Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor het beste resultaat raden we u aan een nieuwere versie van uw browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder opmaak of JavaScript.
Propionzuur (PPA) wordt gebruikt om de rol van mitochondriale disfunctie bij neurodevelopmentele stoornissen zoals autismespectrumstoornis te bestuderen. Het is bekend dat PPA de mitochondriale biogenese, het metabolisme en de omzet verstoort. De effecten van PPA op mitochondriale dynamiek, splitsing en fusie blijven echter problematisch vanwege de complexe temporele aard van deze mechanismen. Hier gebruiken we complementaire kwantitatieve beeldvormingstechnieken om te onderzoeken hoe PPA de mitochondriale ultrastructuur, morfologie en dynamiek in neuronachtige SH-SY5Y-cellen beïnvloedt. PPA (5 mM) veroorzaakte een significante afname van het mitochondriale oppervlak (p < 0,01), de Feret-diameter en -omtrek (p < 0,05) en oppervlakte 2 (p < 0,01). Analyse met behulp van een mitochondriale event locator toonde een significante toename (p < 0,05) van splitsings- en fusiegebeurtenissen, waardoor de integriteit van het mitochondriale netwerk onder stressomstandigheden behouden bleef. Bovendien was de mRNA-expressie van cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) en OPA1 (p < 0,05) significant verlaagd. Dit illustreert de hermodellering van mitochondriale morfologie, biogenese en dynamiek om de functie te behouden onder stressomstandigheden. Onze gegevens bieden nieuw inzicht in de effecten van PPA op mitochondriale dynamiek en benadrukken het nut van beeldvormingstechnieken voor het bestuderen van de complexe regulatiemechanismen die betrokken zijn bij mitochondriale stressreacties.
Mitochondriën spelen een essentiële rol in diverse cellulaire functies, naast hun gebruikelijke functies in energieproductie en biosynthese. Het mitochondriale metabolisme is een belangrijke regulator van calciumsignalering, metabole en redoxhomeostase, inflammatoire signalering, epigenetische modificaties, celproliferatie, differentiatie en geprogrammeerde celdood1. In het bijzonder is het mitochondriale metabolisme cruciaal voor de ontwikkeling, overleving en functie van neuronen en is het breed betrokken bij verschillende manifestaties van neuropathologie2,3,4.
In de afgelopen tien jaar is de metabolische status naar voren gekomen als een centrale regulator van neurogenese, differentiatie, rijping en plasticiteit5,6. Recentelijk zijn mitochondriale morfologie en dynamiek bijzonder belangrijke componenten geworden van mitose, een dynamisch proces dat een pool van gezonde mitochondria in cellen in stand houdt. Mitochondriale dynamiek wordt gereguleerd door complexe, onderling afhankelijke routes, variërend van mitochondriale biogenese en bio-energetica tot mitochondriale splitsing, fusie, transport en opruiming7,8. Verstoring van een van deze integratieve mechanismen belemmert het behoud van gezonde mitochondriale netwerken en heeft diepgaande functionele gevolgen voor de neuroontwikkeling9,10. Er wordt inderdaad een ontregeling van de mitochondriale dynamiek waargenomen bij veel psychiatrische, neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen, waaronder autismespectrumstoornissen (ASS)11,12.
Autismespectrumstoornis (ASS) is een heterogene neuro-ontwikkelingsstoornis met een complexe genetische en epigenetische architectuur. De erfelijkheid van ASS staat vast, maar de onderliggende moleculaire etiologie blijft slecht begrepen. Accumulerende gegevens uit preklinische modellen, klinische studies en multi-omics moleculaire datasets leveren steeds meer bewijs voor mitochondriale disfunctie bij ASS13,14. We hebben eerder een genoombrede DNA-methyleringsscreening uitgevoerd in een cohort patiënten met ASS en differentieel gemethyleerde genen geïdentificeerd die gegroepeerd zijn langs mitochondriale metabolische routes15. Vervolgens rapporteerden we differentiële methylering van centrale regulatoren van mitochondriale biogenese en dynamiek, die geassocieerd was met een verhoogd aantal mtDNA-kopieën en een veranderd urinair metabolisch profiel bij ASS16. Onze gegevens leveren steeds meer bewijs dat mitochondriale dynamiek en homeostase een centrale rol spelen in de pathofysiologie van ASS. Het verbeteren van het mechanistisch inzicht in de relatie tussen mitochondriale dynamiek, morfologie en functie is daarom een ​​belangrijk doel van het lopende onderzoek naar neurologische aandoeningen die gekenmerkt worden door secundaire mitochondriale disfunctie.
Moleculaire technieken worden vaak gebruikt om de rol van specifieke genen in mitochondriale stressreacties te bestuderen. Deze aanpak kan echter beperkt worden door de veelzijdige en temporele aard van mitotische controlemechanismen. Bovendien is differentiële expressie van mitochondriale genen een indirecte indicator van functionele veranderingen, vooral omdat doorgaans slechts een beperkt aantal genen wordt geanalyseerd. Daarom zijn er meer directe methoden voorgesteld voor het bestuderen van mitochondriale functie en bio-energetica17. Mitochondriale morfologie is nauw verbonden met mitochondriale dynamiek. Mitochondriale vorm, connectiviteit en structuur zijn cruciaal voor energieproductie en mitochondriale en celoverleving5,18. Bovendien richten de verschillende componenten van de mitose zich op veranderingen in de mitochondriale morfologie, die kunnen dienen als nuttige eindpunten van mitochondriale disfunctie en een basis kunnen vormen voor daaropvolgende mechanistische studies.
De morfologie van mitochondriën kan direct worden waargenomen met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), waardoor een gedetailleerde studie van de cellulaire ultrastructuur mogelijk is. TEM visualiseert direct de morfologie, vorm en structuur van mitochondriale cristae op het niveau van individuele mitochondriën, in plaats van uitsluitend te vertrouwen op gen transcriptie, eiwitexpressie of mitochondriale functionele parameters in celpopulaties17,19,20. Daarnaast maakt TEM de studie mogelijk van interacties tussen mitochondriën en andere organellen, zoals het endoplasmatisch reticulum en autofagosomen, die een sleutelrol spelen in de mitochondriale functie en homeostase21,22. Dit maakt TEM een goed uitgangspunt voor het bestuderen van mitochondriale disfunctie voordat de focus ligt op specifieke pathways of genen. Naarmate de mitochondriale functie steeds relevanter wordt voor neuropathologie, is er een duidelijke behoefte om de mitochondriale morfologie en dynamiek direct en kwantitatief te kunnen bestuderen in in vitro neuronale modellen.
