwantificering van de Purkinje-celdichtheid in de AAV-transductielus (AAV+) (eenrichtingsvariantieanalyse; n = 3 muizen). Rechts: mtDNA-focusanalyse in getransduceerde PN in week 12 (ongepaarde t-test; n = 6 cellen van drie muizen). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Representatieve transmissie-elektronenmicroscopische beelden van PN's van Mfn2cKO-cerebellaire coupes, getransduceerd met de aangegeven virale vectoren. Het roze masker illustreert het gebied dat door dendrieten wordt ingenomen, en het gele stippelvierkant illustreert de vergroting rechts; n staat voor de celkern. Schaalbalk, 1 μm. (E) toont een voorbeeld van PCx-kleuring in PN getransduceerd na 12 weken. Schaalbalk, 20 μm. OE, overexpressie; FC, vouwverandering.
Ten slotte onderzochten we het belang van peroxidase-geïnduceerde celoverleving in PN's die een disfunctie van de oxidatieve fosforylering (OXPHOS) hebben ondergaan. We genereerden mCherry-coderend AAV-shRNA (short hairpin RNA) dat specifiek gericht is op muis-PCx-mRNA (AAV-shPCx), en injecteerden het virus of de scrambled controle (AAV-scr) in het cerebellum van Mfn2cKO-muizen. De injectie werd uitgevoerd in de vierde levensweek (Figuur 5A) om een ​​effectieve PCx-knockdown te bereiken gedurende de periode waarin de PCx-expressie toenam (Figuur 3C) en de PN-cellenlaag nog intact was (Figuur 1A). Het is belangrijk op te merken dat het uitschakelen van PCx (Figuur S8A) leidt tot een significante versnelling van de PN-dood, die beperkt blijft tot de geïnfecteerde ring (Figuur 5, B en C). Om het mechanisme van de metabolische effecten te begrijpen die worden veroorzaakt door PCx-upregulatie, bestudeerden we de redoxstatus van PNs nadat PCx-knockdown en de AAV-gemedieerde optische biosensor Grx1-roGFP2 gelijktijdig tot expressie werden gebracht (Figuur S8, B tot D) om de relatieve verandering van het peptide-redoxpotentieel van glutathion te evalueren (38). Vervolgens voerden we tweefotonfluorescentie-levensduurbeeldvormingsmicroscopie (FLIM) uit in acute hersenplakjes van 7 weken oude Mfn2cKO-muizen of controle-nestgenoten om potentiële veranderingen in de cytoplasmatische redoxstatus te detecteren na verificatie van de FLIM-condities (Figuur S8, E tot G). De analyse toonde een significante toename in de oxidatietoestand van een enkele Mfn2cKO PN zonder PCx-expressie, die verschilt van controleneuronen of Mfn2cKO PNs die alleen scrambled shRNA tot expressie brengen (Figuur 5, D en E). Toen de PCx-expressie werd verlaagd, nam het percentage Mfn2cKO PNs dat een sterk geoxideerde toestand vertoonde met meer dan drie keer toe (Figuur 5E), wat aangeeft dat de opregulatie van PCx de redoxcapaciteit van gedegenereerde neuronen in stand hield.
(A) Een schema dat het experimentele schema weergeeft voor het injecteren van AAV dat shPCx codeert wanneer de aangegeven metabolische route wordt geactiveerd. (B) Representatieve confocale foto's van cerebellaire secties van 8 weken oude Mfn2cKO-muizen, getransduceerd en gelabeld met anti-calcineurine-antilichaam op 4 weken. Schaalbalk, 450 μm. (C) Kwantificering van de Purkinje-celdichtheid in AAV-getransduceerde lussen (eenrichtingsvariantieanalyse; n = 3 tot 4 muizen). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM; ***P < 0,001. (D) Representatieve FLIM-afbeelding die de gemiddelde levensduur toont van 7 weken oude PN die de glutathion-redoxsensor Grx1-roGFP2 tot expressie brengen onder de gespecificeerde experimentele omstandigheden. LUT-ratio (look-up table ratio): overlevingstijdinterval (in picoseconden). Schaalbalk, 25 μm. (E) Het histogram toont de verdeling van de levensduurwaarden van Grx1-roGFP2 uit (D) (n=158 tot 368 cellen in twee muizen onder elke conditie). Het cirkeldiagram boven elk histogram toont het aantal cellen met significant langere (rood, geoxideerd) of kortere (blauw, gereduceerd) levensduurwaarden, die 1 SD van de gemiddelde levensduurwaarde in CTRL-AAV-scr overschrijden. (F) Het voorgestelde model toont het beschermende effect van de opregulatie van neuronale PCx.
Al met al laten de gegevens die we hier presenteren zien dat de hernieuwde expressie van MFN2 een gevorderd PN met ernstig OXPHOS-tekort, ernstige mtDNA-depletie en een extreem abnormale ista-achtige morfologie volledig kan herstellen, waardoor zelfs in een gevorderd stadium van de ziekte sprake is van continue progressie. Neurodegeneratie levert omkeerbaar bewijs voor het stadium vóór de celdood. Deze mate van metabolische flexibiliteit wordt verder benadrukt door het vermogen van neuronen om atherosclerose te induceren (een herbedrading van de TCA-cyclus), wat de PCx-expressie remt in PN's met een tekort aan OXPHOS en de celdood bevordert, waardoor het een beschermende rol speelt (Figuur 5F).
In deze studie hebben we aangetoond dat de respons van perifere neuronen (PN's) op disfunctie van de oxidatieve fosforylatie (OXPHOS) geleidelijk convergeert naar atherosclerose in de citroenzuurcyclus (TCA-cyclus) via een differentieel activeringspad dat wordt geactiveerd door metabolische programma's. We hebben de proteomische analyse bevestigd met diverse complementaire methoden en onthuld dat neuronen, wanneer ze worden blootgesteld aan ernstige mitochondriale disfunctie, een voorheen onbekende vorm van metabolische elasticiteit bezitten. Tot onze verrassing markeert het gehele herbedradingsproces niet noodzakelijkerwijs de uiteindelijke metabolische toestand die gepaard gaat met geleidelijke en onomkeerbare neurodegeneratie, maar onze gegevens suggereren dat het een functioneel compensatiemechanisme kan vormen voor het in stand houden van neuronen, zelfs in het stadium vóór celdood. Deze bevinding wijst erop dat neuronen een aanzienlijke mate van metabolische plasticiteit in het lichaam bezitten. Dit feit bewijst dat de latere herintroductie van MFN2 de expressie van belangrijke metabolische markers kan omkeren en PN-degeneratie kan voorkomen. Integendeel, het remt atherosclerose en versnelt de neurotransmissie.
