Dit artikel maakt deel uit van het onderzoeksthema "Verbetering van de weerstand van peulgewassen tegen ziekteverwekkers en plagen". Bekijk alle 5 artikelen.
De veroorzaker van de plantenziekte necrose, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, gebruikt een gelaagde strategie om verschillende waardplanten te infecteren. Deze studie stelt voor om het diamine L-ornithine, een niet-eiwit aminozuur dat de synthese van andere essentiële aminozuren stimuleert, te gebruiken als een alternatieve bestrijdingsstrategie om de moleculaire, fysiologische en biochemische reacties van Phaseolus vulgaris L. op witte schimmel, veroorzaakt door Pseudomonas sclerotiorum, te verbeteren. In vitro-experimenten toonden aan dat L-ornithine de myceliumgroei van S. pyrenoidosa significant remde op een dosisafhankelijke manier. Bovendien kon het de ernst van witte schimmel onder kasomstandigheden aanzienlijk verminderen. Verder stimuleerde L-ornithine de groei van de behandelde planten, wat aangeeft dat de geteste concentraties L-ornithine niet fytotoxisch waren voor de behandelde planten. Bovendien verbeterde L-ornithine de expressie van niet-enzymatische antioxidanten (totale oplosbare fenolen en flavonoïden) en enzymatische antioxidanten (katalase (CAT), peroxidase (POX) en polyfenoloxidase (PPO)), en verhoogde het de expressie van drie antioxidant-gerelateerde genen (PvCAT1, PvSOD en PvGR). Verder onthulde in silico-analyse de aanwezigheid van een vermoedelijk oxaloacetaatacetylhydrolase (SsOAH)-eiwit in het S. sclerotiorum-genoom, dat qua functionele analyse, geconserveerde domeinen en topologie sterk overeenkwam met de oxaloacetaatacetylhydrolase (SsOAH)-eiwitten van Aspergillus fijiensis (AfOAH) en Penicillium sp. (PlOAH). Interessant genoeg verminderde de toevoeging van L-ornithine aan aardappel-dextrosebouillon (PDB) de expressie van het SsOAH-gen in S. sclerotiorum-mycelia aanzienlijk. Op vergelijkbare wijze verminderde exogene toepassing van L-ornithine de expressie van het SsOAH-gen in schimmelmycelia verzameld van behandelde planten aanzienlijk. Ten slotte verminderde de toepassing van L-ornithine de oxaalzuursecretie significant, zowel in het PDB-medium als in geïnfecteerde bladeren. Concluderend speelt L-ornithine een belangrijke rol bij het handhaven van de redoxbalans en het versterken van de afweerreactie van geïnfecteerde planten. De resultaten van dit onderzoek kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van innovatieve, milieuvriendelijke methoden om witte schimmel te bestrijden en de impact ervan op de bonenproductie en andere gewassen te verminderen.
Witte schimmel, veroorzaakt door de necrotrofe schimmel Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, is een verwoestende ziekte die de opbrengst aanzienlijk vermindert en een ernstige bedreiging vormt voor de wereldwijde bonenproductie (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum is een van de moeilijkst te bestrijden bodemgebonden schimmelziekten bij planten, met een breed scala aan waardplanten van meer dan 600 plantensoorten en het vermogen om waardplantweefsels snel en op een niet-specifieke manier te verzwakken (Liang en Rollins, 2018). Onder ongunstige omstandigheden ondergaat de schimmel een kritieke fase in zijn levenscyclus, waarbij hij lange tijd inactief blijft als zwarte, harde, zaadachtige structuren, 'sclerotia' genaamd, in de bodem of als witte, pluizige uitgroeiingen in het mycelium of stengelmerg van geïnfecteerde planten (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum is in staat sclerotia te vormen, waardoor de schimmel lange tijd in geïnfecteerde velden kan overleven en de ziekte kan voortzetten (Schwartz et al., 2005). Sclerotia zijn rijk aan voedingsstoffen, kunnen lange tijd in de bodem overleven en dienen als primair inoculum voor latere infecties (Schwartz et al., 2005). Onder gunstige omstandigheden kiemen sclerotia en produceren ze via de lucht verspreide sporen die alle bovengrondse delen van de plant kunnen infecteren, waaronder, maar niet beperkt tot, bloemen, stengels of peulen (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum gebruikt een meertrapsstrategie om zijn waardplanten te infecteren, waarbij een reeks gecoördineerde gebeurtenissen plaatsvindt, van de kieming van sclerotia tot de ontwikkeling van symptomen. Aanvankelijk produceert S. sclerotiorum zwevende sporen (ascosporen genoemd) uit paddenstoelachtige structuren, apothecia genaamd. Deze sporen worden door de lucht verspreid en ontwikkelen zich tot niet-beweeglijke sclerotia op geïnfecteerde plantenresten (Bolton et al., 2006). De schimmel scheidt vervolgens oxaalzuur af, een virulentiefactor, om de pH van de plantencelwand te reguleren, enzymatische afbraak en weefselinvasie te bevorderen (Hegedus en Rimmer, 2005) en de oxidatieve burst van de waardplant te onderdrukken. Dit verzuringsproces verzwakt de plantencelwand, waardoor een gunstige omgeving ontstaat voor de normale en efficiënte werking van schimmelenzymen die de celwand afbreken (CWDE's). Hierdoor kan de pathogeen de fysieke barrière overwinnen en de weefsels van de waardplant binnendringen (Marciano et al., 1983). Eenmaal binnengedrongen, scheidt S. sclerotiorum een ​​aantal CWDE's af, zoals polygalacturonase en cellulase, die de verspreiding in geïnfecteerd weefsel vergemakkelijken en weefselnecrose veroorzaken. De progressie van laesies en schimmeldraden leidt tot de karakteristieke symptomen van witte schimmel (Hegedus en Rimmer, 2005). Gastplanten herkennen ondertussen pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) via patroonherkenningsreceptoren (PRR's), wat een reeks signaalgebeurtenissen op gang brengt die uiteindelijk afweerreacties activeren.