In dit artikel onderzoeken we de mitochondriale dynamiek in een neuronale model van mitochondriale disfunctie bij autismespectrumstoornis. We hebben eerder differentiële methylering van propionyl-CoA carboxylase bèta (PCCB) gerapporteerd in ASD15, een subunit van het mitochondriale propionyl-CoA carboxylase-enzym PCC. Het is bekend dat deregulatie van PCC leidt tot toxische accumulatie van propionylderivaten, waaronder propionzuur (PPA)23,24,25. Van PPA is aangetoond dat het het neuronale metabolisme verstoort en het gedrag in vivo verandert. Het is een gevestigd diermodel voor het bestuderen van neurodevelopmentele mechanismen die betrokken zijn bij ASD26,27,28. Daarnaast is gerapporteerd dat PPA het mitochondriale membraanpotentiaal, de biogenese en de ademhaling in vitro verstoort en wordt het veelvuldig gebruikt om mitochondriale disfunctie in neuronen te modelleren29,30. De impact van PPA-geïnduceerde mitochondriale disfunctie op de mitochondriale morfologie en dynamiek is echter nog steeds onvoldoende begrepen.
Deze studie maakt gebruik van complementaire beeldvormingstechnieken om de effecten van PPA op de mitochondriale morfologie, dynamiek en functie in SH-SY5Y-cellen te kwantificeren. Ten eerste ontwikkelden we een TEM-methode om veranderingen in de mitochondriale morfologie en ultrastructuur te visualiseren17,31,32. Gezien de dynamische aard van mitochondriën33 gebruikten we ook mitochondriale event localizer (MEL)-analyse om veranderingen in de balans tussen splitsings- en fusieprocessen, het aantal mitochondriën en het volume onder PPA-stress te kwantificeren. Ten slotte onderzochten we of mitochondriale morfologie en dynamiek samenhangen met veranderingen in de expressie van genen die betrokken zijn bij biogenese, splitsing en fusie. Samengevat illustreren onze gegevens de uitdaging om de complexiteit van de mechanismen die de mitochondriale dynamiek reguleren te ontrafelen. We benadrukken het nut van TEM bij het bestuderen van mitochondriale morfologie als een meetbaar convergent eindpunt van mitose in SH-SY5Y-cellen. Daarnaast benadrukken we dat TEM-gegevens de meest waardevolle informatie opleveren in combinatie met beeldvormingstechnieken die ook dynamische processen vastleggen als reactie op metabole stress. Verdere karakterisering van de moleculaire regulatiemechanismen die de mitose van neuronale cellen ondersteunen, kan belangrijk inzicht verschaffen in de mitochondriale component van het zenuwstelsel en neurodegeneratieve ziekten.
Om mitochondriale stress te induceren, werden SH-SY5Y-cellen behandeld met PPA met behulp van 3 mM en 5 mM natriumpropionaat (NaP). Vóór TEM werden de monsters cryogeen geprepareerd door middel van hogedrukbevriezing en bevriezing (Fig. 1a). We ontwikkelden een geautomatiseerde pijplijn voor mitochondriale beeldanalyse om acht morfologische parameters van mitochondriale populaties te meten over drie biologische replicaten. We ontdekten dat PPA-behandeling vier parameters significant veranderde: oppervlakte 2, oppervlakte, omtrek en Feret-diameter (Fig. 1b-e). Oppervlakte 2 nam significant af bij zowel 3 mM als 5 mM PPA-behandeling (p = 0,0183 en p = 0,002 respectievelijk) (Fig. 1b), terwijl oppervlakte (p = 0,003), omtrek (p = 0,0106) en Feret-diameter alle significant afnamen. Er was een significante afname (p = 0,0172) in de 5 mM-behandelingsgroep vergeleken met de controlegroep (Fig. 1c-e). Aanzienlijke afnames in oppervlakte en omtrek toonden aan dat cellen behandeld met 5 mM PPA kleinere, meer afgeronde mitochondriën hadden, en dat deze mitochondriën minder langwerpig waren dan die in controlecellen. Dit komt ook overeen met een significante afname van de Feret-diameter, een onafhankelijke parameter die een afname van de grootste afstand tussen de randen van de deeltjes aangeeft. Er werden veranderingen in de ultrastructuur van de cristae waargenomen: de cristae werden minder prominent onder invloed van PPA-stress (Fig. 1a, paneel B). Niet alle afbeeldingen gaven echter een duidelijke weergave van de ultrastructuur van de cristae, waardoor een kwantitatieve analyse van deze veranderingen niet kon worden uitgevoerd. Deze TEM-gegevens kunnen drie mogelijke scenario's weerspiegelen: (1) PPA bevordert splitsing of remt fusie, waardoor bestaande mitochondriën in omvang afnemen; (2) verhoogde biogenese creëert nieuwe, kleinere mitochondriën of (3) induceert beide mechanismen tegelijkertijd. Hoewel deze omstandigheden niet met TEM kunnen worden onderscheiden, duiden significante morfologische veranderingen op veranderingen in de mitochondriale homeostase en dynamiek onder PPA-stress. Vervolgens hebben we aanvullende parameters onderzocht om deze dynamiek en de mogelijke onderliggende mechanismen verder te karakteriseren.
Propionzuur (PPA) verandert de mitochondriale morfologie. (a) Representatieve transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)-beelden die laten zien dat de mitochondriale grootte afneemt en dat de mitochondria kleiner en ronder worden bij toenemende PPA-behandeling; respectievelijk 0 mM (onbehandeld), 3 mM en 5 mM. Rode pijlen geven mitochondria aan. (b–e) SH-SY5Y-cellen die 24 uur met PPA waren behandeld, werden geprepareerd voor TEM en de resultaten werden geanalyseerd met Fiji/ImageJ. Vier van de acht parameters vertoonden significante verschillen tussen controlecellen (onbehandeld, 0 mM PPA) en behandelde cellen (3 mM en 5 mM PPA). (b) Regio 2, (c) Oppervlakte, (d) Omtrek, (e) Feret-diameter. Eenrichtingsvariantieanalyse (controle versus behandeling) en de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett werden gebruikt om significante verschillen te bepalen (p < 0,05). Datapunten representeren de gemiddelde mitochondriale waarde voor elke individuele cel, en foutbalken representeren het gemiddelde ± SEM. De weergegeven gegevens vertegenwoordigen n = 3, met ten minste 24 cellen per replicatie; in totaal werden 266 afbeeldingen geanalyseerd; * geeft p < 0,05 aan, ** geeft p < 0,01 aan.