Een van de meest fascinerende bevindingen in ons onderzoek is dat PNs zonder OXPHOS het metabolisme van de TCA-cyclus kunnen modificeren door enzymen te reguleren die specifiek atherosclerose stimuleren. Metabolische herschikking is een veelvoorkomend kenmerk van kankercellen, waarvan sommige afhankelijk zijn van glutamine om TCA-cyclus-intermediairen aan te vullen en zo reducerende equivalenten te produceren, die de ademhalingsketen aandrijven en de productie van lipide- en nucleotidebiosyntheseprecursoren in stand houden (39, 40). Een recente studie toonde aan dat in perifere weefsels met OXPHOS-disfunctie de herverbinding van het glutamine/glutamaatmetabolisme ook een prominent kenmerk is (5, 41), waarbij de richting van glutamine-instroom in de TCA-cyclus afhangt van de ernst van de OXPHOS-beschadiging (41). Er is echter een gebrek aan duidelijk bewijs voor enige gelijkenis met neuronale metabolische plasticiteit in het lichaam en de mogelijke relevantie ervan in de context van de ziekte. Uit een recent in vitro-onderzoek is gebleken dat primaire corticale neuronen glutamaatpools mobiliseren voor neurotransmissie, waardoor oxidatief metabolisme en atherosclerose worden bevorderd onder metabolische stressomstandigheden (42). Het is belangrijk op te merken dat onder farmacologische remming van het TCA-cyclusenzym succinaatdehydrogenase de pyruvaatcarboxylatie de synthese van oxaloacetaat in gekweekte cerebellaire korrelneuronen in stand houdt (34). De fysiologische relevantie van deze mechanismen voor hersenweefsel (waar atherosclerose zich voornamelijk in astrocyten zou bevinden) blijft echter van groot fysiologisch belang (43). In dit geval laten onze gegevens zien dat PNs die in het lichaam door OXPHOS beschadigd zijn, kunnen overschakelen op BCAA-afbraak en pyruvaatcarboxylatie, de twee belangrijkste bronnen voor de aanvulling van TCA-pool-intermediairen. Hoewel de veronderstelde bijdrage van BCAA-katabolisme aan het neuronale energiemetabolisme is voorgesteld, naast de rol van glutamaat en GABA bij neurotransmissie (44), is er nog steeds geen bewijs voor deze mechanismen in vivo. Daarom is het gemakkelijk te speculeren dat disfunctionele PNs automatisch de consumptie van TCA-tussenproducten, gedreven door het assimilatieproces, kunnen compenseren door atherosclerose te verhogen. In het bijzonder kan opregulatie van PCx nodig zijn om een ​​verhoogde vraag naar asparaginezuur te handhaven, wat wordt gesuggereerd in prolifererende cellen met mitochondriale disfunctie (45). Onze metabolomics-analyse bracht echter geen significante veranderingen aan het licht in het steady-state niveau van asparaginezuur in Mfn2cKO PNs (Figuur S6A), wat vermoedelijk de verschillende metabolische benutting van asparaginezuur tussen prolifererende cellen en postmitotische neuronen weerspiegelt. Hoewel het exacte mechanisme van PCx-upregulatie in disfunctionele neuronen in vivo nog moet worden opgehelderd, hebben we aangetoond dat deze premature respons een belangrijke rol speelt bij het handhaven van de redoxstatus van neuronen, zoals aangetoond in FLIM-experimenten op cerebellaire plakjes. In het bijzonder kan het voorkomen dat PNs PCx upreguleren leiden tot een meer geoxideerde toestand en de celdood versnellen. De activering van BCAA-afbraak en de carboxylering van pyruvaat zijn geen manieren om de perifere weefsels van mitochondriale disfunctie te karakteriseren (7). Daarom lijken ze een prioritair kenmerk te zijn van OXPHOS-deficiënte neuronen, zelfs als het niet het enige kenmerk is, wat belangrijk is voor neurodegeneratie.
Cerebellaire aandoeningen vormen een heterogene vorm van neurodegeneratieve ziekte die zich meestal manifesteert als ataxie en vaak PNs beschadigt (46). Deze neuronenpopulatie is bijzonder kwetsbaar voor mitochondriale disfunctie, omdat hun selectieve degeneratie bij muizen voldoende is om veel van de motorische symptomen te reproduceren die kenmerkend zijn voor menselijke spinocerebellaire ataxie (16, 47, 48). Volgens rapporten is een transgeen muismodel met een gemuteerd gen geassocieerd met menselijke spinocerebellaire ataxie en vertoont het mitochondriale disfunctie (49, 50), wat het belang onderstreept van het bestuderen van de gevolgen van OXPHOS-deficiëntie bij PNPH. Daarom is het bijzonder geschikt om deze unieke neuronenpopulatie effectief te isoleren en te bestuderen. Gezien het feit dat PNs zeer gevoelig zijn voor druk en slechts een klein deel uitmaken van de totale cerebellaire celpopulatie, blijft de selectieve scheiding ervan als hele cellen voor veel op omics gebaseerde studies een uitdaging. Hoewel het bijna onmogelijk is om absolute afwezigheid van contaminatie met andere celtypen te bereiken (vooral volwassen weefsels), hebben we een effectieve dissociatiestap gecombineerd met FACS om een ​​voldoende aantal levensvatbare neuronen te verkrijgen voor daaropvolgende proteomische analyse. We hebben een vrij hoge eiwitdekking (ongeveer 3000 eiwitten) vergeleken met de bestaande dataset van het hele cerebellum (51). Door de levensvatbaarheid van de gehele cellen te behouden, stelt de methode die we hier beschrijven ons niet alleen in staat om de veranderingen in de metabolische routes in de mitochondriën te controleren, maar ook om de veranderingen in hun cytoplasmatische tegenhangers te controleren. Dit vormt een aanvulling op het gebruik van mitochondriale membraanlabels om celtypen te verrijken. De nieuwe methode voor het aantal mitochondriën in complexe weefsels (52, 53) is relevant. De methode die we beschrijven is niet alleen relevant voor de studie van Purkinje-cellen, maar kan eenvoudig worden toegepast op elk celtype om metabolische veranderingen in zieke hersenen te onderzoeken, inclusief andere modellen van mitochondriale disfunctie.
Ten slotte hebben we een therapeutisch venster geïdentificeerd tijdens dit metabole herschikkingproces dat de belangrijkste tekenen van cellulaire stress volledig kan omkeren en neuronale degeneratie kan voorkomen. Het begrijpen van de functionele implicaties van de hier beschreven herbedrading kan daarom fundamentele inzichten verschaffen in mogelijke behandelingen voor het behoud van neuronale vitaliteit tijdens mitochondriale disfunctie. Toekomstig onderzoek gericht op het ontleden van veranderingen in het energiemetabolisme in andere hersenceltypen is nodig om de toepasbaarheid van dit principe op andere neurologische aandoeningen volledig te onthullen.
MitoPark-muizen zijn eerder beschreven (31). C57BL/6N-muizen met loxP-flankerende Mfn2-genen zijn eerder beschreven (18) en gekruist met L7-Cre-muizen (23). De resulterende dubbel heterozygote nakomelingen werden vervolgens gekruist met homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP-muizen om Purkinje-specifieke gen-knockouts voor Mfn2 te genereren (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). In een subset van kruisingen werd het Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allel (stop-mtYFP) geïntroduceerd door middel van extra kruisingen (20). Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met Europese, nationale en institutionele richtlijnen en goedgekeurd door Landesamt für Natur und Verbraucherschutz, Noordrijn-Westfalen, Duitsland. Dierproeven volgen ook de richtlijnen van de European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Na het toedienen van anesthesie aan de baarmoederhals van de zwangere vrouw, wordt het muizenembryo geïsoleerd (E13). De cortex werd gedissecteerd in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) aangevuld met 10 mM Hepes en vervolgens overgebracht naar Dulbecco's Modified Eagle's Medium met papaïne (20 U/ml) en cysteïne (1 μg/ml). Het weefsel werd geïncubeerd in DMEM en gedissocieerd door enzymatische digestie. Dit gebeurde gedurende 20 minuten bij 37 °C, waarna het mechanisch werd vermalen in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum. Cellen werden uitgezaaid op glazen dekglaasjes gecoat met polylysine met een dichtheid van 2 × 10⁶ cellen per kweekschaal van 6 cm of met een dichtheid van 0,5 × 10⁵ cellen/cm² voor beeldanalyse. Na 4 uur werd het medium vervangen door serumvrij Neurobasal-medium met 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax. De neuronen werden vervolgens gedurende het hele experiment op 37 °C en 5% CO2 gehouden en eenmaal per week gevoed. Om recombinatie in vitro te induceren, werd 3 μl (24-wells kweekplaat) of 0,5 μl (24-wells plaat) van de volgende AAV9-virusvector gebruikt om de neuronen op de tweede dag in vitro te behandelen: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, catalogusnummer 105530-AAV9) en AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, catalogusnummer 105545-AAV9).