Ondanks decennialange inspanningen op het gebied van ziektebestrijding, blijft er, net als bij andere commerciële gewassen, een tekort aan adequaat resistent kiemplasma bestaan ​​voor bonen, vanwege de resistentie, overleving en aanpassingsvermogen van de ziekteverwekker. Ziektebestrijding is daarom een ​​enorme uitdaging en vereist een geïntegreerde, veelzijdige strategie die een combinatie van teeltmaatregelen, biologische bestrijding en chemische fungiciden omvat (O'Sullivan et al., 2021). Chemische bestrijding van witte schimmel is het meest effectief, omdat fungiciden, mits correct en op het juiste moment toegepast, de verspreiding van de ziekte effectief kunnen beheersen, de ernst van de infectie kunnen verminderen en opbrengstverliezen kunnen minimaliseren. Overmatig gebruik en een te grote afhankelijkheid van fungiciden kunnen echter leiden tot het ontstaan ​​van resistente stammen van S. sclerotiorum en een negatieve impact hebben op niet-doelorganismen, de bodemgezondheid en de waterkwaliteit (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Het vinden van milieuvriendelijke alternatieven is daarom een ​​topprioriteit geworden.
Polyamines (PA's), zoals putrescine, spermidine, spermine en cadaverine, kunnen dienen als veelbelovende alternatieven tegen in de bodem voorkomende plantpathogenen, waardoor het gebruik van gevaarlijke chemische fungiciden geheel of gedeeltelijk kan worden verminderd (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Bij hogere planten zijn PA's betrokken bij vele fysiologische processen, waaronder, maar niet beperkt tot, celdeling, differentiatie en de reactie op abiotische en biotische stress (Killiny en Nehela, 2020). Ze kunnen fungeren als antioxidanten, helpen bij het wegvangen van reactieve zuurstofsoorten (ROS), de redoxhomeostase handhaven (Nehela en Killiny, 2023), afweergerelateerde genen induceren (Romero et al., 2018), verschillende metabolische routes reguleren (Nehela en Killiny, 2023), endogene fytohormonen moduleren (Nehela en Killiny, 2019), systemische verworven resistentie (SAR) tot stand brengen en plant-pathogeeninteracties reguleren (Nehela en Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Het is belangrijk op te merken dat de specifieke mechanismen en rollen van PA's in de plantenafweer variëren afhankelijk van de plantensoort, pathogenen en omgevingsomstandigheden. De meest voorkomende PA in planten wordt gesynthetiseerd uit het essentiële polyamine L-ornithine (Killiny en Nehela, 2020).
L-ornithine speelt meerdere rollen in de groei en ontwikkeling van planten. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat ornithine bij rijst (Oryza sativa) mogelijk verband houdt met stikstofrecycling (Liu et al., 2018), rijstopbrengst, kwaliteit en aroma (Lu et al., 2020), en de reactie op waterstress (Yang et al., 2000). Bovendien verbeterde de exogene toepassing van L-ornithine de droogtetolerantie bij suikerbieten (Beta vulgaris) aanzienlijk (Hussein et al., 2019) en verminderde het zoutstress bij uien (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu en Çavuşoǧlu, 2021) en cashewnoten (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). De potentiële rol van L-ornithine in de verdediging tegen abiotische stress kan te wijten zijn aan de betrokkenheid ervan bij de accumulatie van proline in behandelde planten. Zo is bijvoorbeeld eerder gerapporteerd dat genen gerelateerd aan het proline-metabolisme, zoals de genen voor ornithine delta-aminotransferase (delta-OAT) en proline-dehydrogenase (ProDH1 en ProDH2), betrokken zijn bij de verdediging van Nicotiana benthamiana en Arabidopsis thaliana tegen niet-gastheer Pseudomonas syringae-stammen (Senthil-Kumar en Mysore, 2012). Aan de andere kant is schimmelornithine-decarboxylase (ODC) nodig voor de groei van pathogenen (Singh et al., 2020). Het uitschakelen van ODC van Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via gastheer-geïnduceerde gen-silencing (HIGS) verbeterde de resistentie van tomatenplanten tegen Fusarium-verwelking aanzienlijk (Singh et al., 2020). De potentiële rol van exogene ornithine-toepassing tegen biotische stressfactoren zoals fytopathogenen is echter nog niet goed onderzocht. Belangrijker nog is dat de effecten van ornithine op de ziekteresistentie en de daarmee samenhangende biochemische en fysiologische verschijnselen grotendeels onbekend zijn.
Inzicht in de complexiteit van de infectie van peulgewassen door Sclerotinia sclerotiorum is belangrijk voor de ontwikkeling van effectieve bestrijdingsstrategieën. In deze studie wilden we de potentiële rol van het diamine L-ornithine identificeren als een belangrijke factor in het versterken van de afweermechanismen en de resistentie van peulgewassen tegen infectie met Sclerotinia sclerotiorum. We veronderstellen dat L-ornithine, naast het versterken van de afweerreacties van geïnfecteerde planten, ook een sleutelrol speelt in het handhaven van de redoxbalans. We stellen voor dat de potentiële effecten van L-ornithine verband houden met de regulatie van enzymatische en niet-enzymatische antioxidant-afweermechanismen en de interferentie met pathogeniteits-/virulentiefactoren en geassocieerde eiwitten van de schimmel. Deze dubbele functionaliteit van L-ornithine maakt het een veelbelovende kandidaat voor een duurzame strategie om de impact van witte schimmel te verminderen en de resistentie van gangbare peulgewassen tegen deze krachtige schimmelpathogeen te versterken. De resultaten van deze studie kunnen bijdragen aan de ontwikkeling van innovatieve, milieuvriendelijke methoden om witte schimmel te bestrijden en de impact ervan op de peulgewassenproductie te verminderen.
In deze studie werd een vatbaar commercieel ras van de gewone boon, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), gebruikt als experimenteel materiaal. Gezonde zaden werden vriendelijk ter beschikking gesteld door de afdeling Peulvruchtenonderzoek van het Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypte. Vijf zaden werden gezaaid in plastic potten (binnendiameter 35 cm, diepte 50 cm) gevuld met met S. sclerotiorum geïnfecteerde grond onder kasomstandigheden (25 ± 2 °C, relatieve luchtvochtigheid 75 ± 1%, 8 uur licht/16 uur donker). Zeven tot tien dagen na het zaaien werden de zaailingen uitgedund, zodat er slechts twee zaailingen met een gelijkmatige groei en drie volledig ontwikkelde bladeren per pot overbleven. Alle potplanten werden eens in de twee weken water gegeven en maandelijks bemest volgens de aanbevolen dosering voor het betreffende ras.
