Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
Insuline-nanodeeltjes (NP's) met een hoge beladingsgraad hebben verschillende toepassingen gevonden in diverse toedieningsvormen. Dit onderzoek heeft als doel het effect van vriesdrogen en sproeidrogen op de structuur van met insuline beladen chitosan-nanodeeltjes te evalueren, met of zonder mannitol als cryoprotectant. We hebben ook de kwaliteit van deze nanodeeltjes beoordeeld door ze opnieuw op te lossen. Vóór dehydratatie werd de deeltjesgrootte van de chitosan/natriumtripolyfosfaat/insuline-verknoopte nanodeeltjes geoptimaliseerd tot 318 nm, de PDI was 0,18, de inkapselingsefficiëntie was 99,4% en de belading was 25,01%. Na reconstitutie behielden alle nanodeeltjes, met uitzondering van die geproduceerd door vriesdrogen zonder mannitol, hun bolvormige structuur. Vergeleken met mannitolbevattende nanodeeltjes die door sproeidrogen waren gedehydrateerd, vertoonden mannitolvrije sproeigedroogde nanodeeltjes ook de kleinste De gemiddelde deeltjesgrootte (376 nm) en het hoogste laadgehalte (25,02%) met een vergelijkbare inkapselingsgraad (98,7%) en PDI (0,20) werden bereikt door middel van drogen of vriesdrogen. De gedroogde nanodeeltjes, verkregen door sproeidrogen zonder mannitol, resulteerden ook in de snelste afgifte van insuline en de hoogste efficiëntie van cellulaire opname. Dit onderzoek toont aan dat sproeidrogen insuline-nanodeeltjes kan dehydrateren zonder de noodzaak van cryoprotectanten, in tegenstelling tot conventionele vriesdroogmethoden, wat aanzienlijke voordelen oplevert op het gebied van laadcapaciteit, benodigde additieven en operationele kosten.
Sinds de ontdekking ervan in 1922¹²³ hebben insuline en de farmaceutische preparaten ervan levens gered van patiënten met diabetes type 1 (T1DM) en diabetes type 2 (T2DM). Vanwege de eigenschappen als eiwit met een hoog moleculair gewicht, aggregeert insuline echter gemakkelijk, wordt het afgebroken door proteolytische enzymen en geëlimineerd door het first-pass-effect. Mensen met diabetes type 1 hebben de rest van hun leven insuline-injecties nodig. Veel patiënten bij wie aanvankelijk diabetes type 2 is vastgesteld, hebben ook langdurig insuline-injecties nodig. Dagelijkse insuline-injecties vormen een ernstige bron van pijn en ongemak voor deze mensen, met negatieve gevolgen voor hun geestelijke gezondheid. Daarom worden andere vormen van insulinetoediening die minder ongemak veroorzaken, zoals orale insulinetoediening, uitgebreid onderzocht⁵, omdat ze de potentie hebben om de levenskwaliteit van ongeveer 5 miljard mensen met diabetes wereldwijd te verbeteren.
Nanodeeltjestechnologie heeft een aanzienlijke vooruitgang mogelijk gemaakt in de pogingen om insuline oraal toe te dienen4,6,7. Het maakt een effectieve inkapseling en bescherming van insuline tegen afbraak mogelijk, waardoor gerichte toediening op specifieke plaatsen in het lichaam mogelijk is. Het gebruik van nanodeeltjesformuleringen kent echter verschillende beperkingen, voornamelijk vanwege stabiliteitsproblemen van de deeltjessuspensies. Tijdens opslag kan enige aggregatie optreden, wat de biologische beschikbaarheid van met insuline beladen nanodeeltjes vermindert8. Daarnaast moet ook rekening worden gehouden met de chemische stabiliteit van de polymeermatrix van de nanodeeltjes en insuline om de stabiliteit van insuline-nanodeeltjes (NP's) te waarborgen. Momenteel is vriesdroogtechnologie de gouden standaard voor het creëren van stabiele NP's en het voorkomen van ongewenste veranderingen tijdens opslag9.
Vriesdrogen vereist echter de toevoeging van cryoprotectanten om te voorkomen dat de bolvormige structuur van de nanodeeltjes wordt aangetast door de mechanische spanning van ijskristallen. Dit vermindert de hoeveelheid insuline-nanodeeltjes na lyofilisatie aanzienlijk, omdat de cryoprotectant het grootste deel van het gewicht inneemt. Daarom blijken de geproduceerde insuline-nanodeeltjes vaak ongeschikt voor de productie van droge poederformuleringen, zoals orale tabletten en orale films, vanwege de noodzaak van grote hoeveelheden droge nanodeeltjes om het therapeutische venster van insuline te bereiken.
Spuitdrogen is een bekend en goedkoop industrieel proces voor de productie van droge poeders uit vloeibare fasen in de farmaceutische industrie10,11. Controle over het deeltjesvormingsproces maakt een goede inkapseling van verschillende bioactieve stoffen mogelijk12,13. Bovendien is het een effectieve techniek geworden voor de bereiding van ingekapselde eiwitten voor orale toediening. Tijdens het spuitdrogen verdampt water zeer snel, wat helpt om de temperatuur van de deeltjeskern laag te houden11,14, waardoor het geschikt is voor de inkapseling van warmtegevoelige componenten. Vóór het spuitdrogen moet het coatingmateriaal grondig worden gehomogeniseerd met de oplossing die de ingekapselde ingrediënten bevat11,14. In tegenstelling tot vriesdrogen verbetert homogenisatie vóór inkapseling bij spuitdrogen de inkapselingsefficiëntie tijdens de dehydratatie. Omdat het spuitdroogproces geen cryoprotectanten vereist, kan spuitdrogen worden gebruikt om gedroogde nanodeeltjes met een hoog gehalte aan werkzame stoffen te produceren.