Het complementaire DNA van muis Mfn1 en Mfn2 (verkregen van respectievelijk Addgene-plasmide #23212 en #23213) is gemarkeerd met de V5-sequentie (GKPIPNPLLGLDST) aan het C-uiteinde en is in frame gefuseerd met mCherry via de T2A-sequentie. Grx1-roGFP2 is een geschenk van Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Door de tdTomato-cassette te vervangen met behulp van conventionele kloonmethoden, werd de cassette gesubkloneerd in de pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-backbone (Addgene-referentienummer 28306) om de vectoren pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 en pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 te genereren. Een vergelijkbare strategie werd gebruikt om de controlevector pAAV-CAG-FLEX-mCherry te genereren. Om het AAV-shPCx-construct te genereren, is een plasmide AAV-vector (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) vereist, die de DNA-sequentie bevat die codeert voor het shRNA gericht op muis PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Onder controle van de U6-promotor wordt mCherry gebruikt onder controle van de CMV-promotor. De productie van de hulp-AAV-vectoren werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant (Cell Biolabs). Kortom, gebruik een transferplasmide met het gen dat codeert voor mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) of Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), evenals het coderende AAV1-capside-eiwit en het accessoire-eiwit. Verpakkingsplasmide met behulp van de calciumfosfaatmethode. Het ruwe virussupernatant werd verkregen door vries-dooi-cycli in een droogijs/ethanolbad en de cellen werden gelyseerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De AAV-vector werd gezuiverd door discontinue iodixanol-gradiënt-ultracentrifugatie (24 uur bij 32.000 tpm en 4 °C) en geconcentreerd met behulp van een Amicon ultra-15 centrifugaalfilter. De genoomtiter van AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 10¹³ genoomkopieën (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX werd gemeten zoals eerder beschreven (54) met behulp van real-time kwantitatieve PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 10¹³ GC/ml) en AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 10¹² GC/ml).
Primaire neuronen werden losgeschraapt in ijskoud 1x PBS, gecentrifugeerd en vervolgens gehomogeniseerd in een lysisbuffer van 0,5% Triton X-100 / 0,5% natriumdeoxycholaat/PBS met fosfatase- en proteaseremmer (Roche). Eiwitkwantificatie werd uitgevoerd met behulp van de bicinchoninezuurtest (Thermo Fisher Scientific). De eiwitten werden vervolgens gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese en daarna overgebracht op een polyvinylideenfluoridemembraan (GE Healthcare). Niet-specifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd en geïncubeerd met het primaire antilichaam (zie Tabel S1 voor details) in 5% melk in TBST (Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween), gevolgd door wasstappen en incubatie met het secundaire antilichaam in TBST. Incubeer gedurende de nacht met het primaire antilichaam bij +4°C. Na het wassen werd het secundaire antilichaam gedurende 2 uur bij kamertemperatuur aangebracht. Vervolgens werd dezelfde blot bevestigd door incubatie met een anti-β-actine-antilichaam. Detectie door omzetting naar chemiluminescentie en versterking van chemiluminescentie (GE Healthcare).
De neuronen die eerder op glazen dekglaasjes waren gezaaid, werden op het aangegeven tijdstip gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA)/PBS. De dekglaasjes werden eerst gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100/PBS en vervolgens met blokkeerbuffer [3% bovine serumalbumine (BSA)/PBS]. Op de tweede dag werden de dekglaasjes gewassen met blokkeerbuffer en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het geschikte fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichaam. Ten slotte werden de monsters grondig gewassen met PBS, na kleuring met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), en vervolgens gefixeerd op een microscoopglaasje met Aqua-Poly/Mount.
Muizen (mannetjes en vrouwtjes) werden verdoofd door middel van een intraperitoneale injectie met ketamine (130 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) en subcutaan met het analgeticum carprofen (5 mg/kg). Vervolgens werden ze in een stereotactisch instrument (Kopf) geplaatst, voorzien van een verwarmingskussen. De schedel werd blootgelegd en met een tandartsboor werd het deel van de cerebellaire cortex dat overeenkomt met het mis-bot (van lambda: staart 1.8, lateraal 1, overeenkomend met lobuli IV en V) dunner gemaakt. Met een gebogen injectienaald werd voorzichtig een klein gaatje in de schedel gemaakt om de onderliggende bloedvaten niet te beschadigen. Vervolgens wordt de dunne, getrokken glazen capillair langzaam in het microgaatje ingebracht (van -1,3 tot -1 aan de ventrale zijde van de dura mater), en wordt 200 tot 300 nl AAV met handmatige spuiten (Narishige) meerdere malen onder lage druk in de micro-injector (Narishige) geïnjecteerd gedurende een periode van 10 tot 20 minuten. Na de infusie wordt de capillair nog 10 minuten op zijn plaats gehouden om het virus volledig te laten verspreiden. Nadat de capillairen zijn verwijderd, wordt de huid zorgvuldig gehecht om wondontsteking te minimaliseren en het dier te laten herstellen. De dieren werden gedurende enkele dagen na de operatie behandeld met pijnstillers (caspofen), gedurende welke tijd hun fysieke conditie nauwlettend werd gecontroleerd, waarna ze op het aangegeven tijdstip werden geëuthanaseerd. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met Europese, nationale en institutionele richtlijnen en werden goedgekeurd door de Landesamt für Natur de Umwelt und Verbraucherschutz, Noordrijn-Westfalen, Duitsland.
De dieren werden verdoofd met ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg), en het hart werd eerst geperfuseerd met 0,1 M PBS en vervolgens met 4% PFA in PBS. Het weefsel werd gedissecteerd en 's nachts gefixeerd in 4% PFA/PBS bij 4°C. Met een vibrerend mes (Leica Microsystems GmbH, Wenen, Oostenrijk) werden sagittale coupes (50 μm dik) gemaakt van de gefixeerde hersenen in PBS. Tenzij anders vermeld, werd de kleuring van vrij zwevende coupes uitgevoerd zoals hierboven beschreven (13) bij kamertemperatuur en onder roeren. Kort gezegd werden de verkregen coupes eerst gepermeabiliseerd met 0,5% Triton X-100/PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur; voor sommige epitopen (Pcx en Shmt2) werden de coupes in plaats van deze stap gedurende 25 minuten verhit in tris-EDTA-buffer bij 80°C (pH 9). Vervolgens werden de coupes 's nachts bij 4°C onder roeren geïncubeerd met het primaire antilichaam (zie Tabel S1) in blokkeerbuffer (3% BSA/PBS). De volgende dag werden de coupes gewassen met blokkeerbuffer en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met het geschikte, met fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichaam. Ten slotte werden de coupes grondig gewassen met PBS, nagekleurd met DAPI en vervolgens gefixeerd met AquaPolymount op een microscoopglaasje.
Een laserscanning confocale microscoop (TCS SP8-X of TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) uitgerust met een witte laser en een 405 diode ultravioletlaser werd gebruikt om het monster af te beelden. Door de fluorofoor aan te stralen en het signaal op te vangen met een hybride detector (HyDs), werd de LAS-X-software gebruikt om gestapelde beelden te verzamelen conform Nyquist-sampling in sequentiële modus: voor niet-kwantitatieve panelen worden zeer dynamische signalen (bijvoorbeeld in somatische cellen en dendrieten) gebruikt (mtYFP). HyD wordt gebruikt om het aantal PNs te detecteren in BrightR-modus. Gating van 0,3 tot 6 ns wordt toegepast om de achtergrondruis te verminderen.
Realtime beeldvorming van gesorteerde cellen. Na sortering in Neurobasal-A medium met 1% B27-supplement en 0,5 mM GlutaMax werden de cellen direct uitgezaaid op met poly-l-lysine gecoate glasplaatjes (μ-Slide8 Well, Ibidi, catalogusnummer 80826). Deze werden vervolgens gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2 bewaard om de cellen te laten bezinken. Realtime beeldvorming werd uitgevoerd met een Leica SP8 laserscanning confocale microscoop, uitgerust met een witte laser, HyD, een 63× [numerieke apertuur (NA) van 1,4] olie-objectief en een verwarmingsplaat.
De muis werd snel verdoofd met koolstofdioxide en onthoofd. De hersenen werden snel uit de schedel verwijderd en in sagittale secties gesneden van 200 μm dik (voor 13C-labelingexperimenten) of 275 μm dik (voor tweefotonenexperimenten). Deze secties werden gevuld met de volgende materialen: 125 mM ijskoud, koolstofverzadigd (95% O2 en 5% CO2) laag Ca2+ kunstmatig hersenvocht (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 0,5 mM CaCl2 en 3,5 mM MgCl2 (osmotische druk van 310 tot 330 mmol). Breng de verkregen hersenplakjes over naar een pre-incubatiekamer met een hogere Ca2+-concentratie in ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 en 2,0 mM MgCl2-medium) met een pH van 7,4 en een calciumconcentratie van 310 tot 320 mmol.