Om een ​​concentratie van 500 mg/L L-ornithinediamine (ook bekend als (+)-(S)-2,5-diaminopentanoïnezuur; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) te bereiden, werd eerst 50 mg opgelost in 100 ml steriel gedestilleerd water. De stamoplossing werd vervolgens verdund en gebruikt in de daaropvolgende experimenten. Kort gezegd werden zes series L-ornithineconcentraties (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) in vitro getest. Daarnaast werd steriel gedestilleerd water gebruikt als negatieve controle (mock) en het commerciële fungicide "Rizolex-T" 50% bevochtigbaar poeder (toclofos-methyl 20% + thiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, gouvernement Gharbia, Egypte) als positieve controle. Het commerciële fungicide “Rizolex-T” werd in vitro getest bij vijf concentraties (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L).
Er werden monsters van stengels en peulen van gewone bonen met typische symptomen van witte schimmel (besmettingsgraad: 10-30%) verzameld van commerciële kwekerijen. Hoewel de meeste geïnfecteerde plantmaterialen werden geïdentificeerd op soort/variëteit (vatbare commerciële variëteit Giza 3), waren andere, met name die afkomstig van lokale markten, van onbekende soort. De verzamelde geïnfecteerde materialen werden eerst gedesinfecteerd met een 0,5% natriumhypochlorietoplossing gedurende 3 minuten, vervolgens meerdere malen gespoeld met steriel gedestilleerd water en drooggedept met steriel filtreerpapier om overtollig water te verwijderen. De geïnfecteerde delen werden vervolgens in kleine stukjes gesneden uit het middelste weefsel (tussen gezond en geïnfecteerd weefsel), gekweekt op aardappel-dextrose-agar (PDA) en geïncubeerd bij 25 ± 2 °C met een licht-donkercyclus van 12 uur licht/12 uur donker gedurende 5 dagen om de vorming van sclerotia te stimuleren. De myceliumtipmethode werd ook gebruikt om schimmelisolaten te zuiveren uit gemengde of verontreinigde culturen. Het gezuiverde schimmelisolaat werd eerst geïdentificeerd op basis van zijn morfologische kenmerken in de kweek en vervolgens bevestigd als S. sclerotiorum op basis van microscopische kenmerken. Ten slotte werden alle gezuiverde isolaten getest op pathogeniciteit op het vatbare bonenras Giza 3 om te voldoen aan de postulaten van Koch.
Bovendien werd het meest invasieve S. sclerotiorum-isolaat (isolaat nr. 3) verder bevestigd op basis van interne getranscribeerde spacer (ITS)-sequencing zoals beschreven door White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kort gezegd werden isolaten gekweekt in aardappel-dextrosebouillon (PDB) en geïncubeerd bij 25 ± 2 °C gedurende 5-7 dagen. Het schimmelmycelium werd vervolgens verzameld, gefilterd door kaasdoek, tweemaal gewassen met steriel water en gedroogd met steriel filtreerpapier. Genomisch DNA werd geïsoleerd met behulp van de Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Het ITS rDNA-gebied werd vervolgens geamplificeerd met behulp van het specifieke primerpaar ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; verwachte grootte: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). De gezuiverde PCR-producten werden ter sequentiebepaling aangeboden (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). De ITS rDNA-sequenties werden bidirectioneel gesequenced met behulp van de Sanger-sequencingmethode. De samengestelde querysequenties werden vervolgens vergeleken met de meest recente gegevens in GenBank en het National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) met behulp van BLASTn-software. De querysequentie werd vergeleken met 20 andere S. sclerotiorum-stammen/isolaten uit de meest recente gegevens in NCBI GenBank (aanvullende tabel S1) met behulp van ClustalW in het Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; versie 11) (Kumar et al., 2024). Evolutionaire analyse werd uitgevoerd met behulp van de maximum likelihood-methode en het algemene tijdreversibele nucleotide-substitutiemodel (Nei en Kumar, 2000). De boom met de hoogste log-likelihood wordt weergegeven. De initiële boom voor de heuristische zoektocht wordt geselecteerd door de boom met de hoogste log-likelihood te kiezen tussen de neighbor-joining (NJ)-boom (Kumar et al., 2024) en de maximum parsimony (MP)-boom. De NJ-boom werd geconstrueerd met behulp van een paarsgewijze afstandsmatrix berekend met behulp van het algemene tijdreversibele model (Nei en Kumar, 2000).
De antibacteriële activiteit van L-ornithine en het bactericide "Rizolex-T" werd in vitro bepaald met behulp van de agar-diffusiemethode. Methode: Neem een ​​geschikte hoeveelheid van de stamoplossing van L-ornithine (500 mg/L) en meng deze grondig met 10 ml PDA-voedingsmedium om oplossingen te bereiden met eindconcentraties van respectievelijk 12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L. Vijf concentraties van het fungicide "Rizolex-T" (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L) en steriel gedestilleerd water werden gebruikt als controle. Nadat het medium was gestold, werd een vers bereide myceliumprop van een Sclerotinia sclerotiorum-cultuur met een diameter van 4 mm in het midden van de petrischaal geplaatst en gekweekt bij 25 ± 2 °C totdat het mycelium de gehele petrischaal bedekte. Vervolgens werd de schimmelgroei geregistreerd. Bereken het percentage remming van de radiale groei van S. sclerotiorum met behulp van vergelijking 1:
Het experiment werd tweemaal herhaald, met zes biologische replicaten voor elke controle-/experimentele groep en vijf potten (twee planten per pot) voor elk biologisch replicaat. Elk biologisch replicaat werd tweemaal geanalyseerd (twee technische replicaten) om de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten te waarborgen. Daarnaast werd probitregressieanalyse gebruikt om de halfmaximale remmende concentratie (IC50) en IC99 te berekenen (Prentice, 1976).