Deze studie beschrijft de productie van met insuline beladen nanodeeltjes door verknoping van chitosan en natriumtripolyfosfaat met behulp van een iongelmethode. Iongelering is een bereidingsmethode die de productie van nanodeeltjes mogelijk maakt door elektrostatische interacties tussen twee of meer ionen onder bepaalde omstandigheden. Zowel vriesdrogen als sproeidrogen werden gebruikt om de geoptimaliseerde, met chitosan/natriumtripolyfosfaat/insuline verknoopte nanodeeltjes te dehydrateren. Na dehydratatie werd hun morfologie geanalyseerd met behulp van SEM. Hun recombinatievermogen werd geëvalueerd door de grootteverdeling, oppervlaktelading, PDI, inkapselingsefficiëntie en beladingsgehalte te meten. De kwaliteit van de opnieuw opgeloste nanodeeltjes, geproduceerd met verschillende dehydratatiemethoden, werd ook geëvalueerd door hun insulinebescherming, afgiftegedrag en cellulaire opname-efficiëntie te vergelijken.
De pH van de gemengde oplossing en de verhouding tussen chitosan en insuline zijn twee belangrijke factoren die de deeltjesgrootte en de inkapselingsefficiëntie (EE) van de uiteindelijke nanodeeltjes beïnvloeden, omdat ze rechtstreeks van invloed zijn op het ionotrope gelatieproces. De pH van de gemengde oplossing bleek sterk gecorreleerd te zijn met de deeltjesgrootte en de inkapselingsefficiëntie (Fig. 1a). Zoals weergegeven in Fig. 1a, nam de gemiddelde deeltjesgrootte (nm) af en de EE significant toe naarmate de pH steeg van 4,0 naar 6,0, terwijl bij een pH van 6,5 de gemiddelde deeltjesgrootte begon toe te nemen en de EE onveranderd bleef. Naarmate de verhouding tussen chitosan en insuline toeneemt, neemt ook de gemiddelde deeltjesgrootte toe. Bovendien werd geen verandering in EE waargenomen wanneer nanodeeltjes werden bereid met een massaverhouding van chitosan/insuline hoger dan 2,5:1 (w/w) (Fig. 1b). Daarom waren de optimale bereidingsomstandigheden in deze studie (pH 6,0, massaverhouding chitosan/insuline van 2,5:1) werden gebruikt om met insuline beladen nanodeeltjes te bereiden voor verder onderzoek. Onder deze bereidingsomstandigheden werd de gemiddelde deeltjesgrootte van de insuline-nanodeeltjes geoptimaliseerd tot 318 nm (Fig. 1c), de PDI was 0,18, de inbeddingsefficiëntie was 99,4%, de zeta-potentiaal was 9,8 mV en de insulinebelading was 25,01% (m/m). Op basis van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) resultaten bleken de geoptimaliseerde nanodeeltjes ruwweg bolvormig en discreet te zijn met een relatief uniforme grootte (Fig. 1d).
Parameteroptimalisatie van insuline-nanodeeltjes: (a) het effect van pH op de gemiddelde diameter en inkapselingsefficiëntie (EE) van insuline-nanodeeltjes (bereid met een massaverhouding van 5:1 chitosan en insuline); (b) invloed van de massaverhouding van chitosan en insuline op de gemiddelde diameter en inkapselingsefficiëntie (EE) van insuline-nanodeeltjes (bereid bij pH 6); (c) deeltjesgrootteverdeling van geoptimaliseerde insuline-nanodeeltjes; (d) TEM-microfoto van geoptimaliseerde insuline-nanodeeltjes.
Het is algemeen bekend dat chitosan een zwak polyelektrolyt is met een pKa van 6,5. Het is positief geladen in zure media omdat de belangrijkste aminogroep geprotoneerd wordt door waterstofionen15. Daarom wordt het vaak gebruikt als drager om negatief geladen macromoleculen in te kapselen. In deze studie werd chitosan gebruikt om insuline met een iso-elektrisch punt van 5,3 in te kapselen. Omdat chitosan als coatingmateriaal wordt gebruikt, neemt de dikte van de buitenste laag van de nanodeeltjes toe naarmate de hoeveelheid ervan toeneemt, wat resulteert in een grotere gemiddelde deeltjesgrootte. Bovendien kan een hogere concentratie chitosan meer insuline inkapselen. In ons geval was de inkapselingsefficiëntie (EE) het hoogst toen de verhouding tussen chitosan en insuline 2,5:1 bereikte, en er was geen significante verandering in de EE toen de verhouding verder toenam.