Tijdens het beeldvormingsproces werden de coupes naar een speciale beeldvormingsruimte verplaatst en werd het experiment uitgevoerd onder continue ACSF-perfusie bij een constante temperatuur van 32° tot 33°C. Voor de beeldvorming van de coupes werd een multiphoton laserscanmicroscoop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) gebruikt, uitgerust met een Leica 25x objectief (NA 0,95, water) en een Ti:Saffierlaser (Chameleon Vision II, Coherent). De FLIM-module (PicoHarp300, PicoQuant) werd eveneens gebruikt.
FLIM van Grx1-roGFP2. De veranderingen in de cytoplasmatische redoxstatus van PN's werden gemeten met behulp van tweefoton-FLIM in sagittale hersenplakken, waarbij de Grx1-roGFP2-biosensor zich richtte op PN's. In de PN-laag werd het acquisitieveld geselecteerd op ongeveer 50 tot 80 μm onder het oppervlak van de plak om ervoor te zorgen dat er een levensvatbare PN aanwezig was (dat wil zeggen, geen kralenstructuur of neuronale morfologische veranderingen langs de dendrieten) en dat de dubbelpositieve roGFP2-sensor en AAV die shRNA PCx of de controlesequentie codeert (beide co-expressie van mCherry) aanwezig waren. Er werden beelden met één stapel verzameld met 2x digitale zoom [excitatiegolflengte: 890 nm; 512 nm, 512 pixels]. Detectie: interne HyD, fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-filtergroep en beeldmiddeling binnen 2 tot 3 minuten worden gebruikt om ervoor te zorgen dat er voldoende fotonen worden verzameld (in totaal 1000 fotonen) voor curvefitting. De gevoeligheid van de Grx1-roGFP2-sonde en de verificatie van de FLIM-condities werden uitgevoerd door de levensduurwaarde van roGFP2 te monitoren bij toevoeging van exogene 10 mM H2O2 aan de perfusie-ACSF (om oxidatie te maximaliseren, wat resulteert in een langere levensduur), en vervolgens bij toevoeging van 2 mM dithiothreitol (om de mate van reductie te minimaliseren, wat resulteert in een kortere levensduur) (Figuur S8, D tot G). Gebruik de FLIMfit 5.1.1-software om de verkregen resultaten te analyseren, pas de enkelvoudige exponentiële vervalcurve van de gehele afbeelding aan de gemeten IRF (instrumentresponsfunctie) aan, en χ² is ongeveer 1. Om de levensduur van een enkele PN te berekenen, werd handmatig een masker rond de zenuw getekend en werd de gemiddelde levensduur in elk masker gebruikt voor kwantificering.
Analyse van het mitochondriale potentiaal. Nadat de acute sectie gedurende 30 minuten was geïncubeerd met 100 nM TMRM, rechtstreeks toegevoegd aan de geperfuseerde ACSF, werden de veranderingen in het mitochondriale potentiaal van PNs gemeten met een tweefotonmicroscoop. TMRM-beeldvorming werd uitgevoerd door de probe te exciteren bij 920 nm en intern HyD (tetramethylrhodamine-isothiocyanaat: 585/40 nm) te gebruiken om signalen te verzamelen; met dezelfde excitatiegolflengte maar met een ander intern HyD (FITC: 525/50) werd mtYFP in beeld gebracht. Gebruik de Image Calculator-plug-in van ImageJ om het mitochondriale potentiaal op celniveau te evalueren. Kort gezegd wordt de plug-invergelijking: signaal = min (mtYFP, TMRM) gebruikt om het mitochondriale gebied te identificeren dat het TMRM-signaal in Purkinje Somali vertoont in de single-stack confocale afbeelding van het corresponderende kanaal. Vervolgens wordt het pixeloppervlak in het resulterende masker gekwantificeerd en daarna genormaliseerd op de overeenkomstige drempelwaarde van de single-stack afbeelding van het mtYFP-kanaal om de mitochondriale fractie te verkrijgen die het mitochondriale potentieel weergeeft.
De afbeelding is gedecovoleerd met de software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Voor de gescande afbeeldingen van tegels is een montage van één tegel gemaakt met behulp van het automatische samenvoegingsalgoritme van de LAS-X-software. Na beeldkalibratie zijn ImageJ en Adobe Photoshop gebruikt om de afbeelding verder te bewerken en de helderheid en het contrast gelijkmatig aan te passen. Adobe Illustrator is gebruikt voor de grafische voorbereiding.
mtDNA-focusanalyse. Het aantal mtDNA-laesies werd gekwantificeerd op cerebellaire coupes die waren gelabeld met antilichamen tegen DNA met behulp van een confocale microscoop. Voor elk cellichaam en elke celkern werd een doelgebied gecreëerd, en het betreffende oppervlak werd berekend met behulp van de Multi Measure-plug-in (ImageJ-software). Het oppervlak van de celkern werd afgetrokken van het oppervlak van het cellichaam om het cytoplasmatische oppervlak te verkrijgen. Ten slotte werd de Analyze Particles-plug-in (ImageJ-software) gebruikt om automatisch de cytoplasmatische DNA-punten te kwantificeren die mtDNA aangeven op de drempelafbeelding, en de verkregen resultaten werden genormaliseerd ten opzichte van het PN-gemiddelde van CTRL-muizen. De resultaten worden uitgedrukt als het gemiddelde aantal nucleosiden per cel.
Analyse van eiwitexpressie. Gebruik de Image Calculator-plug-in van ImageJ om de eiwitexpressie in PN op celniveau te evalueren. Kort gezegd wordt in de enkellaagse confocale afbeelding van het corresponderende kanaal, via de vergelijking: signaal = min (mtYFP, antilichaam), het mitochondriale gebied geïdentificeerd dat immunoreactiviteit vertoont voor een bepaald antilichaam in Purkinje-cellen. Vervolgens wordt het pixeloppervlak in het resulterende masker gekwantificeerd en genormaliseerd op de corresponderende drempelwaarde van de enkellaagse afbeelding van het mtYFP-kanaal om de mitochondriale fractie van het weergegeven eiwit te verkrijgen.
Analyse van de Purkinje-celdichtheid. De Cell Counter-plug-in van ImageJ werd gebruikt om de Purkinje-dichtheid te bepalen door het aantal getelde Purkinje-cellen te delen door de lengte van de cerebellaire ring die door de getelde cellen wordt ingenomen.
Monsterpreparatie en -verzameling. De hersenen van de controlegroep en Mfn2cKO-muizen werden gefixeerd in 2% PFA/2,5% glutaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB). Vervolgens werden coronale coupes gemaakt met behulp van ciliaten (Leica Mikrosysteme GmbH, Wenen, Oostenrijk) (dikte 50 tot 60 μm). Daarna werden de coupes gefixeerd in PB-buffer met 1% os-tetraoxide en 1,5% kaliumferrocyanide bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. De coupes werden driemaal gewassen met gedestilleerd water en vervolgens gekleurd met 70% ethanol met 1% uranylacetaat gedurende 20 minuten. De coupes werden vervolgens gedehydrateerd in een reeks alcoholoplossingen en ingebed in Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxyhars (Electron Microscopy Sciences, catalogusnummer 14040) tussen met siliconen gecoate glasplaatjes. Ten slotte werden ze gedurende 48 uur bij 60 °C in een oven gepolymeriseerd. Het gebied van de cerebellaire cortex werd geselecteerd en er werden ultradunne coupes van 50 nm dik gesneden met een Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wenen, Oostenrijk). Deze coupes werden geplaatst op een koperen raster van 2×1 mm, bedekt met een polystyreenfilm. De coupes werden gekleurd met een oplossing van 4% uranylacetaat in water gedurende 10 minuten, meerdere malen gewassen met water, vervolgens met Reynolds loodcitraat in water gedurende 10 minuten en daarna nogmaals meerdere malen gewassen met water. Microfoto's werden gemaakt met een transmissie-elektronenmicroscoop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) met behulp van een TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitale camera (TVIPS GmbH, Gauting, VS).