Om het potentieel van L-ornithine onder kasomstandigheden te evalueren, werden twee opeenvolgende potproeven uitgevoerd. Kort gezegd werden potten gevuld met gesteriliseerde klei-zandgrond (3:1) en geïnoculeerd met een vers bereide kweek van S. sclerotiorum. Eerst werd het meest invasieve isolaat van S. sclerotiorum (isolaat nr. 3) gekweekt door een sclerotium doormidden te snijden, het ondersteboven op een PDA-agarplaat te plaatsen en gedurende 4 dagen bij 25 °C in constante duisternis (24 uur) te incuberen om de myceliumgroei te stimuleren. Vervolgens werden vier agarpluggen met een diameter van 5 mm van de voorrand genomen en geïnoculeerd met 100 g van een steriel mengsel van tarwe- en rijstzemelen (1:1, v/v). Alle kolven werden vervolgens gedurende 5 dagen bij 25 ± 2 °C geïncubeerd onder een licht-donkercyclus van 12 uur licht/12 uur donker om de vorming van sclerotia te stimuleren. De inhoud van alle kolven werd grondig gemengd om homogeniteit te garanderen voordat de grond werd toegevoegd. Vervolgens werd aan elke pot 100 g van het kolonisatiemengsel van zemelen toegevoegd om een ​​constante concentratie van ziekteverwekkers te garanderen. De geïnoculeerde potten werden bewaterd om de schimmelgroei te activeren en gedurende 7 dagen in een kas geplaatst.
Vervolgens werden in elke pot vijf zaden van de Giza 3-variëteit gezaaid. Voor de potten die behandeld werden met L-ornithine en het fungicide Rizolex-T, werden de gesteriliseerde zaden eerst twee uur geweekt in een waterige oplossing van de twee stoffen met een uiteindelijke IC99-concentratie van respectievelijk ongeveer 250 mg/L en 50 mg/L, en daarna een uur aan de lucht gedroogd alvorens te zaaien. Als negatieve controle werden de zaden daarentegen geweekt in steriel gedestilleerd water. Na 10 dagen, vóór de eerste watergift, werden de zaailingen uitgedund, zodat er slechts twee nette zaailingen in elke pot overbleven. Om infectie met S. sclerotiorum te garanderen, werden stengels van bonenplanten in hetzelfde ontwikkelingsstadium (10 dagen) op twee verschillende plaatsen doorgesneden met een gesteriliseerd scalpel. In elke wond werd ongeveer 0,5 g van het koloniserende zemelenmengsel aangebracht, waarna een hoge luchtvochtigheid werd gecreëerd om infectie en ziekteontwikkeling in alle geïnoculeerde planten te stimuleren. De controleplanten werden op dezelfde manier verwond en een gelijke hoeveelheid (0,5 g) steriel, niet-gekoloniseerd zemelenmengsel werd in de wond aangebracht en onder hoge luchtvochtigheid gehouden om de omstandigheden voor ziekteontwikkeling te simuleren en consistentie tussen de behandelingsgroepen te waarborgen.
Behandelingsmethode: Bonenzaailingen werden bewaterd met 500 ml van een waterige oplossing van L-ornithine (250 mg/l) of het fungicide Rizolex-T (50 mg/l) door de grond te besproeien. Deze behandeling werd driemaal herhaald met een interval van 10 dagen. De placebo-behandelde controleplanten werden bewaterd met 500 ml steriel gedestilleerd water. Alle behandelingen werden uitgevoerd onder kasomstandigheden (25 ± 2 °C, 75 ± 1% relatieve luchtvochtigheid en een fotoperiode van 8 uur licht/16 uur donker). Alle potten werden tweewekelijks bewaterd en maandelijks behandeld met een uitgebalanceerde NPK-meststof (20-20-20, met 3,6% zwavel en sporenelementen; Zain Seeds, Egypte) in een concentratie van 3-4 g/l door middel van bladbespuiting, volgens de aanbevelingen voor het specifieke ras en de instructies van de fabrikant. Tenzij anders vermeld, werden volledig ontwikkelde, rijpe bladeren (het 2e en 3e blad vanaf de bovenkant) van elke biologische replicatie 72 uur na de behandeling (hpt) verzameld, gehomogeniseerd, samengevoegd en bewaard bij -80 °C voor verdere analyses, waaronder, maar niet beperkt tot, in situ histochemische lokalisatie van indicatoren voor oxidatieve stress, lipideperoxidatie, enzymatische en niet-enzymatische antioxidanten en genexpressie.
De infectie-intensiteit van witte schimmel werd wekelijks beoordeeld, 21 dagen na inoculatie (dpi), met behulp van een schaal van 1-9 (aanvullende tabel S2), gebaseerd op de schaal van Petzoldt en Dickson (1996), aangepast door Teran et al. (2006). Kort gezegd werden de stengels en takken van bonenplanten onderzocht vanaf het inoculatiepunt om de voortgang van de laesies langs internodiën en knopen te volgen. De afstand van de laesie vanaf het inoculatiepunt tot het verste punt langs de stengel of tak werd vervolgens gemeten en een score van 1-9 werd toegekend op basis van de locatie van de laesie, waarbij (1) aangaf dat er geen zichtbare infectie nabij het inoculatiepunt was en (2-9) een geleidelijke toename in laesiegrootte en voortgang langs knopen/internodium aangaven (aanvullende tabel S2). De infectie-intensiteit van witte schimmel werd vervolgens omgerekend naar een percentage met behulp van formule 2:
Daarnaast werd het oppervlak onder de ziekteprogressiecurve (AUDPC) berekend met behulp van de formule (Shaner en Finney, 1977), die recentelijk is aangepast voor witrot bij gewone bonen (Chauhan et al., 2020) met behulp van vergelijking 3:
Waarbij Yi = ziekte-ernst op tijdstip ti, Yi+1 = ziekte-ernst op het volgende tijdstip ti+1, ti = tijdstip van de eerste meting (in dagen), ti+1 = tijdstip van de volgende meting (in dagen), n = totaal aantal meetpunten of observatiepunten. Groeiparameters van de bonenplant, waaronder planthoogte (cm), aantal takken per plant en aantal bladeren per plant, werden gedurende 21 dagen wekelijks geregistreerd in alle biologische replicaten.