Naast de verhouding tussen chitosan en insuline speelde ook de pH een cruciale rol bij de bereiding van NPs. Gan et al. 17 onderzochten het effect van pH op de deeltjesgrootte van chitosan-nanodeeltjes. Zij vonden een continue afname van de deeltjesgrootte tot een pH van 6,0, waarna een significante toename van de deeltjesgrootte werd waargenomen bij een pH > 6,0, wat overeenkomt met onze waarnemingen. Dit fenomeen is te verklaren doordat het insulinemolecuul bij een toenemende pH een negatieve oppervlakte lading verkrijgt, waardoor elektrostatische interacties met het chitosan/natriumtripolyfosfaat (TPP)-complex worden bevorderd, wat resulteert in een kleinere deeltjesgrootte en een hoge inkapselingsefficiëntie (EE). Toen de pH echter werd aangepast tot 6,5, werden de aminogroepen op chitosan gedeprotoneerd, wat leidde tot het vouwen van chitosan. Een hoge pH resulteert dus in minder blootstelling van amino-ionen aan TPP en insuline, wat leidt tot minder crosslinking, een grotere gemiddelde deeltjesgrootte en een lagere EE.
Analyse van de morfologische eigenschappen van gevriesdroogde en sproeigedroogde nanodeeltjes kan helpen bij de selectie van betere dehydratatie- en poedervormingstechnieken. De voorkeursmethode moet zorgen voor geneesmiddelstabiliteit, een uniforme deeltjesvorm, een hoge geneesmiddelbelading en een goede oplosbaarheid in de oorspronkelijke oplossing. In deze studie werden, om de twee technieken beter te vergelijken, insuline-nanodeeltjes met en zonder 1% mannitol gebruikt tijdens de dehydratatie. Mannitol wordt gebruikt als vulmiddel of cryoprotectant in verschillende droge poederformuleringen voor vriesdrogen en sproeidrogen. Voor de gelyofiliseerde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol, zoals weergegeven in figuur 2a, werd een zeer poreuze poederstructuur met grote, onregelmatige en ruwe oppervlakken waargenomen onder een scanningelektronenmicroscoop (SEM). Na dehydratatie werden slechts enkele afzonderlijke deeltjes in het poeder gedetecteerd (figuur 2e). Deze resultaten gaven aan dat de meeste nanodeeltjes tijdens het vriesdrogen zonder cryoprotectant werden afgebroken. Voor gevriesdroogde en sproeigedroogde insuline-nanodeeltjes met 1% mannitol werden bolvormige deeltjes waargenomen. Er werden nanodeeltjes met gladde oppervlakken waargenomen (Fig. 2b,d,f,h). Insuline-nanodeeltjes die zonder mannitol waren gesproeidroogd, bleven bolvormig maar vertoonden rimpels aan het oppervlak (Fig. 2c). Bolvormige en gerimpelde oppervlakken worden hieronder verder besproken in de tests naar het vrijgavegedrag en de cellulaire opname. Op basis van het uiterlijk van de gedroogde nanodeeltjes leverden zowel de gesproeidroogde nanodeeltjes zonder mannitol als de gevriesdroogde en gesproeidroogde nanodeeltjes met mannitol fijne nanodeeltjespoeders op (Fig. 2f,g,h). Hoe groter het oppervlak tussen de deeltjes, hoe hoger de oplosbaarheid en dus hoe hoger de vrijgavesnelheid.
Morfologie van verschillende gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes: (a) SEM-afbeelding van gelyofiliseerde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol; (b) SEM-afbeelding van gelyofiliseerde insuline-nanodeeltjes met mannitol; (c) SEM-afbeelding van sproeidroogde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol; (d) SEM-afbeelding van sproeidroogde insuline-nanodeeltjes met mannitol; (e) afbeelding van gelyofiliseerd insuline-nanodeeltjespoeder zonder mannitol; (f) afbeelding van gelyofiliseerde insuline-nanodeeltjes met mannitol; (g) afbeelding van sproeidroogd insuline-nanodeeltjespoeder zonder mannitol; (h) afbeelding van sproeidroogd insuline-nanodeeltjespoeder met mannitol.
Tijdens vriesdrogen fungeert mannitol als cryoprotectant, waardoor de nanodeeltjes amorf blijven en schade door ijskristallen wordt voorkomen.¹⁹ Bij sproeidrogen is er daarentegen geen vriesstap. Daarom is mannitol bij deze methode niet nodig. Sterker nog, sproeigedroogde nanodeeltjes zonder mannitol leverden fijnere nanodeeltjes op, zoals eerder beschreven. Mannitol kan echter nog steeds als vulmiddel fungeren tijdens het sproeidroogproces om de nanodeeltjes een meer bolvormige structuur te geven²⁰ (Fig. 2d), wat bijdraagt ​​aan een uniforme afgifte van dergelijke ingekapselde nanodeeltjes. Bovendien is duidelijk te zien dat er enkele grotere deeltjes worden gedetecteerd in zowel gevriesdroogde als sproeigedroogde insuline-nanodeeltjes die mannitol bevatten (Fig. 2b,d), wat mogelijk te wijten is aan de ophoping van mannitol in de kern van het deeltje samen met de ingekapselde insuline. Het is belangrijk op te merken dat in deze studie, om ervoor te zorgen dat de bolvormige structuur intact blijft na dehydratatie, de verhouding tussen mannitol en chitosan op 5:1 is gehouden, zodat een grote hoeveelheid vulstof ook de deeltjesgrootte van de gedroogde NPs kan vergroten.
Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie met verzwakte totale reflectie (FTIR-ATR) werd gebruikt om het fysieke mengsel van vrije insuline, chitosan, chitosan, TPP en insuline te karakteriseren. Alle gedehydrateerde nanodeeltjes werden gekarakteriseerd met behulp van FTIR-ATR-spectroscopie. Opvallend was dat bandintensiteiten van 1641, 1543 en 1412 cm⁻¹ werden waargenomen in ingekapselde nanodeeltjes die gevriesdroogd waren met mannitol en in nanodeeltjes die sproeidroogd waren met en zonder mannitol (Fig. 3). Zoals eerder gerapporteerd, werden deze toenames in sterkte geassocieerd met verknoping tussen chitosan, TPP en insuline. Onderzoek naar de interactie tussen chitosan en insuline toonde aan dat in de FTIR-spectra van met insuline beladen chitosan-nanodeeltjes de chitosanband overlapte met die van insuline, waardoor de carbonylintensiteit (1641 cm⁻¹) en de amineband (1543 cm⁻¹) toenamen. De tripolyfosfaatgroepen van TPP zijn gekoppeld aan ammoniumgroepen in chitosan, die een band vormen bij 1412 cm-1.
FTIR-ATR-spectra van vrije insuline, chitosan, fysieke mengsels van chitosan/TPP/insuline en NPs die op verschillende manieren zijn gedehydrateerd.
Bovendien komen deze resultaten overeen met die van SEM, waaruit bleek dat de ingekapselde NPs intact bleven bij zowel besproeiing als vriesdrogen met mannitol. Zonder mannitol produceerde alleen besproeiing ingekapselde deeltjes. De FTIR-ATR-spectrale resultaten van NPs die zonder mannitol waren gevriesdroogd, vertoonden daarentegen grote gelijkenis met het fysieke mengsel van chitosan, TPP en insuline. Dit resultaat wijst erop dat de dwarsverbindingen tussen chitosan, TPP en insuline niet langer aanwezig zijn in NPs die zonder mannitol zijn gevriesdroogd. De structuur van de NPs werd vernietigd tijdens het vriesdrogen zonder cryoprotectant, zoals te zien is in de SEM-resultaten (Fig. 2a). Op basis van de morfologie en de FTIR-resultaten van gedehydrateerde insuline-NPs werden alleen gelyofiliseerde, besproeide en mannitolvrije NPs gebruikt voor reconstitutie-experimenten. Mannitolvrije NPs werden niet gebruikt vanwege de ontbinding van Mannitolvrije nanodeeltjes tijdens dehydratatie. Bespreek dit.
Dehydratatie wordt gebruikt voor langdurige opslag en herverwerking tot andere formuleringen. Het vermogen van droge nanodeeltjes om na opslag te reconstitueren is cruciaal voor hun gebruik in verschillende formuleringen, zoals tabletten en films. We merkten op dat de gemiddelde deeltjesgrootte van de sproeidroogde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol slechts licht toenam na reconstitutie. Daarentegen nam de deeltjesgrootte van de sproeidroogde en gevriesdroogde insuline-nanodeeltjes met mannitol significant toe (Tabel 1). PDI en EE veranderden niet significant (p > 0,05) na recombinatie van alle nanodeeltjes in dit onderzoek (Tabel 1). Dit resultaat geeft aan dat de meeste deeltjes intact bleven na heroplossing. De toevoeging van mannitol resulteerde echter in een sterk verminderde insulinebelading van gelyofiliseerde en sproeidroogde mannitol-nanodeeltjes (Tabel 1). Daarentegen bleef het insulinegehalte van nanodeeltjes die zonder mannitol waren sproeidroogd gelijk aan voorheen (Tabel 1).
Het is algemeen bekend dat de belading van nanodeeltjes cruciaal is bij gebruik voor medicijntoediening. Voor nanodeeltjes met een lage belading zijn zeer grote hoeveelheden materiaal nodig om de therapeutische drempel te bereiken. De hoge viscositeit van dergelijke hoge concentraties nanodeeltjes leidt echter tot ongemak en moeilijkheden bij respectievelijk orale toediening en injecteerbare formuleringen.²² Bovendien kunnen insuline-nanodeeltjes ook worden gebruikt voor de productie van tabletten en viskeuze biofilms^{23, 24}, waarvoor grote hoeveelheden nanodeeltjes met een lage belading nodig zijn, wat resulteert in grote tabletten en dikke biofilms die niet geschikt zijn voor orale toediening. Daarom zijn gedehydrateerde nanodeeltjes met een hoge insulinebelading zeer wenselijk. Onze resultaten suggereren dat de hoge insulinebelading van mannitolvrije, sproeidroogde nanodeeltjes veel aantrekkelijke voordelen kan bieden voor deze alternatieve toedieningsmethoden.
Alle gedehydrateerde NPs werden drie maanden in de koelkast bewaard. SEM-resultaten toonden aan dat de morfologie van alle gedehydrateerde NPs gedurende de drie maanden opslag niet significant veranderde (Fig. 4). Na reconstitutie in water vertoonden alle NPs een lichte afname in EE en gaven ze gedurende de drie maanden opslag een kleine hoeveelheid (~5%) insuline af (Tabel 2). De gemiddelde deeltjesgrootte van alle nanodeeltjes nam echter toe. De deeltjesgrootte van NPs die zonder mannitol waren gesproeidroogd, nam toe tot 525 nm, terwijl die van sproeigedroogde en gevriesdroogde NPs met mannitol respectievelijk toenam tot 872 en 921 nm (Tabel 2).
Morfologie van verschillende gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes die drie maanden zijn bewaard: (a) SEM-afbeelding van gelyofiliseerde insuline-nanodeeltjes met mannitol; (b) SEM-afbeelding van sproeidroogde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol; (c) SEM-afbeeldingen van sproeidroogde insuline-nanodeeltjes zonder mannitol.