Bij muizen die geïnfecteerd waren met AAV, werd de hersenen gescheiden en in een sagittale doorsnede van 1 mm dik gesneden. Het cerebellum werd onderzocht met een fluorescentiemicroscoop om de met AAV geïnfecteerde ring (d.w.z. de mCherry-expressie) te identificeren. Alleen experimenten waarbij AAV-injectie resulteerde in een zeer hoge transductie-efficiëntie van de Purkinje-cellenlaag (d.w.z. vrijwel de gehele laag) in ten minste twee opeenvolgende cerebellaire ringen werden gebruikt. De met AAV getransduceerde lus werd microgedissecteerd voor fixatie gedurende de nacht (4% PFA en 2,5% glutaraldehyde in 0,1 M cocoaatbuffer) en verder verwerkt. Voor EPON-inbedding werd het gefixeerde weefsel gewassen met 0,1 M natriumcocoaatbuffer (Applichem) en gedurende 4 uur geïncubeerd met 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) in 0,1 M natriumcocoaatbuffer (Applichem), waarna gedurende 2 uur werd gewassen. Dit werd 3 keer herhaald met 0,1 M cocamidebuffer. Vervolgens werd de ethanolreeks in oplopende concentraties gebruikt om elke ethanoloplossing gedurende 15 minuten bij 4°C te incuberen om het weefsel te dehydrateren. Het weefsel werd overgebracht naar propyleenoxide en een nacht geïncubeerd in EPON (Sigma-Aldrich) bij 4°C. Plaats het weefsel gedurende 2 uur in verse EPON bij kamertemperatuur en embed het vervolgens gedurende 72 uur bij 62°C. Gebruik een ultramicrotoom (Leica Microsystems, UC6) en een diamantmes (Diatome, Biel, Zwitserland) om ultradunne coupes van 70 nm te snijden en kleur deze gedurende 15 minuten bij 37°C met 1,5% uranylacetaat en vervolgens gedurende 4 minuten met een loodcitraatoplossing. De elektronenmicroscopische beelden werden gemaakt met een JEM-2100 Plus transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL) uitgerust met Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) en DigitalMicrograph-software (Gatan). Voor de analyse werden elektronenmicroscopische beelden verkregen met een digitale zoom van 5000× of 10.000×.
Morfologische analyse van mitochondriën. Voor alle analyses werden de contouren van individuele mitochondriën handmatig getekend in digitale afbeeldingen met behulp van ImageJ-software. Verschillende morfologische parameters werden geanalyseerd. De mitochondriale dichtheid werd uitgedrukt als een percentage, verkregen door het totale mitochondriale oppervlak van elke cel te delen door het cytoplasma-oppervlak (cytoplasma-oppervlak = celoppervlak - celkern-oppervlak) × 100. De rondheid van mitochondriën werd berekend met de formule [4π∙(oppervlakte/omtrek²)]. De ista-morfologie van mitochondriën werd geanalyseerd en verdeeld in twee categorieën ("tubulair" en "blaasvormig") op basis van hun belangrijkste vormen.
Analyse van het aantal en de dichtheid van autofagosomen/lysosomen. Gebruik ImageJ-software om handmatig de contouren van elk autofagosoom/lysosoom in de digitale afbeelding te tekenen. Het oppervlak van de autofagosomen/lysosomen wordt uitgedrukt als een percentage, berekend door het totale oppervlak van de autofagosoom/lysosoomstructuur van elke cel te delen door het cytoplasma-oppervlak (cytoplasma-oppervlak = celoppervlak - kernoppervlak) × 100. De dichtheid van autofagosomen/lysosomen wordt berekend door het totale aantal te delen door het aantal autofagosoom/lysosoomstructuren per cel (uitgedrukt in cytoplasma-oppervlak) (cytoplasma-oppervlak = celoppervlak - kernoppervlak).
Labeling voor acute secties en preparatie van monsters. Voor experimenten waarbij glucoselabeling vereist is, moeten de acute hersenplakjes worden overgebracht naar een pre-incubatiekamer. Deze kamer bevat verzadigde koolstof (95% O2 en 5% CO2), een Ca2+-rijke ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 en 2,0 mM MgCl2, aangepast tot pH 7,4 en 310 tot 320 mOsm), waarin glucose 13C6-glucose-substitutie is (Eurisotop, catalogusnummer CLM-1396). Voor experimenten waarbij pyruvaatlabeling vereist is, breng de acute hersenplakjes over naar ACSF met een hogere Ca2+-concentratie (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 en voeg 2,0 mM MgCl2 toe, stel de pH in op 7,4 en de osmolariteit op 310 tot 320 mOsm), en voeg 1 mM 1-[1-13C]pyruvaat toe (Eurisotop, catalogusnummer CLM-1082). Incubeer de coupes gedurende 90 minuten bij 37 °C. Aan het einde van het experiment werden de coupes snel gewassen met een waterige oplossing (pH 7,4) die 75 mM ammoniumcarbonaat bevatte, en vervolgens gehomogeniseerd in een mengsel van 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): methanol: water. Nadat de coupes 30 minuten op ijs waren geïncubeerd, werden de monsters gedurende 10 minuten bij 21.000 g gecentrifugeerd bij 4 °C, en de heldere supernatant werd gedroogd in een SpeedVac-concentrator. De resulterende gedroogde metabolietenpellet werd bewaard bij -80 °C tot de analyse.
Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie-analyse van 13C-gelabelde aminozuren. Voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS)-analyse werd de metabolietenpellet geresuspendeerd in 75 μl LC-MS-kwaliteit water (Honeywell). Na centrifugatie bij 21.000 g gedurende 5 minuten bij 4 °C werd 20 μl van de geklaarde supernatant gebruikt voor aminozuurfluxanalyse, terwijl de rest van het extract onmiddellijk werd gebruikt voor anionanalyse (zie hieronder). De aminozuuranalyse werd uitgevoerd met behulp van het eerder beschreven benzoylchloride-derivatiseringsprotocol (55, 56). In de eerste stap werd 10 μl 100 mM natriumcarbonaat (Sigma-Aldrich) toegevoegd aan 20 μl metabolietenextract, en vervolgens werd 10 μl 2% benzoylchloride (Sigma-Aldrich) toegevoegd aan de LC-kwaliteit ACN. Het monster werd kort gevortexd en vervolgens gedurende 5 minuten bij 21.000 g gecentrifugeerd bij 20 °C. De heldere supernatant werd overgebracht naar een autosamplerflesje van 2 ml met een conisch glazen inzetstuk (volume 200 μl). De monsters werden geanalyseerd met behulp van het Acquity iClass ultra-high performance LC-systeem (Waters) gekoppeld aan de Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) hoge-resolutie precisie massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). Voor de analyse werd 2 μl van het gedederivatiseerde monster geïnjecteerd in een 100 × 1,0 mm high-strength silica T3-kolom (Waters) met deeltjesgrootte 1,8 μm. De stroomsnelheid bedroeg 100 μl/min en het buffersysteem bestond uit buffer A (10 mM ammoniumformiaat en 0,15% mierenzuur in water) en buffer B (ACN). De gradiënt is als volgt: 0%B bij 0 minuten; 0%B. 0 tot 15% B bij 0 tot 0,1 minuten; 15 tot 17% B bij 0,1 tot 0,5 minuten; B bij 17 tot 55% bij 0,5 tot 14 minuten; B bij 55 tot 70% bij 14 tot 14,5 minuten; bij 14,5 tot 70 tot 100% B bij 18 minuten; 100% B bij 18 tot 19 minuten; 100 tot 0% B bij 19 tot 19,1 minuten; 0% B bij 19,1 tot 28 minuten (55, 56). De QE-HF massaspectrometer werkt in de positieve ionisatiemodus met een massabereik van m/z (massa/ladingsverhouding) van 50 tot 750. De toegepaste resolutie is 60.000, de gain control (AGC) ionentarget is 3×10⁶ en de maximale ionisatietijd is 100 milliseconden. De verwarmde elektrospray-ionisatie (ESI) bron werkt met een spuitspanning van 3,5 kV, een capillaire temperatuur van 250 °C, een sheath-luchtstroom van 60 AU (arbitrary units) en een auxiliary-luchtstroom van 20 AU. De S-lens is ingesteld op 60 AU.