Om verder te karakteriseren hoe de mitochondriale dynamiek reageert op PPA, hebben we mitochondriën gekleurd met tetramethylrhodamine-ethylester (TMRE) en time-lapse-microscopie en MEL-analyse gebruikt om mitochondriën te lokaliseren en te kwantificeren na 24 uur bij 3 en 5 mM PPA. Behandeling van splitsings- en fusieprocessen. (Fig. 2a). Na de MEL-analyse werden de mitochondriën verder geanalyseerd om het aantal mitochondriale structuren en hun gemiddelde volume te kwantificeren. We observeerden een kleine maar significante toename in het aantal splitsingsgebeurtenissen bij 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] vergeleken met de controlegroep (Fig. 3b). Het aantal mitochondriën nam significant toe bij zowel 3 mM [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] als 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), terwijl het gemiddelde volume van elke mitochondriale structuur onveranderd bleef (Fig. 3c). Samengevat suggereert dit dat de herstructurering van de mitochondriale dynamiek dient als een compenserende reactie die de integriteit van het mitochondriale netwerk succesvol in stand houdt. De toename van het aantal splitsingsgebeurtenissen bij 3 mM PPA suggereert dat de toename van het aantal mitochondriën gedeeltelijk te wijten is aan mitochondriale splitsing, maar aangezien het gemiddelde mitochondriale volume in wezen onveranderd blijft, kan biogenese als een aanvullende compenserende reactie niet worden uitgesloten. Deze gegevens zijn echter consistent met de kleinere, ronde mitochondriale structuren die met TEM zijn waargenomen en tonen ook significante veranderingen in de mitochondriale dynamiek aan die door PPA worden geïnduceerd.
Propionzuur (PPA) induceert dynamische mitochondriale hermodellering om de netwerkintegriteit te behouden. SH-SY5Y-cellen werden gekweekt, gedurende 24 uur behandeld met 3 en 5 mM PPA en gekleurd met TMRE en Hoechst 33342, gevolgd door MEL-analyse. (a) Representatieve time-lapse microscopiebeelden met kleuren- en binaire maximale intensiteitsprojecties op tijdstip 2 (t2) voor elke conditie. Geselecteerde gebieden in elk binair beeld zijn vergroot en in 3D weergegeven op drie verschillende tijdstippen (t1-t3) om de dynamiek in de tijd te illustreren; fusiegebeurtenissen zijn groen gemarkeerd; splitsingsgebeurtenissen zijn groen gemarkeerd. Weergegeven in rood. (b) Gemiddeld aantal dynamische gebeurtenissen per conditie. (c) Gemiddeld aantal mitochondriale structuren per cel. (d) Gemiddeld volume (µm³) van elke mitochondriale structuur per cel. De getoonde gegevens zijn representatief voor n = 15 cellen per behandelingsgroep. De weergegeven foutbalken representeren het gemiddelde ± SEM, schaalbalk = 10 μm, * p < 0,05.
Propionzuur (PPA) veroorzaakt transcriptieonderdrukking van genen die geassocieerd zijn met mitochondriale dynamiek. SH-SY5Y-cellen werden 24 uur lang behandeld met 3 en 5 mM PPA. Relatieve genkwantificatie werd uitgevoerd met behulp van RT-qPCR en genormaliseerd ten opzichte van B2M. Mitochondriale biogenese-genen: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 en (d) NFE2L2. Mitochondriale fusie- en splitsingsgenen: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 en (i) DRP1. Significante verschillen (p < 0,05) werden getest met behulp van een eenweg-ANOVA (controle versus behandeling) en de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett: * geeft p < 0,05 aan, ** geeft p < 0,01 aan en **** geeft p < 0,0001 aan. De balken geven de gemiddelde expressie ± SEM weer. De getoonde gegevens zijn gebaseerd op n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) en n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) biologische replicaten.
Gegevens uit TEM- en MEL-analyses wijzen er samen op dat PPA de mitochondriale morfologie en dynamiek verandert. Deze beeldvormingstechnieken bieden echter geen inzicht in de onderliggende mechanismen die deze processen aansturen. Daarom hebben we de mRNA-expressie van negen belangrijke regulatoren van mitochondriale dynamiek, biogenese en mitose onderzocht als reactie op PPA-behandeling. We hebben de expressie van cMYC, nucleaire respiratoire factor (NRF1), mitochondriale transcriptiefactor 1 (TFAM), NFE2-achtige transcriptiefactor BZIP (NFE2L2), gastrine-achtig eiwit 2 (STOML2), optische zenuwatrofie 1 (OPA1), mitofusine 1 (MFN1), mitofusine 2 (MFN2) en dynamine-gerelateerd eiwit 1 (DRP1) gekwantificeerd na 24 uur behandeling met 3 mM en 5 mM PPA. We observeerden een effect van 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 en p < 0,0001, respectievelijk) en 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-behandeling (Fig. 3a–c). De afname in mRNA-expressie was dosisafhankelijk: de expressie van cMYC, NRF1 en TFAM nam respectievelijk 5,7, 2,6 en 1,9 keer af bij 3 mM, en 11,2, 3 en 2,2 keer bij 5 mM. Daarentegen werd het centrale redox-biogenese-gen NFE2L2 bij geen enkele PPA-concentratie beïnvloed, hoewel een vergelijkbare dosisafhankelijke trend van afnemende expressie werd waargenomen (Fig. 3d).
We onderzochten ook de expressie van klassieke genen die betrokken zijn bij de regulatie van celdeling en celfusie. Van STOML2 wordt aangenomen dat het betrokken is bij celfusie, mitofagie en biogenese, en de expressie ervan werd significant verlaagd (p < 0,0001) door 3 mM (2,4-voudige verandering) en 5 mM (2,8-voudige verandering) PPA (Fig. 1, 3d). Op vergelijkbare wijze nam de expressie van het fusiegen OPA1 af bij 3 mM (1,6-voudige verandering) en 5 mM (1,9-voudige verandering) PPA (respectievelijk p = 0,006 en p = 0,0024) (Fig. 3f). We vonden echter geen significante verschillen in de expressie van de fusiegenen MFN1, MFN2 of het celdelingsgen DRP1 onder 24 uur PPA-stress (Fig. 3g-i). Bovendien ontdekten we dat de niveaus van vier fusie- en splitsingsproteïnen (OPA1, MFN1, MFN2 en DRP1) onder dezelfde omstandigheden niet veranderden (Fig. 4a–d). Het is belangrijk op te merken dat deze gegevens een momentopname weergeven en mogelijk geen veranderingen in de eiwitexpressie of activiteitsniveaus tijdens de vroege stadia van PPA-stress weerspiegelen. Significante reducties in de expressie van cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 duiden echter op significante transcriptionele ontregeling van het mitochondriale metabolisme, de biogenese en de dynamiek. Daarnaast benadrukken deze gegevens het nut van beeldvormingstechnieken om veranderingen in de mitochondriale functie in de eindtoestand direct te bestuderen.