Bovendien werden neerslagen waargenomen in de gereconstitueerde insuline-nanodeeltjes die met mannitol waren gesproeidroogd en vervolgens gevriesdroogd (Fig. S2). Dit kan worden veroorzaakt doordat grote deeltjes niet goed in het water gesuspendeerd zijn. Al deze resultaten tonen aan dat de sproeidroogtechniek insuline-nanodeeltjes kan beschermen tegen uitdroging en dat hoge concentraties insuline-nanodeeltjes kunnen worden verkregen zonder vulstoffen of cryoprotectanten.
De insulineretentie werd getest in een medium met pH = 2,5 met pepsine, trypsine en α-chymotrypsine om het beschermende vermogen van de nanodeeltjes tegen enzymatische afbraak na dehydratatie aan te tonen. De insulineretentie van gedehydrateerde nanodeeltjes werd vergeleken met die van vers bereide nanodeeltjes, waarbij vrije insuline als negatieve controle werd gebruikt. In deze studie vertoonde vrije insuline een snelle eliminatie binnen 4 uur bij alle drie de enzymatische behandelingen (Fig. 5a-c). Daarentegen toonde de insuline-eliminatietest van nanodeeltjes die gevriesdroogd waren met mannitol en nanodeeltjes die sproeidroogd waren met of zonder mannitol een significant hogere bescherming van deze nanodeeltjes tegen enzymatische afbraak, vergelijkbaar met die van vers bereide insuline-nanodeeltjes (figuur 1a-c). Met behulp van nanodeeltjes in pepsine, trypsine en α-chymotrypsine kon respectievelijk meer dan 50%, 60% en 75% van de insuline binnen 4 uur worden beschermd (Fig. 5a–c). Dit insulinebeschermende vermogen kan de kans op een hogere insuline-absorptie in de bloedbaan vergroten25. Deze resultaten suggereren dat sproeidrogen met of zonder mannitol en vriesdrogen met mannitol het insulinebeschermende vermogen van NPs na dehydratatie kunnen behouden.
Beschermings- en vrijgavegedrag van gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes: (a) bescherming van insuline in een pepsine-oplossing; (b) bescherming van insuline in een trypsine-oplossing; (c) bescherming van insuline door een α-chymotrypsine-oplossing; (d) het vrijgavegedrag van gedehydrateerde nanodeeltjes in een oplossing met pH = 2,5; (e) het vrijgavegedrag van gedehydrateerde nanodeeltjes in een oplossing met pH = 6,6; (f) het vrijgavegedrag van gedehydrateerde nanodeeltjes in een oplossing met pH = 7,0.
Vers bereide en gereconstitueerde droge insuline-nanodeeltjes werden geïncubeerd in verschillende buffers (pH = 2,5, 6,6, 7,0) bij 37 °C, ter simulatie van de pH-omgeving van de maag, twaalfvingerdarm en bovenste dunne darm, om het effect van insuline op insulineresistentie te onderzoeken. Vrijgavegedrag in verschillende omgevingen. Fragment van het maag-darmkanaal. Bij pH = 2,5 vertoonden met insuline beladen NPs en geresolubiliseerde droge insuline-NPs een initiële snelle vrijgave binnen het eerste uur, gevolgd door een langzame vrijgave gedurende de volgende 5 uur (Fig. 5d). Deze snelle vrijgave aan het begin is hoogstwaarschijnlijk het gevolg van snelle oppervlakte-desorptie van eiwitmoleculen die niet volledig geïmmobiliseerd zijn in de interne structuur van het deeltje. Bij pH = 6,5 vertoonden met insuline beladen NPs en gereconstitueerde droge insuline-NPs een geleidelijke en langzame vrijgave gedurende 6 uur, aangezien de pH van de testoplossing vergelijkbaar was met die van de oplossing waarin de NPs waren bereid (Fig. 5e). Bij pH = 7 waren de NPs instabiel en ontleedden ze vrijwel volledig binnen de eerste twee uur (Fig. 5f). Dit komt doordat deprotonering van chitosan optreedt bij een hogere pH, wat resulteert in een minder compact polymeernetwerk en een minder snelle vrijgave van de geladen insuline.
Bovendien vertoonden de insuline-nanodeeltjes die zonder mannitol waren gedroogd door middel van sproeidrogen een sneller afgifteprofiel dan de andere gedehydrateerde nanodeeltjes (Fig. 5d–f). Zoals eerder beschreven, vertoonden de gereconstitueerde insuline-nanodeeltjes die zonder mannitol waren gedroogd de kleinste deeltjesgrootte. Kleine deeltjes bieden een groter oppervlak, waardoor het grootste deel van het relevante geneesmiddel zich aan of nabij het deeltjesoppervlak bevindt, wat resulteert in een snelle geneesmiddelafgifte26.
De cytotoxiciteit van de NPs werd onderzocht met behulp van de MTT-test. Zoals weergegeven in Figuur S4, bleken alle gedehydrateerde NPs geen significant effect te hebben op de cellevensvatbaarheid bij concentraties van 50–500 μg/ml, wat suggereert dat alle gedehydrateerde NPs veilig kunnen worden gebruikt om het therapeutische venster te bereiken.