Anionchromatografie-MS-analyse van met 13C gelabelde organische zuren. Het resterende metabolietenprecipitaat (55 μl) werd geanalyseerd met behulp van een Dionex ionchromatografiesysteem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) gekoppeld aan een QE-HF massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). Kort gezegd werd 5 μl metabolietenextract geïnjecteerd in een Dionex IonPac AS11-HC kolom met HPLC (2 mm × 250 mm, deeltjesgrootte 4 μm, Thermo Fisher Scientific) in de push-in partial loop-modus met een vulverhouding van 1. Een Dionex IonPac AG11-HC guardkolom (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific) werd gebruikt. De kolomtemperatuur werd gehandhaafd op 30 °C en de autosampler was ingesteld op 6 °C. Er werd een kaliumhydroxidepatroon met gedeïoniseerd water gebruikt om een ​​kaliumhydroxidegradiënt te genereren via de eluentgenerator. Scheiding van metabolieten bij een stroomsnelheid van 380 μl/min, met toepassing van de volgende gradiënt: 0 tot 3 minuten, 10 mM KOH; 3 tot 12 minuten, 10 tot 50 mM KOH; 12 tot 19 minuten, 50 tot 100 mM KOH; 19 tot 21 minuten, 100 mM KOH; 21 tot 21,5 minuten, 100 tot 10 mM KOH. De kolom werd gedurende 8,5 minuten opnieuw geëquilibreerd met 10 mM KOH.
De geëlueerde metabolieten worden na de kolom gecombineerd met een isopropanol-supplementstroom van 150 μl/min en vervolgens naar een hogeresolutie-massaspectrometer geleid die in de negatieve ionisatiemodus werkt. De MS meet het massabereik van m/z 50 tot 750 met een resolutie van 60.000. De AGC is ingesteld op 1 × 10⁶ en de maximale ionisatietijd is 100 ms. De verwarmde ESI-bron werd bediend met een spuitspanning van 3,5 kV. De overige instellingen van de ionenbron zijn als volgt: capillaire temperatuur 275 °C; stroom van het omhullende gas, 60 AU; stroom van het hulpgas, 20 AU bij 300 °C, en S-lensinstelling op 60 AU.
Gegevensanalyse van 13C-gelabelde metabolieten. Gebruik TraceFinder-software (versie 4.2, Thermo Fisher Scientific) voor de analyse van isotoopverhoudingen. De identiteit van elke verbinding werd geverifieerd met een betrouwbare referentieverbinding en onafhankelijk geanalyseerd. Om isotoopverrijkingsanalyse uit te voeren, werd het oppervlak van het geëxtraheerde ionchromatogram (XIC) van elk 13C-isotoop (Mn) geëxtraheerd uit [M + H]+, waarbij n het koolstofgetal van de doelverbinding is, gebruikt voor de analyse van aminozuren, of [MH]+ voor de analyse van anionen. De massa-nauwkeurigheid van XIC is minder dan vijf delen per miljoen, en de nauwkeurigheid van de retentietijd (RT) is 0,05 minuten. De verrijkingsanalyse wordt uitgevoerd door de verhouding van elk gedetecteerd isotoop tot de som van alle isotopen van de corresponderende verbinding te berekenen. Deze verhoudingen worden weergegeven als percentages voor elk isotoop, en de resultaten worden uitgedrukt als molaire procentuele verrijking (MPE), zoals eerder beschreven (42).
De bevroren neuronenpellet werd gehomogeniseerd in ijskoud 80% methanol (v/v), gevortexd en gedurende 30 minuten bij -20°C geïncubeerd. Het monster werd opnieuw gevortexd en gedurende 30 minuten bij +4°C geroerd. Het monster werd gedurende 5 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 21.000 g, waarna het resulterende supernatant werd verzameld en gedroogd met een SpeedVac-concentrator bij 25°C voor verdere analyse. Zoals hierboven beschreven, werd LC-MS-analyse uitgevoerd op de aminozuren van de gesorteerde cellen. Met behulp van TraceFinder (versie 4.2, Thermo Fisher Scientific) werd de data-analyse uitgevoerd met behulp van de monoisotopische massa van elke verbinding. Kwantielnormalisatie van de metabolietdata werd uitgevoerd met behulp van het preprocessCore-softwarepakket (57).
Preparatie van de coupes. De muis werd snel verdoofd met koolstofdioxide en onthoofd. De hersenen werden snel uit de schedel verwijderd en met een met ijs gevuld vibrerend mes (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Duitsland) in sagittale coupes van 300 tot 375 μm gesneden. Koude koolstofvergassing (95% O2 en 5% CO2) Lage Ca2+ ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 1,0 mM CaCl2 en 6,0 mM MgCl2. Aanpassen tot pH 7,4 en 310 tot 330 mOsm). Breng de verkregen hersenplakjes over naar een kamer met een hogere Ca2+-concentratie in ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfaatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glucose, 4,0 mM CaCl2 en 3,5 mM MgCl2) pH 7,4 en 310 tot 320 mOsm). Bewaar de plakjes 20 tot 30 minuten, zodat ze kunnen herstellen voordat de metingen beginnen.
Voor alle opnames werd een microscooptafel gebruikt, uitgerust met een vaste opnamekamer en een 20x waterimmersie-objectief (Scientifica). De vermoedelijke Purkinje-cellen werden geïdentificeerd aan de hand van (i) lichaamsgrootte, (ii) anatomische locatie in het cerebellum en (iii) expressie van het fluorescerende mtYFP-reportergen. De patchpipet met een tipweerstand van 5 tot 11 megohm werd uitgetrokken door een borosilicaatglazen capillair (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Duitsland) en een horizontale pipet (Instruments P-1000, Sutter, Novato, CA). Alle opnames werden uitgevoerd met een ELC-03XS npi patch clamp-versterker (npi electronic GmbH, Tam, Duitsland), die werd aangestuurd door de software Signal (versie 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, VK). Het experiment werd opgenomen met een bemonsteringsfrequentie van 12,5 kHz. Het signaal wordt gefilterd met twee Bessel-filters met korte doorlaatfrequenties van respectievelijk 1,3 en 10 kHz. De capaciteit van het membraan en de pipet wordt gecompenseerd door het compensatiecircuit met behulp van de versterker. Alle experimenten werden uitgevoerd onder controle van een Orca-Flash 4.0 camera (Hamamatsu, Gerden, Duitsland), die werd aangestuurd door de Hokawo-software (versie 2.8, Hamamatsu, Gerden, Duitsland).
Routinematige configuratie en analyse van de hele cel. Direct vóór de opname vult u de pipet met de interne oplossing die de volgende stoffen bevat: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumgluconaat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosinetrifosfaat (GTP) (Na) en 10,0 mM creatinefosfaat. De pH wordt ingesteld op 7,25 en de osmotische druk bedraagt ​​290 mOsm (sucrose). Direct na het toepassen van een kracht van 0 pA om het membraan te breken, wordt de rustmembraanpotentiaal gemeten. De ingangsweerstand wordt gemeten door hypergepolariseerde stromen van -40, -30, -20 en -10 pA toe te passen. Meet de grootte van de spanningsrespons en gebruik de wet van Ohm om de ingangsweerstand te berekenen. Spontane activiteit werd gedurende 5 minuten geregistreerd in een voltage-clamp, en sPSC werd geïdentificeerd en gemeten in Igor Pro (versie 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, VS) met behulp van een semi-automatisch herkenningsscript. De IV-curve en de steady-state stroom werden gemeten door de batterij op verschillende potentialen te klemmen (beginnend bij -110 mV) en de spanning in stappen van 5 mV te verhogen. De productie van actiepotentialen (AP's) werd getest door een depolariserende stroom toe te passen. Klem de cel op -70 mV terwijl een depolariserende stroompuls wordt toegepast. Stel de stapgrootte van elke opname-eenheid afzonderlijk in (10 tot 60 pA). Bereken de maximale AP-frequentie door handmatig de pulspieken te tellen die de hoogste AP-frequentie veroorzaken. De AP-drempel wordt geanalyseerd met behulp van de tweede afgeleide van de depolarisatiepuls die als eerste één of meer AP's triggert.