De eiwitniveaus van fusie- en splijtingsfactoren veranderden niet na behandeling met propionzuur (PPA). SH-SY5Y-cellen werden 24 uur lang behandeld met 3 en 5 mM PPA. De eiwitniveaus werden gekwantificeerd met behulp van Western blot-analyse en de expressieniveaus werden genormaliseerd ten opzichte van het totale eiwit. Gemiddelde eiwitexpressie en representatieve Western blots van het doelwit- en totale eiwit worden weergegeven. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. De balken geven het gemiddelde ± SEM weer en de getoonde gegevens zijn representatief voor n = 3 biologische replicaten. Meervoudige vergelijkingen (p < 0,05) werden uitgevoerd met behulp van eenrichtingsvariantieanalyse en de Dunnett-test. De originele gel en blot zijn weergegeven in Figuur S1.
Mitochondriale disfunctie wordt geassocieerd met multisysteemziekten, variërend van metabole, cardiovasculaire en spierziekten tot neurologische aandoeningen1,10. Veel neurodegeneratieve en neurodegeneratieve ziekten worden in verband gebracht met mitochondriale disfunctie, wat het belang van deze organellen gedurende de levensduur van de hersenen benadrukt. Deze ziekten omvatten de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer en autismespectrumstoornissen (ASS)3,4,18. Toegang tot hersenweefsel voor onderzoek naar deze ziekten is echter moeilijk, vooral op mechanistisch niveau, waardoor cellulaire modelsystemen een noodzakelijk alternatief vormen. In deze studie gebruiken we een cellulair modelsysteem met PPA-behandelde SH-SY5Y-cellen om de mitochondriale disfunctie die wordt waargenomen bij neurologische aandoeningen, met name autismespectrumstoornissen, na te bootsen. Het gebruik van dit PPA-model om de mitochondriale dynamiek in neuronen te bestuderen, kan inzicht geven in de etiologie van ASS.
We onderzochten de mogelijkheid om TEM te gebruiken om veranderingen in de mitochondriale morfologie te bekijken. Het is belangrijk op te merken dat TEM correct moet worden gebruikt om de effectiviteit ervan te maximaliseren. De preparatie van cryopreparaten maakt een betere conservering van neuronale structuren mogelijk door tegelijkertijd cellulaire componenten te fixeren en de vorming van artefacten te verminderen34. In overeenstemming hiermee observeerden we dat neuronachtige SH-SY5Y-cellen intacte subcellulaire organellen en langwerpige mitochondria hadden (Fig. 1a). Dit benadrukt het nut van cryogene preparatietechnieken voor het bestuderen van mitochondriale morfologie in neuronale celmodellen. Hoewel kwantitatieve metingen cruciaal zijn voor een objectieve analyse van TEM-gegevens, bestaat er nog geen consensus over welke specifieke parameters moeten worden gemeten om veranderingen in de mitochondriale morfologie te bevestigen. Op basis van een groot aantal studies die de mitochondriale morfologie kwantitatief hebben onderzocht17,31,32, hebben we een geautomatiseerde pijplijn voor mitochondriale beeldanalyse ontwikkeld die acht morfologische parameters meet, namelijk: oppervlakte, oppervlakte², aspectverhouding, omtrek, circulariteit, graad, Feret-diameter en rondheid.
Onder hen verminderde PPA significant het oppervlak 2, het oppervlak, de omtrek en de Feret-diameter (Fig. 1b–e). Dit toonde aan dat mitochondriën kleiner en ronder werden, wat consistent is met eerdere studies die een afname van het mitochondriale oppervlak lieten zien na 72 uur PPA30-geïnduceerde mitochondriale stress. Deze morfologische kenmerken kunnen duiden op mitochondriale splitsing, een noodzakelijk proces om beschadigde componenten uit het mitochondriale netwerk te verwijderen en hun afbraak via mitofagie te bevorderen35,36,37. Aan de andere kant kan de afname van de gemiddelde mitochondriale grootte verband houden met verhoogde biogenese, wat resulteert in de vorming van kleine, nieuw gevormde mitochondriën. Verhoogde splitsing of biogenese vertegenwoordigt een compenserende reactie om de mitose te handhaven tegen mitochondriale stress. Verminderde mitochondriale groei, verstoorde fusie of andere aandoeningen kunnen echter niet worden uitgesloten.
Hoewel de hoge-resolutiebeelden die met TEM worden verkregen het mogelijk maken om morfologische kenmerken op het niveau van individuele mitochondriën te bepalen, produceert deze methode tweedimensionale momentopnamen op één enkel tijdstip. Om dynamische reacties op metabolische stress te bestuderen, kleurden we mitochondriën met TMRE en gebruikten we time-lapse microscopie met MEL-analyse, waarmee veranderingen in het mitochondriale netwerk in de loop van de tijd in een driedimensionale weergave met hoge doorvoer mogelijk zijn33,38. We observeerden subtiele maar significante veranderingen in de mitochondriale dynamiek onder PPA-stress (Fig. 2). Bij 3 mM nam het aantal splitsingsgebeurtenissen significant toe, terwijl het aantal fusiegebeurtenissen gelijk bleef aan dat in de controle. Bij 5 mM PPA werd een toename van zowel het aantal splitsings- als fusiegebeurtenissen waargenomen, maar deze veranderingen waren ongeveer evenredig, wat suggereert dat de splitsings- en fusiekinetiek bij hogere concentraties een evenwicht bereiken (Fig. 2b). Het gemiddelde mitochondriale volume bleef onveranderd bij zowel 3 als 5 mM PPA, wat aangeeft dat de integriteit van het mitochondriale netwerk behouden bleef (Fig. 2d). Dit weerspiegelt het vermogen van dynamische mitochondriale netwerken om te reageren op milde metabole stress om de homeostase effectief te handhaven zonder netwerkfragmentatie te veroorzaken. Bij 3 mM PPA is de toename in splitsing voldoende om de overgang naar een nieuw evenwicht te bevorderen, maar een meer ingrijpende kinetische hermodellering is nodig als reactie op stress die wordt veroorzaakt door hogere concentraties PPA.