In elke biologische replicatie werden bladmonsters (tweede en derde volledig ontwikkelde bladeren vanaf de top) verzameld op dag 45 na de behandeling (15 dagen na de laatste behandeling). Elke biologische replicatie bestond uit vijf potten (twee planten per pot). Ongeveer 500 mg van het fijngemaakte weefsel werd gebruikt voor de extractie van fotosynthetische pigmenten (chlorofyl a, chlorofyl b en carotenoïden) met 80% aceton bij 4 °C in het donker. Na 24 uur werden de monsters gecentrifugeerd en werd het supernatant verzameld voor de colorimetrische bepaling van het gehalte aan chlorofyl a, chlorofyl b en carotenoïden met behulp van een UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) volgens de methode van Lichtenthaler (1987) door de absorptie te meten bij drie verschillende golflengten (A470, A646 en A663 nm). Tot slot werd het gehalte aan fotosynthetische pigmenten berekend met behulp van de volgende formules 4–6, zoals beschreven door Lichtenthaler (1987).
Na 72 uur na de behandeling (hpt) werden bladeren (het tweede en derde volledig ontwikkelde blad vanaf de top) van elke biologische replicatie verzameld voor in situ histochemische lokalisatie van waterstofperoxide (H2O2) en superoxide-anion (O2•−). Elke biologische replicatie bestond uit vijf potten (twee planten per pot). Elke biologische replicatie werd in duplo geanalyseerd (twee technische replicaten) om de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de methode te waarborgen. H2O2 en O2•− werden bepaald met behulp van respectievelijk 0,1% 3,3′-diaminobenzidine (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) of nitroblauwtetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland), volgens de methoden beschreven door Romero-Puertas et al. (2004) en Adam et al. (1989) met kleine aanpassingen. Voor histochemische lokalisatie van H2O2 in situ werden kleppen vacuüm geïnfiltreerd met 0,1% DAB in 10 mM Tris-buffer (pH 7,8) en vervolgens 60 minuten bij kamertemperatuur in het licht geïncubeerd. De kleppen werden gebleekt in 0,15% (v/v) TCA in een 4:1 (v/v) ethanol:chloroform-mengsel (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypte) en vervolgens aan licht blootgesteld totdat ze donkerder werden. Op dezelfde manier werden kleppen vacuüm geïnfiltreerd met 10 mM kaliumfosfaatbuffer (pH 7,8) met 0,1 w/v % HBT voor histochemische lokalisatie van O2•− in situ. De kleppen werden 20 minuten bij kamertemperatuur in het licht geïncubeerd, vervolgens gebleekt zoals hierboven beschreven en daarna belicht totdat donkerblauwe/violette vlekken verschenen. De intensiteit van de resulterende bruine kleur (als indicator voor H2O2) of blauwviolette kleur (als indicator voor O2•−) werd beoordeeld met behulp van de Fiji-versie van het beeldverwerkingsprogramma ImageJ (http://fiji.sc; geraadpleegd op 7 maart 2024).
Malondialdehyde (MDA; als marker voor lipideperoxidatie) werd bepaald volgens de methode van Du en Bramlage (1992) met enkele kleine aanpassingen. Bladeren van elke biologische replicatie (het tweede en derde volledig ontwikkelde blad vanaf de top) werden 72 uur na de behandeling (hpt) verzameld. Elke biologische replicatie bestond uit vijf potten (twee planten per pot). Elke biologische replicatie werd in duplo geanalyseerd (twee technische replicaten) om de nauwkeurigheid, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de methode te waarborgen. Kort gezegd werd 0,5 g gemalen bladweefsel gebruikt voor de MDA-extractie met 20% trichloorazijnzuur (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, VS) dat 0,01% gebutyleerd hydroxytolueen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) bevatte. Het MDA-gehalte in het supernatant werd vervolgens colorimetrisch bepaald door de absorptie bij 532 en 600 nm te meten met behulp van een UV-160A-spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) en vervolgens uitgedrukt als nmol g−1 FW.
Voor de beoordeling van niet-enzymatische en enzymatische antioxidanten werden bladeren (het tweede en derde volledig ontwikkelde blad vanaf de top) verzameld van elke biologische replicatie 72 uur na de behandeling (hpt). Elke biologische replicatie bestond uit vijf potten (twee planten per pot). Elk biologisch monster werd in tweevoud geanalyseerd (twee technische monsters). Twee bladeren werden fijngemalen met vloeibare stikstof en direct gebruikt voor de bepaling van enzymatische en niet-enzymatische antioxidanten, totale aminozuren, prolinegehalte, genexpressie en oxalaatkwantificering.
De totale hoeveelheid oplosbare fenolen werd bepaald met behulp van het Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) met lichte aanpassingen aan de methode beschreven door Kahkonen et al. (1999). Kort gezegd werd ongeveer 0,1 g gehomogeniseerd bladweefsel geëxtraheerd met 20 ml 80% methanol in het donker gedurende 24 uur en werd het supernatant na centrifugatie verzameld. 0,1 ml van het extract werd gemengd met 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10%), 30 seconden geschud en 5 minuten in het donker bewaard. Vervolgens werd aan elk buisje 0,5 ml 20% natriumcarbonaatoplossing (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypte) toegevoegd, grondig gemengd en 1 uur bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na incubatie werd de absorptie van het reactiemengsel gemeten bij 765 nm met behulp van een UV-160A-spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De concentratie van de totale oplosbare fenolen in de extracten werd bepaald met behulp van een galluszuurkalibratiecurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, VS) en uitgedrukt als milligram galluszuurequivalent per gram vers gewicht (mg GAE g-1 vers gewicht).