Configuratie en analyse van geperforeerde patches. Voer geperforeerde patch-opnames uit volgens standaardprotocollen. Gebruik een ATP- en GTP-vrije pipet die de volgende ingrediënten niet bevat: 128 mM gluconaat-K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA en 2 mM MgCl2, en stel de pH in op 7,2 (met KOH). ATP en GTP worden weggelaten uit de intracellulaire oplossing om ongecontroleerde permeabiliteit van het celmembraan te voorkomen. De patchpipet wordt gevuld met een interne oplossing die amfotericine bevat (ongeveer 200 tot 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) om een ​​geperforeerde patch-opname te verkrijgen. Amfotericine werd opgelost in dimethylsulfoxide (eindconcentratie: 0,1 tot 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). De gebruikte DMSO-concentratie had geen significant effect op de bestudeerde neuronen. Tijdens het punchproces werd de kanaalweerstand (Ra) continu gemeten en het experiment werd gestart nadat de amplitude van Ra en de actiepotentiaal (AP) gestabiliseerd waren (20-40 minuten). Spontane activiteit werd gemeten in een voltage- en/of stroomklem gedurende 2 tot 5 minuten. De data-analyse werd uitgevoerd met Igor Pro (versie 7.05.2, WaveMetrics, VS), Excel (versie 2010, Microsoft Corporation, Redmond, VS) en GraphPad Prism (versie 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, Verenigde Staten). Om spontane AP's te identificeren, werd de NeuroMatic v3.0c plug-in van IgorPro gebruikt. Deze identificeert automatisch AP's met behulp van een gegeven drempelwaarde, die individueel voor elke opname wordt aangepast. Aan de hand van het spike-interval wordt de spikefrequentie bepaald met de maximale momentane spikefrequentie en de gemiddelde spikefrequentie.
PN-isolatie. Door het eerder gepubliceerde protocol aan te passen, werden PN's gezuiverd uit het cerebellum van muizen in een specifiek stadium (58). Kort gezegd werd het cerebellum gedissecteerd en fijngemaakt in ijskoud dissociatiemedium [zonder HBSS Ca2+ en Mg2+, aangevuld met 20 mM glucose, penicilline (50 U/ml) en streptomycine (0,05 mg/ml)], en vervolgens werd het medium verteerd in papaïne [HBSS, aangevuld met 1-cysteïne·HCl (1 mg/ml), papaïne (16 U/ml) en deoxyribonuclease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Behandel gedurende 30 minuten bij 30°C. Was de weefsels eerst bij kamertemperatuur in HBSS-medium met eierslijm (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) en DNase (0,1 mg/ml) om enzymatische afbraak te voorkomen, en vervolgens in HBSS-medium met 20 mM glucose. Door voorzichtig te malen in HBSS, penicilline (50 U/ml), streptomycine (0,05 mg/ml) en DNase (0,1 mg/ml) worden de afzonderlijke cellen vrijgemaakt. De resulterende celsuspensie werd gefilterd door een celzeef van 70 μm, waarna de cellen werden gecentrifugeerd (1110 rpm, 5 minuten, 4 °C) en opnieuw gesuspendeerd in sorteermedium [HBSS, aangevuld met 20 mM glucose, 20% foetaal runderserum, penicilline (50 U/ml) en streptomycine (0,05 mg/ml)]. Evalueer de cellevensvatbaarheid met propidiumjodide en pas de celdichtheid aan tot 1×10⁶ tot 2×10⁶ cellen/ml. Vóór de flowcytometrie werd de suspensie gefilterd door een celzeef met een maaswijdte van 50 μm.
Flowcytometer. Celsortering werd uitgevoerd bij 4°C met behulp van een FACSAria III-apparaat (BD Biosciences) en FACSDiva-software (BD Biosciences, versie 8.0.1). De celsuspensie werd gesorteerd met een nozzle van 100 μm onder een druk van 20 psi met een snelheid van ongeveer 2800 gebeurtenissen/sec. Omdat traditionele gatingcriteria (celgrootte, bimodale discriminatie en verstrooiingskarakteristieken) de correcte isolatie van PN van andere celtypen niet kunnen garanderen, is de gatingstrategie gebaseerd op de directe vergelijking van de YFP-intensiteit en autofluorescentie in mitoYFP+-muizen en de controle-mitoYFP−-muizen. YFP wordt geëxciteerd door het monster te bestralen met een laserlijn van 488 nm en het signaal wordt gedetecteerd met behulp van een 530/30 nm banddoorlaatfilter. In mitoYFP+-muizen wordt de relatieve sterkte van het Rosa26-mitoYFP-reportergen ook gebruikt om neuronale cellichamen en axonfragmenten te onderscheiden. 7-AAD wordt geëxciteerd met een gele laser van 561 nm en gedetecteerd met een 675/20 nm bandpassfilter om dode cellen uit te sluiten. Om tegelijkertijd astrocyten te scheiden, werd de celsuspensie gekleurd met ACSA-2-APC, waarna het monster werd bestraald met een laserlijn van 640 nm en een 660/20 nm bandpassfilter werd gebruikt om het signaal te detecteren.
De verzamelde cellen werden gecentrifugeerd (1110 rpm, 5 minuten, 4°C) en bewaard bij -80°C tot gebruik. Mfn2cKO-muizen en hun nestgenoten werden op dezelfde dag geclassificeerd om procedurele variabiliteit te minimaliseren. De presentatie en analyse van FACS-gegevens werden uitgevoerd met behulp van FlowJo-software (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, VS).
Zoals hierboven vermeld (59), wordt real-time PCR gebruikt om DNA te isoleren uit de gesorteerde neuronen voor de daaropvolgende kwantificering van mtDNA. De lineariteit en drempelgevoeligheid werden in eerste instantie getest door qPCR uit te voeren op verschillende aantallen cellen. Kort gezegd: verzamel 300 PN in een lysisbuffer bestaande uit 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 en proteinase K (200 ng/ml) en incubeer gedurende 120 minuten bij 55°C. De cellen werden vervolgens nog 10 minuten bij 95°C geïncubeerd om volledige inactivatie van proteinase K te garanderen. Met behulp van een TaqMan-sonde (Thermo Fisher) specifiek voor mt-Nd1 werd mtDNA gemeten door middel van semi-kwantitatieve PCR in het 7900HT Real-Time PCR-systeem (Thermo Fisher Scientific). Science, catalogusnummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer AIVI3E8) en 18S (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer Hs99999901_s1) genen.
Voorbereiding van het proteoommonster. Door de oplossing gedurende 10 minuten te verwarmen tot 95 °C en te sonificeren in de lysisbuffer [6 M guanidinechloride, 10 mM tris(2-carboxyethyl)fosfinehydrochloride, 10 mM chlooracetamide en 100 mM tris-HCl], werden bevroren neuronpellets gelyseerd in HCl. Dit gebeurde gedurende 10 minuten op een Bioruptor (Diagenode) (30 seconden puls / 30 seconden pauze). Het monster werd 1:10 verdund in 20 mM tris-HCl (pH 8,0), gemengd met 300 ng trypsine gold (Promega) en een nacht bij 37 °C geïncubeerd voor volledige digestie. De volgende dag werd het monster gedurende 20 minuten gecentrifugeerd bij 20.000 g. Het supernatant werd verdund met 0,1% mierenzuur en de oplossing werd ontzout met zelfgemaakte StageTips. Het monster werd gedroogd in een SpeedVac-instrument (Eppendorf concentrator plus 5305) bij 45 °C, waarna het peptide werd gesuspendeerd in 0,1% mierenzuur. Alle monsters werden gelijktijdig door dezelfde persoon bereid. Om astrocytenmonsters te analyseren, werden 4 μg ontzouten peptiden gelabeld met een tandem-massatag (TMT10plex, catalogusnummer 90110, Thermo Fisher Scientific) met een peptide-TMT-reagensverhouding van 1:20. Voor de TMT-labeling werd 0,8 mg TMT-reagens opgelost in 70 μl watervrij acetonitril (ACN), en het gedroogde peptide werd opgelost in 9 μl 0,1 M TEAB (triethylammoniumbicarbonaat), waaraan 7 μl TMT-reagens in ACN werd toegevoegd. De concentratie bedroeg 43,75%. Na 60 minuten incubatie werd de reactie gestopt met 2 μl 5% hydroxylamine. De gelabelde peptiden werden verzameld, gedroogd, opnieuw opgelost in 200 μl 0,1% mierenzuur (FA), in tweeën gedeeld en vervolgens ontzout met behulp van zelfgemaakte StageTips. Met behulp van een UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) werd een van de twee helften gefractioneerd op een Acquity chromatografische kolom van 1 mm x 150 mm gevuld met 130 Å 1,7 μm C18-deeltjes (Waters, catalogusnr. SKU: 186006935, Thermo Fisher Scientific). Scheid de peptiden met een stroomsnelheid van 30 μl/min, scheid van 1% tot 50% buffer B gedurende 85 minuten met een stapsgewijze gradiënt van 96 minuten, van 50% tot 95% buffer B gedurende 3 minuten, en vervolgens 8 minuten met 95% buffer B; Buffer A is 5% ACN en 10 mM ammoniumbicarbonaat (ABC), en buffer B is 80% ACN en 10 mM ABC. Verzamel fracties elke 3 minuten en combineer ze in twee groepen (1 + 17, 2 + 18, enz.) en droog ze in een vacuümcentrifuge.