Het aantal mitochondriën nam toe bij beide PPA-stressconcentraties, maar het gemiddelde mitochondriale volume veranderde niet significant (Fig. 2c). Dit kan te wijten zijn aan verhoogde biogenese of verhoogde deling; echter, bij afwezigheid van een significante afname van het gemiddelde mitochondriale volume is het waarschijnlijker dat de biosynthese toeneemt. De gegevens in Figuur 2 ondersteunen echter het bestaan ​​van twee compensatiemechanismen: een toename van het aantal splitsingsgebeurtenissen, consistent met een opregulatie van mitochondriale splitsing, en een toename van het aantal gebeurtenissen, consistent met mitochondriale biogenese. Uiteindelijk kan dynamische compensatie voor milde stress bestaan ​​uit gelijktijdige processen waarbij splitsing, fusie, biogenese en mitofagie betrokken zijn. Hoewel eerdere auteurs hebben aangetoond dat PPA de mitose30,39 en mitofagie29 bevordert, leveren wij bewijs voor een hermodellering van de dynamiek van mitochondriale splitsing en fusie als reactie op PPA. Deze gegevens bevestigen de morfologische veranderingen die met TEM zijn waargenomen en bieden verder inzicht in de mechanismen die verband houden met PPA-geïnduceerde mitochondriale disfunctie.
Omdat noch TEM- noch MEL-analyse direct bewijs leverden voor de genregulerende mechanismen die ten grondslag liggen aan de waargenomen morfologische veranderingen, onderzochten we de RNA-expressie van genen die betrokken zijn bij mitochondriaal metabolisme, biogenese en dynamiek. Het cMYC-proto-oncogen is een transcriptiefactor die betrokken is bij de regulatie van mitochondriën, glycolyse, aminozuur- en vetzuurmetabolisme40. Daarnaast is bekend dat cMYC de expressie reguleert van bijna 600 mitochondriale genen die betrokken zijn bij mitochondriale transcriptie, translatie en complexassemblage, waaronder NRF1 en TFAM41. NRF1 en TFAM zijn twee centrale regulatoren van mitose, die stroomafwaarts van PGC-1α werken om mtDNA-replicatie te activeren. Dit pad wordt geactiveerd door cAMP- en AMPK-signalering en is gevoelig voor energieverbruik en metabole stress. We onderzochten ook NFE2L2, een redoxregulator van mitochondriale biogenese, om te bepalen of de effecten van PPA mogelijk gemedieerd worden door oxidatieve stress.
Hoewel de expressie van NFE2L2 onveranderd bleef, vonden we een consistente dosisafhankelijke afname in de expressie van cMYC, NRF1 en TFAM na 24 uur behandeling met 3 mM en 5 mM PPA (Fig. 3a–c). Downregulatie van de cMYC-expressie is eerder gerapporteerd als een reactie op mitochondriale stress42, en omgekeerd kan downregulatie van de cMYC-expressie mitochondriale disfunctie veroorzaken door het hermodelleren van het mitochondriale metabolisme, de netwerkconnectiviteit en de membraanpolarisatie43. Interessant is dat cMYC ook betrokken is bij de regulatie van mitochondriale splitsing en fusie42,43 en bekend staat om de fosforylering van DRP1 en de mitochondriale lokalisatie tijdens celdeling te verhogen44, en tevens mitochondriale morfologische hermodellering in neuronale stamcellen te mediëren45. Inderdaad vertonen cMYC-deficiënte fibroblasten een kleinere mitochondriale omvang, consistent met veranderingen die worden geïnduceerd door PPA43-stress. Deze gegevens illustreren een interessante, maar tot nu toe onduidelijke relatie tussen cMYC en mitochondriale dynamiek, en bieden daarmee een interessant aanknopingspunt voor toekomstige studies naar door PPA-stress geïnduceerde hermodellering.
De afname van NRF1 en TFAM is consistent met de rol van cMYC als een belangrijke transcriptionele activator. Deze gegevens komen ook overeen met eerdere studies in menselijke darmkankercellen, waaruit bleek dat PPA de NRF1 mRNA-expressie na 22 uur verlaagde, wat gepaard ging met ATP-uitputting en een verhoogde ROS46-productie. Deze auteurs rapporteerden ook dat de TFAM-expressie na 8,5 uur toenam, maar na 22 uur terugkeerde naar het basisniveau. Kim et al. (2019) toonden daarentegen aan dat de TFAM mRNA-expressie significant afnam na 4 uur PPA-stress in SH-SY5Y-cellen; na 72 uur was de TFAM-eiwitexpressie echter significant toegenomen en het aantal mtDNA-kopieën significant verhoogd. De afname van het aantal mitochondriale biogenese-genen die we na 24 uur waarnamen, sluit dus niet uit dat de toename van het aantal mitochondria verband houdt met de activering van biogenese op eerdere tijdstippen. Eerdere studies hebben aangetoond dat PPA de PGC-1α mRNA- en eiwitexpressie in SH-SY5Y-cellen significant verhoogt na 4 uur en 30 minuten, terwijl propionzuur de mitochondriale biogenese in kalfslevercellen bevordert via PGC-1α na 12 uur en 39 minuten. Interessant is dat PGC-1α niet alleen een directe transcriptionele regulator is van NRF1 en TFAM, maar ook de activiteit van MFN2 en DRP1 reguleert door middel van splitsing en fusie.47 Dit alles benadrukt de nauwe samenhang tussen de mechanismen die de door PPA geïnduceerde mitochondriale compensatiereacties reguleren. Bovendien laten onze gegevens een significante ontregeling zien van de transcriptionele regulatie van biogenese en metabolisme onder PPA-stress.
De genen STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 en DRP1 behoren tot de centrale regulatoren van mitochondriale splitsing, fusie en dynamiek37,48,49. Er zijn veel andere genen betrokken bij mitochondriale dynamiek, maar STOML2, OPA1 en MFN2 zijn eerder al differentieel gemethyleerd bevonden in ASD-cohorten16 en verschillende onafhankelijke studies hebben veranderingen in deze transcriptiefactoren gerapporteerd als reactie op mitochondriale stress50,51. 52. De expressie van zowel OPA1 als STOML2 werd significant verlaagd door behandeling met 3 mM en 5 mM PPA (Fig. 3e, f). OPA1 is een van de klassieke regulatoren van mitochondriale fusie door directe interactie met MFN1 en 2 en speelt een rol bij de hermodellering van de cristae en de mitochondriale morfologie53. De precieze rol van STOML2 in de mitochondriale dynamiek is nog onduidelijk, maar er zijn aanwijzingen dat het een rol speelt bij mitochondriale fusie, biogenese en mitofagie.