Het totale gehalte aan oplosbare flavonoïden werd bepaald volgens de methode van Djeridane et al. (2006) met enkele kleine aanpassingen. Kort gezegd werd 0,3 ml van het bovengenoemde methanolextract gemengd met 0,3 ml van een 5% aluminiumchlorideoplossing (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, VS), krachtig geroerd en vervolgens 5 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werd 0,3 ml van een 10% kaliumacetaatoplossing (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypte) toegevoegd, grondig gemengd en 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd. Na incubatie werd de absorptie van het reactiemengsel gemeten bij 430 nm met behulp van een UV-160A-spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). De concentratie van totale oplosbare flavonoïden in de extracten van de monsters werd bepaald met behulp van een rutine-kalibratiecurve (TCI America, Portland, OR, VS) en vervolgens uitgedrukt als milligram rutine-equivalent per gram vers gewicht (mg RE g-1 vers gewicht).
Het totale gehalte aan vrije aminozuren in bonenbladeren werd bepaald met behulp van een gemodificeerd ninhydrinereagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS), gebaseerd op de methode voorgesteld door Yokoyama en Hiramatsu (2003) en aangepast door Sun et al. (2006). Kort gezegd werd 0,1 g gemalen weefsel geëxtraheerd met een buffer met pH 5,4, waarna 200 μL van het supernatant reageerde met 200 μL ninhydrine (2%) en 200 μL pyridine (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, VS). Dit mengsel werd 30 minuten in een kokendwaterbad geïncubeerd, vervolgens afgekoeld en gemeten bij 580 nm met een UV-160A spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Proline werd daarentegen bepaald met de Bates-methode (Bates et al., 1973). Proline werd geëxtraheerd met 3% sulfosalicylzuur (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS) en na centrifugatie werd 0,5 ml van het supernatant gemengd met 1 ml ijsazijn (Fisher Scientific, Hampton, NH, VS) en ninhydrine-reagens. Dit mengsel werd 45 minuten bij 90 °C geïncubeerd, afgekoeld en vervolgens gemeten bij 520 nm met dezelfde spectrofotometer als hierboven. De totale hoeveelheid vrije aminozuren en proline in de bladextracten werd bepaald met behulp van respectievelijk glycine- en proline-kalibratiecurves (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en uitgedrukt als mg/g vers gewicht.
Om de enzymatische activiteit van antioxidatieve enzymen te bepalen, werd ongeveer 500 mg gehomogeniseerd weefsel geëxtraheerd met 3 ml 50 mM Tris-buffer (pH 7,8) met 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en 7,5% polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS), gecentrifugeerd bij 10.000 × g gedurende 20 min in de koelkast (4 °C), en het supernatant (ruw enzymextract) werd verzameld (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Catalase (CAT) werd vervolgens gereageerd met 2 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) en 100 μl 269 mM H2O2-oplossing om de enzymatische activiteit te bepalen volgens de methode van Aebi (1984) met lichte aanpassingen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). De enzymatische activiteit van guaiacol-afhankelijke peroxidase (POX) werd bepaald met behulp van de methode van Harrach et al. (2009). (2008) met kleine aanpassingen (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) en de enzymatische activiteit van polyfenoloxidase (PPO) werd bepaald na reactie met 2,2 ml 100 mM natriumfosfaatbuffer (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, VS) en 100 μl 12 mM H2O2. De methode werd licht aangepast van (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). De test werd uitgevoerd na reactie met 3 ml catecholoplossing (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, VS) (0,01 M), vers bereid in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 6,0). De CAT-activiteit werd gemeten door de ontleding van H2O2 bij 240 nm (A240) te volgen, de POX-activiteit werd gemeten door de toename in absorptie bij 436 nm (A436) te volgen, en de PPO-activiteit werd gemeten door de fluctuaties in absorptie bij 495 nm (A495) elke 30 seconden gedurende 3 minuten te registreren met behulp van een UV-160A-spectrofotometer (Shimadzu, Japan).
Real-time RT-PCR werd gebruikt om de transcriptieniveaus van drie antioxidant-gerelateerde genen te detecteren, waaronder peroxisomale catalase (PvCAT1; GenBank-toegangsnummer KF033307.1), superoxide dismutase (PvSOD; GenBank-toegangsnummer XM_068639556.1) en glutathionreductase (PvGR; GenBank-toegangsnummer KY195009.1), in bonenbladeren (de tweede en derde volledig ontwikkelde bladeren vanaf de top) 72 uur na de laatste behandeling. Kort gezegd werd RNA geïsoleerd met behulp van de Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat.nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) volgens het protocol van de fabrikant. Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd met behulp van de TOP script™ cDNA Synthesis Kit volgens de instructies van de fabrikant. De primersequenties van de bovengenoemde drie genen staan ​​vermeld in Aanvullende Tabel S3. PvActin-3 (GenBank-toegangsnummer: XM_068616709.1) werd gebruikt als housekeeping-gen en de relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2-ΔΔCT-methode (Livak en Schmittgen, 2001). De stabiliteit van actine onder biotische stress (incompatibele interactie tussen gewone peulvruchten en de anthracnose-schimmel Colletotrichum lindemuthianum) en abiotische stress (droogte, zoutgehalte, lage temperatuur) werd aangetoond (Borges et al., 2012).