De lever is het belangrijkste orgaan waardoor insuline zijn fysiologische functies uitoefent. HepG2-cellen zijn een humane hepatomacellijn die vaak wordt gebruikt als in vitro-model voor hepatocytenopname. Hier werden HepG2-cellen gebruikt om de cellulaire opname van nanodeeltjes (NP's) te beoordelen die gedehydrateerd waren met behulp van vriesdrogen en sproeidrogen. Cellulaire opname werd gemeten met behulp van confocale laserscanning met flowcytometrie en visualisatie na enkele uren incubatie met vrije FITC-insuline in een concentratie van 25 μg/mL, vers bereide FITC-insuline-beladen NP's en gedehydrateerde FITC-insuline-beladen NP's met gelijke insulineconcentraties. Kwantitatieve microscopie (CLSM) werd uitgevoerd. Gelyofiliseerde NP's zonder mannitol werden vernietigd tijdens de dehydratatie en werden niet in deze test geëvalueerd. De intracellulaire fluorescentie-intensiteiten van vers bereide insuline-beladen NP's, gelyofiliseerde NP's met mannitol en sproeigedroogde NP's met en zonder mannitol (Fig. 6a) waren respectievelijk 4,3, 2,6, 2,4 en 4,1 keer hoger dan de vrije insulines.FITC-insulinegroep (Fig. 6b). Deze resultaten suggereren dat ingekapselde insuline effectiever is in cellulaire opname dan vrije insuline, voornamelijk vanwege de kleinere omvang van de in het onderzoek geproduceerde insuline-beladen nanodeeltjes.
Opname door HepG2-cellen na 4 uur incubatie met vers bereide NPs en gedehydrateerde NPs: (a) Distributie van FITC-insuline-opname door HepG2-cellen. (b) Geometrisch gemiddelde van fluorescentie-intensiteiten geanalyseerd met flowcytometrie (n = 3), *P < 0,05 vergeleken met vrije insuline.
De CLSM-beelden lieten eveneens zien dat de FITC-fluorescentie-intensiteiten van vers bereide FITC-insuline-beladen NPs en FITC-insuline-beladen sproeidroogde NPs (zonder mannitol) veel sterker waren dan die van de andere monsters (Fig. 6a). Bovendien verhoogde de hogere viscositeit van de oplossing door de toevoeging van mannitol de weerstand tegen cellulaire opname, wat resulteerde in een verminderde insulineproliferatie. Deze resultaten suggereren dat mannitolvrije sproeidroogde NPs de hoogste cellulaire opname-efficiëntie vertoonden, omdat hun deeltjesgrootte kleiner was dan die van gevriesdroogde NPs na heroplossing.
Chitosan (gemiddeld moleculair gewicht 100 kDa, 75-85% gedeacetyleerd) werd gekocht bij Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Natriumtripolyfosfaat (TPP) werd gekocht bij VWR (Radnor, Pennsylvania, VS). Recombinant humaan insuline gebruikt in dit onderzoek was afkomstig van Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabeld humaan insuline en 4′,6-diamidino-2-fenylindooldihydrochloride (DAPI) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). De HepG2-cellijn werd verkregen van ATCC (Manassas, Virginia, VS). Alle overige reagentia waren van analytische of chromatografische kwaliteit.
Bereid een CS-oplossing van 1 mg/ml door deze op te lossen in dubbel gedestilleerd water (DD-water) met 0,1% azijnzuur. Bereid oplossingen van TPP en insuline van 1 mg/ml door deze respectievelijk op te lossen in DD-water en 0,1% azijnzuur. De pre-emulsie werd bereid met een Polytron PCU-2-110 hogesnelheidshomogenisator (Brinkmann Ind., Westbury, NY, VS). Het bereidingsproces is als volgt: eerst wordt 2 ml TPP-oplossing toegevoegd aan 4 ml insulineoplossing en het mengsel wordt 30 minuten geroerd totdat het volledig gemengd is. Vervolgens wordt de gemengde oplossing druppelgewijs met een spuit aan de CS-oplossing toegevoegd onder krachtig roeren (10.000 tpm). De mengsels worden 30 minuten onder krachtig roeren (15.000 tpm) in een ijsbad gehouden en op een bepaalde pH-waarde gebracht om verknoopte insuline-nanodeeltjes te verkrijgen. Om de insuline verder te homogeniseren en de deeltjesgrootte te verkleinen, wordt een extra stap uitgevoerd. De NPs werden vervolgens nog 30 minuten extra gesoniceerd in een ijsbad met behulp van een sonde-type sonicator (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Duitsland).
Insuline-nanodeeltjes (NPS) werden getest op Z-gemiddelde diameter, polydispersiteitsindex (PDI) en zeta-potentiaal met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS) metingen met een Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Oostenrijk) door ze te verdunnen in gedemineraliseerd water bij 25 °C. Morfologie en grootteverdeling werden gekarakteriseerd met een Hitachi H7600 transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (Hitachi, Tokio, Japan), en de beelden werden vervolgens geanalyseerd met Hitachi beeldverwerkingssoftware (Hitachi, Tokio, Japan). Om de inkapselingsefficiëntie (EE) en laadcapaciteit (LC) van insuline-nanodeeltjes te bepalen, werden de nanodeeltjes in ultrafiltratiebuizen met een molecuulgewicht-afsnijding van 100 kDa gepipetteerd en gedurende 30 minuten gecentrifugeerd bij 500 x g. Niet-ingekapselde insuline in het filtraat werd gekwantificeerd met behulp van een Agilent 1100 Series HPLC-systeem (Agilent, Santa Clara, Californië, VS) bestaande uit een quaternaire pomp. autosampler, kolomverwarmer en DAD-detector. Insuline werd geanalyseerd met een C18-kolom (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, VS) en gedetecteerd bij 214 nm. De mobiele fase bestond uit acetonitril en water, met 0,1% TFA, gradiëntverhoudingen van 10/90 tot 100/0, en liep gedurende 10 minuten. De mobiele fase werd gepompt met een stroomsnelheid van 1,0 ml/min. De kolomtemperatuur werd ingesteld op 20 °C. Bereken de percentages EE en LC met behulp van de vergelijkingen (1) en (2).