LC-MS/MS-analyse. Voor massaspectrometrie werden de peptiden (nummer r119.aq) gescheiden op een 25 cm lange, 75 μm binnendiameter PicoFrit analytische kolom (nieuwe objectieflens, onderdeelnummer PF7508250) voorzien van 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), met behulp van een EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Duitsland). De kolomtemperatuur werd op 50 °C gehouden. Buffers A en B bestonden respectievelijk uit 0,1% mierenzuur in water en 0,1% mierenzuur in 80% acetonitril (ACN). De peptiden werden gescheiden van 6% tot 31% buffer B gedurende 65 minuten en van 31% tot 50% buffer B gedurende 5 minuten met een gradiënt van 200 nl/min. De geëlueerde peptiden werden geanalyseerd op een Orbitrap Fusion massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific). De m/z-waarde van de peptideprecursor werd gemeten met een resolutie van 120.000 in het bereik van 350 tot 1500 m/z. Met een genormaliseerde botsingsenergie van 27% werd de sterkste precursor met een ladingsstatus van 2 tot 6 geselecteerd voor HCD-splitsing (High Energy C Trap Dissociation). De cyclustijd werd ingesteld op 1 seconde. De m/z-waarde van het peptidefragment werd gemeten in de ionenval met behulp van de kleinste AGC-target van 5×10⁴ en een maximale injectietijd van 86 ms. Na fragmentatie werd de precursor gedurende 45 seconden op de dynamische uitsluitingslijst geplaatst. TMT-gelabelde peptiden werden gescheiden op een 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-kolom (Thermo Fisher Scientific, catalogusnummer 164942), en de migratiespectra werden geanalyseerd op een Orbitrap Lumos Tribrid-massaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) uitgerust met high-field asymmetric waveform ions (FAIMS)-apparatuur (Thermo Fisher Scientific), werkend bij twee compensatiespanningen van -50 en -70 V. MS3, geselecteerd op basis van de synchronisatieprecursor, werd gebruikt voor de meting van het TMT-rapportionsignaal. De peptidescheiding werd uitgevoerd op een EASY-nLC 1200, met behulp van een lineaire gradiëntelutie van 90%, met een bufferconcentratie van 6% tot 31%; buffer A was 0,1% mierenzuur (FA) en buffer B was 0,1% FA en 80% acetonitril (ACN). De analytische kolom werd gebruikt bij 50 °C. Gebruik FreeStyle (versie 1.6, Thermo Fisher Scientific) om het originele bestand te splitsen op basis van de FAIMS-compensatiespanning.
Eiwitidentificatie en -kwantificatie. Met behulp van de geïntegreerde Andromeda-zoekmachine werden de originele gegevens geanalyseerd met MaxQuant versie 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Naast de Cre-recombinase- en YFP-sequenties verkregen uit Aequorea victoria, werden peptidefragmentspectra doorzocht op de canonieke sequentie en isovormsequentie van het referentieproteoom van de muis (Proteoom-ID UP000000589, gedownload van UniProt in mei 2017). Methionine-oxidatie en N-terminale acetylering van eiwitten werden ingesteld als variabele modificaties; cysteïne-carbamoylmethylering werd ingesteld als vaste modificatie. De digestieparameters werden ingesteld op "specificiteit" en "trypsine/P". Het minimum aantal peptiden en razor-peptiden dat gebruikt werd voor eiwitidentificatie was 1; het minimum aantal unieke peptiden was 0. Onder de voorwaarden van peptide-kaartmatching was het eiwitidentificatiepercentage 0,01. De optie “Tweede Peptide” is ingeschakeld. Gebruik de optie “match between runs” om succesvolle identificaties tussen verschillende originele bestanden over te dragen. Gebruik LFQ minimum ratio count 1 voor labelvrije kwantificering (LFQ) (60). De LFQ-intensiteit wordt gefilterd op ten minste twee geldige waarden in ten minste één genotypegroep op elk tijdstip en wordt geëxtrapoleerd uit een normale verdeling met een breedte van 0,3 en een stapgrootte van 1,8. Gebruik het Perseus-computatieplatform (https://maxquant.net/perseus/) en R (https://r-project.org/) om de LFQ-resultaten te analyseren. Een tweezijdige gematigde t-test uit het limma-softwarepakket werd gebruikt voor differentiële expressieanalyse (61). Exploratieve data-analyse wordt uitgevoerd met ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally en pheatmap. De TMT-gebaseerde proteomics-data werden geanalyseerd met MaxQuant versie 1.6.10.43. Zoek naar ruwe proteomicsgegevens uit de humane proteomicsdatabase van UniProt, die in september 2018 is gedownload. De analyse omvat de door de fabrikant verstrekte correctiefactor voor isotoopzuiverheid. Gebruik limma in R voor differentiële expressieanalyse. De originele gegevens, de zoekresultaten in de database en de workflow en resultaten van de data-analyse zijn allemaal opgeslagen in de ProteomeXchange-alliantie via de PRIDE-partnerrepository met de dataset-identificatiecode PXD019690.
Functionele annotaties verrijken de analyse. De Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) tool werd gebruikt om de rijkdom van de functionele annotatietermen van de dataset na 8 weken te bepalen (Figuur 1). Kort gezegd wordt de kwantitatieve eiwitlijst verkregen uit LC-MS/MS (tandem massaspectrometrie) data-analyse gebruikt met de volgende filtercriteria: Mus musculus wordt geselecteerd als soort en achtergrond, en de categorie met een P-waarde van 0,05 of lager, gecorrigeerd voor verrijking door Benjamini, wordt als significant beschouwd. In deze grafiek worden de vijf meest voorkomende categorieën in elk cluster weergegeven op basis van de gecorrigeerde P-waarde. Met behulp van een meervoudige t-test, met het tweestaps lineaire boostprogramma van Benjamini, Krieger en Yekutieli (Q = 5%), wordt een tijdreeksanalyse van de eiwitexpressie uitgevoerd op de belangrijke kandidaten die in elke categorie zijn geïdentificeerd, waarbij elke rij afzonderlijk wordt geanalyseerd. Het is niet nodig om een ​​consistente standaarddeviatie (SD) te hanteren.
Om de resultaten van deze studie te vergelijken met gepubliceerde databases en een Venn-diagram in Figuur 1 te genereren, hebben we de kwantitatieve eiwitlijst gecombineerd met MitoCarta 2.0-annotaties (24). Gebruik de online tool Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) om het diagram te genereren.
Voor gedetailleerde informatie over de statistische procedures die gebruikt zijn voor proteomics-analyse, verwijzen wij u naar het betreffende gedeelte van Materialen en Methoden. Voor alle andere experimenten is gedetailleerde informatie te vinden in de bijbehorende legenda. Tenzij anders vermeld, worden alle gegevens weergegeven als gemiddelde ± SEM, en alle statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 8.1.2 software.
Voor aanvullend materiaal bij dit artikel kunt u terecht op http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dit is een open access-artikel dat is gepubliceerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License. Deze licentie staat gebruik, verspreiding en reproductie in elk medium toe, zolang het uiteindelijke gebruik niet commercieel is en ervan uitgaat dat het originele werk correct is. Referentie.
Let op: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u de pagina aanbeveelt weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat het geen spam is. We zullen geen e-mailadressen opslaan.
Deze vraag wordt gebruikt om te controleren of u een bezoeker bent en om automatische spaminzendingen te voorkomen.
Door E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomische analyse van disfunctionele neuronen bracht aan het licht dat metabolische programma's worden geactiveerd om neurodegeneratie tegen te gaan.
Door E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomische analyse van disfunctionele neuronen bracht aan het licht dat metabolische programma's worden geactiveerd om neurodegeneratie tegen te gaan.
©2020 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap. alle rechten voorbehouden. AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.