We hebben in eerste instantie een genoombrede in silico-analyse uitgevoerd van oxaloacetaatacetylhydrolase (OAH)-eiwitten in S. sclerotiorum met behulp van de proteïne-proteïne BLAST-tool (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kort gezegd gebruikten we OAH van Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; GenBank-toegangsnummer XP_040799428.1; 342 aminozuren) en Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; GenBank-toegangsnummer XP_056833920.1; 316 aminozuren) als zoeksequenties om het homologe eiwit in S. sclerotiorum (taxide: 5180) in kaart te brengen. Er werd een BLASTp-analyse uitgevoerd op de meest recent beschikbare genoomgegevens van S. sclerotiorum in GenBank op de website van het National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Daarnaast werden het voorspelde OAH-gen van S. sclerotiorum (SsOAH) en de evolutionaire analyse en fylogenetische boom van AfOAH van A. fijiensis CBS 313.89 en PlOAH van P. lagena afgeleid met behulp van de maximum likelihood-methode in MEGA11 (Tamura et al., 2021) en het op de JTT-matrix gebaseerde model (Jones et al., 1992). De fylogenetische boom werd gecombineerd met de meervoudige alignment-analyse van eiwitsequenties van alle voorspelde OAH-genen (SsOAH) van S. sclerotiorum en de querysequentie met behulp van de Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos en Agarwala, 2007). Daarnaast werden de best overeenkomende aminozuursequenties van SsOAH uit S. sclerotiorum uitgelijnd met de querysequenties (AfOAH en PlOAH) (Larkin et al., 2007) met behulp van ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), en werden geconserveerde regio's in de uitlijning gevisualiseerd met behulp van de ESPript-tool (versie 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Bovendien werden de voorspelde functionele representatieve domeinen en geconserveerde sites van S. sclerotiorum SsOAH interactief geclassificeerd in verschillende families met behulp van de InterPro-tool (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Ten slotte werd een driedimensionale (3D) structuurmodellering van de voorspelde S. sclerotiorum SsOAH uitgevoerd met behulp van de Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-server versie 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) en gevalideerd met behulp van de SWISS-MODEL-server (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De voorspelde driedimensionale structuren (PDB-formaat) werden interactief gevisualiseerd met behulp van het UCSF-Chimera-pakket (versie 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Kwantitatieve real-time fluorescentie-PCR werd gebruikt om het transcriptieniveau van oxaloacetaatacetylhydrolase (SsOAH; GenBank-toegangsnummer: XM_001590428.1) in de mycelia van Sclerotinia sclerotiorum te bepalen. Kort gezegd werd S. sclerotiorum geënt in een kolf met PDB en in een schudincubator (model: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VS) geplaatst bij 25 ± 2 °C gedurende 24 uur bij 150 rpm en in constante duisternis (24 uur) om de myceliumgroei te stimuleren. Vervolgens werden de cellen behandeld met L-ornithine en het fungicide Rizolex-T in eindconcentraties van de IC50 (respectievelijk ongeveer 40 en 3,2 mg/L) en daarna nog 24 uur onder dezelfde omstandigheden gekweekt. Na incubatie werden de culturen gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 tpm en werd het supernatant (schimmelmycelium) verzameld voor genexpressieanalyse. Op dezelfde manier werd schimmelmycelium verzameld op 0, 24, 48, 72, 96 en 120 uur na infectie van geïnfecteerde planten die witte schimmel en katoenachtig mycelium hadden gevormd op het oppervlak van geïnfecteerd weefsel. RNA werd geëxtraheerd uit het schimmelmycelium en vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd zoals hierboven beschreven. De primersequenties voor SsOAH staan ​​vermeld in Aanvullende Tabel S3. SsActin (GenBank-toegangsnummer: XM_001589919.1) werd gebruikt als housekeeping-gen en de relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2-ΔΔCT-methode (Livak en Schmittgen, 2001).
Oxaalzuur werd bepaald in aardappel-dextrosebouillon (PDB) en plantenmonsters die de schimmelpathogeen Sclerotinia sclerotiorum bevatten, volgens de methode van Xu en Zhang (2000) met enkele kleine aanpassingen. Kort gezegd werden S. sclerotiorum-isolaten geënt in kolven met PDB en vervolgens gekweekt in een schudincubator (model I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, VS) bij 150 tpm en 25 ± 2 °C gedurende 3-5 dagen in constante duisternis (24 uur) om de myceliumgroei te stimuleren. Na incubatie werd de schimmelcultuur eerst gefilterd door Whatman #1 filterpapier en vervolgens gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 tpm om resterend mycelium te verwijderen. Het supernatant werd verzameld en bewaard bij 4 °C voor verdere kwantitatieve bepaling van oxalaat. Voor de preparatie van plantenmonsters werden ongeveer 0,1 g plantenweefselfragmenten driemaal geëxtraheerd met gedestilleerd water (telkens 2 ml). De monsters werden vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd bij 2500 tpm. Het supernatant werd droog gefilterd door Whatman nr. 1 filterpapier en verzameld voor verdere analyse.
Voor de kwantitatieve analyse van oxaalzuur werd het reactiemengsel in een glazen buis met stop bereid in de volgende volgorde: 0,2 ml monster (of PDB-kweekfiltraat of oxaalzuurstandaardoplossing), 0,11 ml broomfenolblauw (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, VS), 0,198 ml 1 M zwavelzuur (H₂SO₄; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Caïro, Egypte) en 0,176 ml 100 mM kaliumdichromaat (K₂Cr₂O₇; TCI Chemicals, Portland, OR, VS). Vervolgens werd de oplossing aangevuld tot 4,8 ml met gedestilleerd water, krachtig gemengd en onmiddellijk in een waterbad van 60 °C geplaatst. Na 10 minuten werd de reactie gestopt door toevoeging van 0,5 ml natriumhydroxideoplossing (NaOH; 0,75 M). De absorptie (A600) van het reactiemengsel werd gemeten bij 600 nm met behulp van een UV-160 spectrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB en gedestilleerd water werden gebruikt als controles voor respectievelijk de kwantificering van kweekfiltraten en plantenmonsters. De oxaalzuurconcentraties in de kweekfiltraten, uitgedrukt als microgram oxaalzuur per milliliter PDB-medium (μg.mL−1), en in de bladextracten, uitgedrukt als microgram oxaalzuur per gram vers gewicht (μg.g−1 FW), werden bepaald met behulp van een oxaalzuurkalibratiecurve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Gedurende het onderzoek werden alle experimenten uitgevoerd volgens een volledig gerandomiseerd ontwerp (CRD) met zes biologische replicaten per behandeling en vijf potten per biologisch replicaat (twee planten per pot), tenzij anders vermeld. Biologische replicaten werden in duplo geanalyseerd (twee technische replicaten). Technische replicaten werden gebruikt om de reproduceerbaarheid van hetzelfde experiment te controleren, maar werden niet meegenomen in de statistische analyse om valse replicaten te voorkomen. De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de Tukey-Kramer honestly significant difference (HSD)-test (p ≤ 0,05). Voor in vitro-experimenten werden IC50- en IC99-waarden berekend met behulp van het probitmodel en werden 95%-betrouwbaarheidsintervallen berekend.