Er werden verschillende CS/insuline-verhoudingen van 2,0 tot 4,0 getest om de insuline-nanodeeltjes te optimaliseren. Tijdens de bereiding werden verschillende hoeveelheden CS-oplossing toegevoegd, terwijl het insuline/TPP-mengsel constant werd gehouden. Insuline-nanodeeltjes werden bereid in het pH-bereik van 4,0 tot 6,5 door de pH van het mengsel zorgvuldig te controleren na toevoeging van alle oplossingen (insuline, TPP en CS). De inkapselingsefficiëntie (EE) en de deeltjesgrootte van de insuline-nanodeeltjes werden geëvalueerd bij verschillende pH-waarden en CS/insuline-massaverhoudingen om de vorming van insuline-nanodeeltjes te optimaliseren.
De geoptimaliseerde insuline-nanodeeltjes werden in een aluminium container geplaatst en afgedekt met tissuepapier dat met tape werd vastgeplakt. Vervolgens werden de afgesloten containers in een Labconco FreeZone vriesdroger (Labconco, Kansas City, MO, VS) geplaatst, uitgerust met een traydroger. De temperatuur en vacuümdruk werden ingesteld op -10 °C en 0,350 Torr gedurende de eerste 2 uur, en op 0 °C en 0,120 Torr gedurende de resterende 22 uur van de 24 uur om droge insuline-nanodeeltjes te verkrijgen.
Voor de productie van ingekapselde insuline werd de Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Zwitserland) gebruikt. De gekozen droogparameters waren: temperatuur 100 °C, toevoerdebiet 3 l/min en gasdebiet 4 l/min.
Insuline-nanodeeltjes vóór en na dehydratatie werden gekarakteriseerd met behulp van FTIR-ATR-spectroscopie. Gedehydrateerde nanodeeltjes, evenals vrije insuline en chitosan, werden geanalyseerd met een Spectrum 100 FTIR-spectrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, VS) uitgerust met een universeel ATR-monsteraccessoire (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, VS). Signaalgemiddelden werden verkregen uit 16 scans met een resolutie van 4 cm² in het frequentiebereik van 4000-600 cm².
De morfologie van droge insuline-nanodeeltjes werd beoordeeld aan de hand van SEM-afbeeldingen van gevriesdroogde en sproeidroogde insuline-nanodeeltjes, vastgelegd met een Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, VS). De belangrijkste parameters die werden gebruikt waren een spanning van 5 keV en een stroomsterkte van 30 mA.
Alle gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes werden opnieuw opgelost in gedestilleerd water. De deeltjesgrootte, PDI, EE en LC werden opnieuw getest met dezelfde methode als eerder beschreven om de kwaliteit na dehydratatie te beoordelen. De stabiliteit van anhydro-insuline-nanodeeltjes werd ook gemeten door de eigenschappen van de nanodeeltjes na langdurige opslag te testen. In deze studie werden alle nanodeeltjes na dehydratatie drie maanden in de koelkast bewaard. Na drie maanden opslag werden de nanodeeltjes getest op morfologische deeltjesgrootte, PDI, EE en LC.
Los 5 ml gereconstitueerde NPs op in 45 ml gesimuleerd maagsap (pH 1,2, met 1% pepsine), darmsap (pH 6,8, met 1% trypsine) of chymotrypsine-oplossing (100 g/ml, in fosfaatbuffer, pH 7,8) om de werkzaamheid van insuline bij de bescherming van NPs na dehydratatie te evalueren. De oplossing werd geïncubeerd bij 37 °C met een roersnelheid van 100 rpm. Op verschillende tijdstippen werd 500 μl van de oplossing afgenomen en de insulineconcentratie werd bepaald met behulp van HPLC.
Het in vitro-afgiftegedrag van vers bereide en gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes werd getest met behulp van de dialysezakmethode (moleculair gewicht cut-off 100 kDa, Spectra Por Inc.). Vers bereide en gereconstitueerde droge nanodeeltjes werden gedialyseerd in vloeistoffen met een pH van 2,5, 6,6 en 7,0 (0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) om respectievelijk de pH-omgeving van de maag, twaalfvingerdarm en bovenste dunne darm te simuleren. Alle monsters werden geïncubeerd bij 37 °C onder continu schudden met 200 rpm. De vloeistof buiten de 5 ml dialysezak werd afgezogen op de volgende tijdstippen: 0,5, 1, 2, 3, 4 en 6 uur, en het volume werd onmiddellijk aangevuld met vers dialysaat. De insulineverontreiniging in de vloeistof werd geanalyseerd met HPLC en de snelheid van insulineafgifte uit de nanodeeltjes werd berekend aan de hand van de verhouding tussen de vrijgekomen vrije insuline en de totale insuline die in de nanodeeltjes was ingekapseld. nanodeeltjes (Vergelijking 3).