STOML2 is betrokken bij het handhaven van de mitochondriale respiratoire koppeling en de vorming van respiratoire ketencomplexen54,55 en er is aangetoond dat het de metabolische kenmerken van kankercellen ingrijpend verandert56. Studies hebben aangetoond dat STOML2 het mitochondriale membraanpotentiaal en de biogenese bevordert door interactie met BAN en cardiolipine55, 57, 58. Daarnaast hebben onafhankelijke studies aangetoond dat de interactie tussen STOML2 en PINK1 mitofagie reguleert59,60. Opvallend is dat STOML2 rechtstreeks interacteert met en MFN2 stabiliseert en ook een belangrijke rol speelt bij het stabiliseren van lange OPA1-isoformen door het remmen van het protease dat verantwoordelijk is voor de afbraak van OPA153,61,62. De vermindering van de STOML2-expressie die wordt waargenomen in PPA-reacties kan deze fusie-eiwitten gevoeliger maken voor afbraak via ubiquitine- en proteasoomafhankelijke routes48. Hoewel de precieze rol van STOML2 en OPA1 in de dynamische respons op PPA onduidelijk is, kan een verminderde expressie van deze fusiegenen (Figuur 3) het evenwicht tussen splitsing en fusie verstoren en leiden tot een afname van de mitochondriale grootte (Figuur 3). 1).
Aan de andere kant bleef de eiwitexpressie van OPA1 na 24 uur onveranderd, terwijl de mRNA- en eiwitniveaus van MFN1, MFN2 of DRP1 niet significant veranderden na PPA-behandeling (Fig. 3g-i, Fig. 4). Dit kan erop wijzen dat er geen veranderingen zijn in de regulatie van deze factoren die betrokken zijn bij mitochondriale fusie en splitsing. Het is echter belangrijk op te merken dat elk van deze vier genen ook wordt gereguleerd door posttranscriptionele modificaties (PTM's) die de eiwitactiviteit controleren. OPA1 heeft acht alternatieve splicevarianten die proteolytisch worden gesplitst in mitochondriën om twee verschillende isovormen te produceren 63. De balans tussen lange en korte isovormen bepaalt uiteindelijk de rol van OPA1 bij mitochondriale fusie en het behoud van het mitochondriale netwerk64. De activiteit van DRP1 wordt gereguleerd door fosforylering van calcium/calmodulin-afhankelijke proteïnekinase II (CaMKII), terwijl de afbraak van DRP1 wordt gereguleerd door ubiquitinatie en SUMOylering65. Ten slotte zijn zowel DRP1 als MFN1/2 GTPasen, waardoor de activiteit beïnvloed kan worden door de snelheid van GTP-productie in mitochondriën66. Hoewel de expressie van deze eiwitten constant blijft, hoeft dit dus geen weerspiegeling te zijn van een onveranderde eiwitactiviteit of -lokalisatie67,68. Bestaande PTM-eiwitrepertoires fungeren vaak als de eerste verdedigingslinie die verantwoordelijk is voor het mediëren van acute stressreacties. In aanwezigheid van matige metabole stress in ons model is het waarschijnlijk dat PTM de verhoogde activiteit van fusie- en splitsingseiwitten bevordert om de mitochondriale integriteit voldoende te herstellen zonder dat aanvullende activering van deze genen op mRNA- of eiwitniveau nodig is.
Samengevat benadrukken de bovenstaande gegevens de complexe en tijdsafhankelijke regulatie van mitochondriale morfologie en de uitdagingen bij het ophelderen van deze mechanismen. Om genexpressie te bestuderen, is het allereerst nodig om specifieke doelgenen in de pathway te identificeren. Onze gegevens laten echter zien dat genen in dezelfde pathway niet op dezelfde manier reageren op dezelfde stress. Sterker nog, eerdere studies hebben aangetoond dat verschillende genen in dezelfde pathway verschillende temporele responsprofielen kunnen vertonen30,46. Daarnaast zijn er complexe post-transcriptionele mechanismen die de relatie tussen transcriptie en genfunctie verstoren. Proteomische studies kunnen inzicht geven in de impact van PTM's en eiwitfunctie, maar ze brengen ook uitdagingen met zich mee, zoals methoden met een lage doorvoer, een hoge signaal-ruisverhouding en een lage resolutie.
In deze context biedt het bestuderen van mitochondriale morfologie met behulp van TEM en MEL een groot potentieel om fundamentele vragen te beantwoorden over de relatie tussen mitochondriale dynamiek en functie en hoe dit ziekten beïnvloedt. TEM biedt met name een directe methode voor het meten van mitochondriale morfologie als convergente eindpunt van mitochondriale disfunctie en dynamiek51. MEL biedt ook een directe methode voor het visualiseren van splitsings- en fusieprocessen in een driedimensionale cellulaire omgeving, waardoor kwantificering van dynamische mitochondriale hermodellering mogelijk is, zelfs in afwezigheid van veranderingen in genexpressie33. Hier benadrukken we het nut van mitochondriale beeldvormingstechnieken bij secundaire mitochondriale ziekten. Deze ziekten worden doorgaans gekenmerkt door chronische milde metabole stress, gekenmerkt door subtiele hermodellering van mitochondriale netwerken in plaats van acute mitochondriale schade. De mitochondriale compensatie die nodig is om de mitose onder chronische stress te handhaven, heeft echter diepgaande functionele gevolgen. In de context van de neurowetenschappen kan een beter begrip van deze compensatiemechanismen belangrijke informatie opleveren over de pleiotrope neuropathologie die gepaard gaat met mitochondriale disfunctie.
Uiteindelijk benadrukken onze gegevens het nut van beeldvormingstechnieken voor het begrijpen van de functionele gevolgen van de complexe interacties tussen genexpressie, eiwitmodificaties en eiwitactiviteit die de mitochondriale dynamiek in neuronen reguleren. We gebruikten PPA om mitochondriale disfunctie in een neuronale celmodel te modelleren en zo inzicht te krijgen in de mitochondriale component van autisme spectrumstoornis (ASS). SH-SY5Y-cellen behandeld met PPA vertoonden veranderingen in de mitochondriale morfologie: mitochondriën werden klein en rond, en de cristae waren slecht gedefinieerd bij observatie met TEM. MEL-analyse toont aan dat deze veranderingen gelijktijdig optreden met een toename van splitsings- en fusieprocessen om het mitochondriale netwerk in stand te houden als reactie op milde metabole stress. Bovendien verstoort PPA de transcriptionele regulatie van het mitochondriale metabolisme en de homeostase aanzienlijk. We identificeerden cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 en OPA1 als belangrijke mitochondriale regulatoren die verstoord worden door PPA-stress en mogelijk een rol spelen bij het mediëren van PPA-geïnduceerde veranderingen in mitochondriale morfologie en functie. Verder onderzoek is nodig om de door PPA geïnduceerde temporele veranderingen in genexpressie en eiwitactiviteit, lokalisatie en post-translationele modificaties beter te karakteriseren. Onze gegevens benadrukken de complexiteit en onderlinge afhankelijkheid van de regulerende mechanismen die de mitochondriale stressrespons mediëren en tonen het nut aan van TEM en andere beeldvormingstechnieken voor meer gerichte mechanistische studies.
De SH-SY5Y-cellijn (ECACC, 94030304-1VL) werd aangeschaft bij Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-cellen werden gekweekt in een mengsel van Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium en F-12 voedingsoplossing (DMEM/F-12) en L-glutamine (SC09411, ScienCell) in kweekflessen van 25 cm², aangevuld met 20% foetaal runderserum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) en 1% penicilline-streptomycine (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) bij 37 °C en 5% CO₂. De cellen werden gesubcultiveerd tot een confluentie van 80% met behulp van 0,05% trypsine-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), gecentrifugeerd bij 300 g en uitgeplaat met een dichtheid van ongeveer 7 × 10⁵ cellen/ml. Alle experimenten werden uitgevoerd op ongedifferentieerde SH-SY5Y-cellen tussen passage 19 en 22. PPA werd toegediend als NaP. Los NaP-poeder (CAS-nr. 137-40-6, chemische formule C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) op in warm MilliQ-water tot een concentratie van 1 M en bewaar bij 4 °C. Verdun deze oplossing op de dag van de behandeling met 1 M PPA tot 3 mM en 5 mM PPA in serumvrij medium (DMEM/F-12 met L-glutamine). De behandelingsconcentraties voor alle experimenten waren geen PPA (0 mM, controle), 3 mM en 5 mM PPA. De experimenten werden uitgevoerd in ten minste drie biologische replicaten.
SH-SY5Y-cellen werden uitgezaaid in kweekflessen van 25 cm³ met een dichtheid van 5,5 × 10⁵ cellen/ml en gedurende 24 uur gekweekt. De PPA-behandeling werd vóór 24 uur incubatie aan de kweekfles toegevoegd. Verzamel de celpellets volgens de normale subcultuurprotocollen voor zoogdierweefsel (zoals hierboven beschreven). Resuspendeer de celpellet in 100 µl 2,5% glutaraldehyde, 1× PBS en bewaar deze bij 4 °C tot verdere verwerking. SH-SY5Y-cellen werden kort gecentrifugeerd om de cellen te pelleteren en de 2,5% glutaraldehyde, 1× PBS-oplossing te verwijderen. Resuspendeer het sediment in een 4% agarosegel bereid in gedestilleerd water (de verhouding tussen agarose- en sedimentvolume is 1:1). Agarosestukjes werden op roosters op vlakke platen geplaatst en bedekt met 1-hexadeceen vóór hogedrukbevriezing. De monsters werden 24 uur lang ingevroren in 100% droge aceton bij -90 °C. Vervolgens werd de temperatuur verhoogd tot -80 °C en werd een oplossing van 1% osmiumtetroxide en 0,1% glutaraldehyde toegevoegd. De monsters werden 24 uur lang bewaard bij -80 °C. Daarna werd de temperatuur gedurende meerdere dagen geleidelijk verhoogd tot kamertemperatuur: van -80 °C naar -50 °C gedurende 24 uur, naar -30 °C gedurende 24 uur, naar -10 °C gedurende 24 uur en ten slotte naar kamertemperatuur.
Na cryogene preparatie werden de monsters geïmpregneerd met hars en werden ultradunne coupes (ca. 100 nm) gemaakt met behulp van een Leica Reichert UltracutS ultramicrotoom (Leica Microsystems). De coupes werden gekleurd met 2% uranylacetaat en loodcitraat. De monsters werden bekeken met een FEI Tecnai 20 transmissie-elektronenmicroscoop (ThermoFisher (voorheen FEI), Eindhoven, Nederland) werkend op 200 kV (Lab6-zender) en een Gatan CCD-camera (Gatan, VK) uitgerust met een Tridiem-energiefilter.
In elke technische replicatie werden minstens 24 beelden van afzonderlijke cellen verkregen, voor een totaal van 266 beelden. Alle beelden werden geanalyseerd met behulp van de Region of Interest (ROI)-macro en de Mitochondria-macro. De mitochondriale macro is gebaseerd op gepubliceerde methoden17,31,32 en maakt semi-automatische batchverwerking van TEM-beelden in Fiji/ImageJ69 mogelijk. Kort gezegd: het beeld wordt geïnverteerd met behulp van rolling ball-achtergrondsubtractie (radius van 60 pixels) en een FFT-banddoorlaatfilter (met respectievelijk 60 en 8 pixels boven- en ondergrens) en verticale lijnonderdrukking met een oriëntatietolerantie van 5%. Het verwerkte beeld wordt automatisch drempelwaardig gemaakt met behulp van een maximum-entropie-algoritme en er wordt een binair masker gegenereerd. Beeldregio's die geassocieerd zijn met handmatig geselecteerde ROI's in ruwe TEM-beelden werden geëxtraheerd, waarbij mitochondriën werden gekarakteriseerd en het plasmamembraan en andere contrastrijke gebieden werden uitgesloten. Voor elk geëxtraheerd ROI werden binaire deeltjes groter dan 600 pixels geanalyseerd. Het deeltjesoppervlak, de omtrek, de grote en kleine as, de Feret-diameter, de rondheid en de circulariteit werden gemeten met behulp van de ingebouwde meetfuncties van Fiji/ImageJ. Volgens Merrill, Flippo en Strack (2017) werden oppervlakte 2, de aspectverhouding van het deeltje (verhouding tussen grote en kleine as) en de vormfactor (FF) berekend uit deze gegevens, waarbij FF = omtrek 2/4π x oppervlakte. De definitie van de parametrische formule is te vinden in Merrill, Flippo en Strack (2017). De genoemde macro's zijn beschikbaar op GitHub (zie Data Availability Statement). Gemiddeld werden ongeveer 5600 deeltjes per PPA-behandeling geanalyseerd, voor een totaal van ongeveer 17.000 deeltjes (gegevens niet getoond).