De humane hepatocellulaire carcinoomcellijn HepG2-cellen werden gekweekt in schalen met een diameter van 60 mm in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum, 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine29. De culturen werden gehandhaafd bij 37 °C, 95% relatieve luchtvochtigheid en 5% CO2. Voor opnameassays werden HepG2-cellen gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen/ml op een 8-wells Nunc Lab-Tek chamber slide-systeem (Thermo Fisher, NY, VS). Voor cytotoxiciteitsassays werden ze gezaaid in 96-wells platen (Corning, NY, VS) met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/ml.
De MTT-test werd gebruikt om de cytotoxiciteit van vers bereide en gedehydrateerde insuline-nanodeeltjes te evalueren30. HepG2-cellen werden gezaaid in 96-wells platen met een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/ml en gedurende 7 dagen gekweekt voorafgaand aan de test. Insuline-nanodeeltjes werden verdund tot verschillende concentraties (50 tot 500 μg/ml) in kweekmedium en vervolgens aan de cellen toegediend. Na 24 uur incubatie werden de cellen 3 keer gewassen met PBS en gedurende nog eens 4 uur geïncubeerd met medium dat 0,5 mg/ml MTT bevatte. De cytotoxiciteit werd beoordeeld door de enzymatische reductie van geel tetrazolium MTT tot paars formazan te meten bij 570 nm met behulp van een Tecan Infinite M200 Pro spectrofotometer plaatlezer (Tecan, Männedorf, Zwitserland).
De cellulaire opname-efficiëntie van NPs werd getest met behulp van confocale laserscanmicroscopie en flowcytometrie. Elk putje van het Nunc Lab-Tek chamber slide-systeem werd behandeld met vrije FITC-insuline, met FITC-insuline beladen NPs en gereconstitueerde 25 μg/mL gedehydrateerde FITC-insuline NPs in dezelfde concentratie en gedurende 4 uur geïncubeerd. Cellen werden 3 keer gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde. De celkernen werden gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). De insulinelokalisatie werd waargenomen met behulp van een Olympus FV1000 laserscanmicroscoop/tweefoton-confocale microscoop (Olympus, Shinjuku City, Tokio, Japan). Voor flowcytometrie-analyse werden dezelfde concentraties van 10 μg/mL vrije FITC-insuline, met FITC-insuline beladen NPs en geresolubiliseerde gedehydrateerde NPs gebruikt. FITC-insuline-nanodeeltjes werden toegevoegd aan 96-wells platen die waren ingezaaid met HepG2-cellen en gedurende 4 uur geïncubeerd. Na 4 uur incubatie werden de cellen verwijderd en driemaal gewassen met foetaal runderserum (FBS). 5 × 10⁴ cellen per monster werden geanalyseerd met een BD LSR II flowcytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, Verenigde Staten).
Alle waarden worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen alle groepen werden beoordeeld met behulp van een eenweg-ANOVA of t-test met IBM SPSS Statistics 26 voor Mac (IBM, Endicott, New York, VS) en een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Deze studie toont de flexibiliteit en het vermogen van sproeidrogen aan om verknoopte chitosan/TPP/insuline-nanodeeltjes te dehydrateren met een betere reconstitutie vergeleken met standaard vriesdroogmethoden met behulp van vulstoffen of cryoprotectanten, en een hogere laadcapaciteit. De geoptimaliseerde insuline-nanodeeltjes hadden een gemiddelde deeltjesgrootte van 318 nm en een inkapselingsefficiëntie van 99,4%. SEM- en FTIR-resultaten na dehydratatie toonden aan dat de bolvormige structuur alleen behouden bleef in sproeigedroogde nanodeeltjes met en zonder mannitol en gelyofiliseerde nanodeeltjes met mannitol, terwijl gelyofiliseerde nanodeeltjes zonder mannitol tijdens de dehydratatie werden afgebroken. In de reconstitutietest vertoonden insuline-nanodeeltjes die zonder mannitol waren sproeigedroogd de kleinste gemiddelde deeltjesgrootte en de hoogste belading na reconstitutie. Het vrijgavegedrag van al deze gedehydrateerde nanodeeltjes toonde aan dat ze snel werden vrijgegeven in oplossingen met pH = 2,5 en pH = 7, en zeer stabiel waren in een oplossing met pH = 1. 6.5. In vergelijking met andere opnieuw opgeloste gedehydrateerde NP's vertoonden de NP's die zonder mannitol waren gesproeidroogd de snelste afgifte. Dit resultaat komt overeen met de waarnemingen in de cellulaire opnametest, waarbij sproeigedroogde NP's zonder mannitol de cellulaire opname-efficiëntie van vers bereide NP's vrijwel volledig behielden. Deze resultaten suggereren dat droge insuline-nanodeeltjes, bereid door mannitolvrij sproeidrogen, het meest geschikt zijn voor verdere verwerking tot andere watervrije toedieningsvormen, zoals orale tabletten of bioadhesieve films.
Vanwege intellectuele-eigendomsrechten zijn de datasets die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd niet openbaar beschikbaar, maar kunnen op redelijk verzoek bij de betreffende auteurs worden opgevraagd.
Kagan, A. Type 2 diabetes: sociale en wetenschappelijke oorsprong, medische complicaties en implicaties voor patiënten en anderen. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. & Jiang, P. De ontwikkeling van insuline-encapsulatie: is orale toediening nu mogelijk? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Recente ontwikkelingen in orale insuline-beladen liposomale toedieningssystemen voor de behandeling van diabetes. Interpretatie. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).