SH-SH5Y-cellen werden in kweekschalen met 8 compartimenten (ThermoFisher, #155411) geplaatst om hechting gedurende de nacht mogelijk te maken en vervolgens geïncubeerd met TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) en Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) voor kleuring. Beelden werden verkregen met behulp van lasers van 405 nm en 561 nm gedurende 10 minuten. De ruwe beelden werden vastgelegd als z-stacks met 10 microfoto's met een az-stap van 0,2 μm tussen de frames op 12 opeenvolgende tijdstippen. De beelden werden verzameld met behulp van een Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superresolutieplatform (Carl Zeiss, Oberkochen, Duitsland) met een LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27-lens. De beelden werden geanalyseerd in ImageJ met behulp van een eerder beschreven pipeline en de ImageJ-plugin om fusie- en splitsingsgebeurtenissen, het gemiddelde aantal mitochondriale structuren en het gemiddelde mitochondriale volume per cel te meten33. MEL-macro's zijn beschikbaar op GitHub (zie Data Availability Statement).
SH-SY5Y-cellen werden 24 uur vóór de behandeling gekweekt in zeswells platen met een dichtheid van 0,3 × 10⁶ cellen/ml. RNA werd geëxtraheerd met behulp van het Quick-RNA™ Miniprep-protocol (ZR R1055, Zymo Research) met enkele kleine aanpassingen: voeg 300 μl RNA-lysisbuffer toe aan elk putje vóór verwijdering en lyseer elk monster als laatste stap met 30 μl DNase/RNase-vrij water. Alle monsters werden gecontroleerd op kwantiteit en kwaliteit met behulp van een NanoDrop ND-1000 UV-Vis-spectrofotometer. De totale eiwitconcentratie uit de cellysaten werd bepaald met behulp van 200 μl RIPA-lysisbuffer en de eiwitconcentratie werd gekwantificeerd met de Bradford-eiwittest⁷⁰.
cDNA-synthese werd uitgevoerd met behulp van de Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) volgens de instructies van de fabrikant, met enkele aanpassingen. cDNA werd gesynthetiseerd in reacties van 20 μl met 0,7 tot 1 μg totaal RNA. Primers werden geselecteerd uit eerder gepubliceerde artikelen 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabel S1) en bijbehorende probes werden ontworpen met behulp van de PrimerQuest-tool van Integrated DNA Technologies. Alle genen van belang werden genormaliseerd ten opzichte van het nucleaire B2M-gen. De genexpressie van STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC en OPA1 werd gemeten met RT-qPCR. De mastermix bevatte LUNA Taq-polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forward- en reverse-primers, cDNA en PCR-kwaliteit water, wat resulteerde in een eindvolume van 10 μL per reactie. De expressie van delings- en splitsingsgenen (DRP1, MFN1/2) werd gemeten met behulp van TaqMan multiplex-assays. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant met enkele kleine aanpassingen. De multiplex RT-qPCR mastermix bevat 1X LUNA Taq-polymerase, 10 μM forward- en reverse-primers, 10 μM probe, cDNA en PCR-kwaliteit water, wat resulteerde in een eindvolume van 20 μL per reactie. RT-qPCR werd uitgevoerd met behulp van Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – serienummer: R0618110). De cyclingscondities worden weergegeven in Tabel S1. Alle cDNA-monsters werden in drievoud geamplificeerd en er werd een standaardcurve gegenereerd met behulp van een reeks tienvoudige verdunningen. Uitschieters in drievoudige monsters met een standaarddeviatie van de cyclusdrempel (Ct) >0,5 werden uit de analyse verwijderd om de reproduceerbaarheid van de gegevens te waarborgen30,72. De relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2-ΔΔCt79-methode.
Eiwitmonsters (60 μg) werden gemengd met Laemmli-laadbuffer in een verhouding van 2:1 en geanalyseerd op een 12% kleurloze eiwitgel (Bio-Rad #1610184). De eiwitten werden overgebracht naar een PVDF-membraan (polyvinylideenfluoride) (#170-84156, Bio-Rad) met behulp van het Trans-Blot Turbo-systeem (#170-4155, Bio-Rad). Het membraan werd geblokkeerd en gedurende 48 uur geïncubeerd met de geschikte primaire antilichamen (OPA1, MFN1, MFN2 en DRP1) (verdund 1:1000), gevolgd door incubatie met secundaire antilichamen (1:10.000) gedurende 1 uur. De membranen werden vervolgens afgebeeld met behulp van Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) en vastgelegd met een Bio-Rad ChemiDoc MP-systeem. Voor de Western blot-analyse werd ImageLab versie 6.1 gebruikt. De originele gel en blot zijn weergegeven in Figuur S1. Informatie over de antilichamen is te vinden in Tabel S2.
De datasets worden gepresenteerd als het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (SEM) van ten minste drie onafhankelijke steekproeven. De datasets werden getoetst op normaliteit met behulp van de Shapiro-Wilks-test (tenzij anders vermeld) voordat een Gaussische verdeling en gelijke standaarddeviaties werden aangenomen en de analyses werden uitgevoerd. Naast het analyseren van de dataset met behulp van Fisher's MEL LSD (p < 0,05), eenweg-ANOVA (gemiddelde behandeling versus controle) en Dunnett's meervoudige vergelijkingstest om significantie te bepalen (p < 0,05). Significante p-waarden worden in de grafiek weergegeven als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle statistische analyses en grafieken werden uitgevoerd en gegenereerd met GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-macro's voor TEM-beeldanalyse zijn openbaar beschikbaar op GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. De Mitochondrial Event Locator (MEL)-macro is openbaar beschikbaar op GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM en Vijaya A. Mitochondriën: meesterregulatoren van metabolisme, homeostase, stress, veroudering en epigenetica. Indonesisch. Biomedische Wetenschappen. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Veelzijdige mitochondriale disfunctie bij schizofrenie, complex I als mogelijk pathologisch doelwit. Schizofrenie. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. en Beal, MF. Mitochondriale disfunctie bij de ziekte van Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG en Mehta V. Gestresste mitochondriën: doelwitten van invasie bij de ziekte van Alzheimer. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF en Ferreira GK Mitochondriën en de hersenen: bio-energetica en meer. Neurotoxinen. bron. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotrope mitochondriën: de impact van mitochondriën op neuronale ontwikkeling en ziekte. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. en Morais, VA. Mitochondriale biogenese in neuronen: hoe en waar. Internationaliteit. J. Mohr. De wetenschap. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. en Zhao, J. Regulatie van de mitochondriale dynamiek bij zoogdieren: kansen en uitdagingen. front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. en Slack, RS. Mitochondriale dynamiek in de regulatie van neurogenese: van de ontwikkelende tot de volwassen hersenen. Development. Dynamic. 247, 47–53 (2018).