In totaal werden vier isolaten verzameld uit verschillende sojavelden in het gouvernement El Ghabiya, Egypte. Op PDA-medium produceerden alle isolaten crèmewit mycelium dat snel katoenwit werd (Figuur 1A) en vervolgens beige of bruin in het sclerotiumstadium. Sclerotia zijn meestal dicht, zwart, bolvormig of onregelmatig van vorm, 5,2 tot 7,7 mm lang en 3,4 tot 5,3 mm in diameter (Figuur 1B). Hoewel vier isolaten na 10-12 dagen incubatie bij 25 ± 2 °C een marginaal patroon van sclerotia aan de rand van het kweekmedium ontwikkelden (Figuur 1A), verschilde het aantal sclerotia per plaat significant tussen de isolaten (P < 0,001), waarbij isolaat 3 het hoogste aantal sclerotia had (32,33 ± 1,53 sclerotia per plaat; Figuur 1C). Isolaat #3 produceerde eveneens meer oxaalzuur in PDB dan andere isolaten (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). Isolaat #3 vertoonde typische morfologische en microscopische kenmerken van de fytopathogene schimmel Sclerotinia sclerotiorum. Zo groeiden de kolonies van isolaat #3 op PDA snel, waren ze crèmewit (Figuur 1A), omgekeerd beige of licht zalmgeelbruin, en hadden ze 6-7 dagen nodig bij 25 ± 2°C om het oppervlak van een plaat met een diameter van 9 cm volledig te bedekken. Op basis van de bovenstaande morfologische en microscopische kenmerken werd isolaat #3 geïdentificeerd als Sclerotinia sclerotiorum.
Figuur 1. Kenmerken en pathogeniciteit van S. sclerotiorum-isolaten van gangbare peulgewassen. (A) Myceliumgroei van vier S. sclerotiorum-isolaten op PDA-medium, (B) sclerotia van vier S. sclerotiorum-isolaten, (C) aantal sclerotia (per plaat), (D) oxaalzuursecretie op PDB-medium (μg.mL−1), en (E) ziekte-ernst (%) van vier S. sclerotiorum-isolaten op het vatbare commerciële peulgewas Giza 3 onder kasomstandigheden. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van vijf biologische replicaten (n = 5). Verschillende letters geven statistisch significante verschillen tussen behandelingen aan (p < 0,05). (F–H) Typische symptomen van witte schimmel verschenen respectievelijk op bovengrondse stengels en peulen, 10 dagen na inoculatie met isolaat nr. 3 (dpi). (I) Een evolutionaire analyse van het interne getranscribeerde spacer (ITS)-gebied van S. sclerotiorum-isolaat nr. 3 werd uitgevoerd met behulp van de maximum likelihood-methode en vergeleken met 20 referentie-isolaten/stammen uit de database van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). De getallen boven de clusterlijnen geven de dekking van het gebied (%) aan, en de getallen onder de clusterlijnen geven de taklengte aan.
Om de pathogeniciteit te bevestigen, werden bovendien vier verkregen S. sclerotiorum-isolaten gebruikt om het vatbare commerciële bonenras Giza 3 te inoculeren onder kasomstandigheden, wat overeenkomt met de postulaten van Koch (Fig. 1E). Hoewel alle verkregen schimmelisolaten pathogeen waren en de sperzieboon (cv. Giza 3) konden infecteren, met typische witte schimmelsymptomen op alle bovengrondse delen (Fig. 1F), met name op de stengels (Fig. 1G) en peulen (Fig. 1H) 10 dagen na inoculatie (dpi), bleek isolaat 3 het meest agressieve isolaat in twee onafhankelijke experimenten. Isolaat 3 vertoonde de hoogste ziekte-ernst (%) op bonenplanten (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 en 76,7 ± 3,1 respectievelijk 7, 14 en 21 dagen na infectie; Figuur 1F).
De identificatie van het meest invasieve S. sclerotiorum-isolaat #3 werd verder bevestigd op basis van sequencing van de interne getranscribeerde spacer (ITS) (Fig. 1I). Fylogenetische analyse tussen isolaat #3 en 20 referentie-isolaten/stammen toonde een hoge mate van gelijkenis (>99%). Het is opmerkelijk dat S. sclerotiorum-isolaat #3 (533 bp) een hoge mate van gelijkenis vertoont met het Amerikaanse S. sclerotiorum-isolaat LPM36, geïsoleerd uit droge erwtenzaden (GenBank-toegangsnummer MK896659.1; 540 bp), en het Chinese S. sclerotiorum-isolaat YKY211 (GenBank-toegangsnummer OR206374.1; 548 bp), dat stengelrot bij viooltjes (Matthiola incana) veroorzaakt. Al deze isolaten zijn afzonderlijk gegroepeerd aan de top van het dendrogram (Figuur 1I). De nieuwe sequentie is gedeponeerd in de NCBI-database en heeft de naam “Sclerotinia sclerotiorum – isolaat YN-25” (GenBank-toegangsnummer PV202792). Het is duidelijk dat isolaat 3 het meest invasieve isolaat is; daarom is dit isolaat gekozen voor onderzoek in alle daaropvolgende experimenten.
De antibacteriële activiteit van het diamine L-ornithine (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Duitsland) bij verschillende concentraties (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) tegen S. sclerotiorum-isolaat 3 werd in vitro onderzocht. Het is opmerkelijk dat L-ornithine een antibacterieel effect uitoefende en de radiale groei van S. sclerotiorum-hyfen geleidelijk remde op een dosisafhankelijke manier (Figuur 2A, B). Bij de hoogste geteste concentratie (125 mg/L) vertoonde L-ornithine de hoogste remming van de myceliumgroei (99,62 ± 0,27%; Figuur 2B), wat vergelijkbaar was met het commerciële fungicide Rizolex-T (remmingspercentage 99,45 ± 0,39%; Figuur 2C) bij de hoogste geteste concentratie (10 mg/L), wat wijst op een vergelijkbare werkzaamheid.
Figuur 2. In vitro antibacteriële activiteit van L-ornithine tegen Sclerotinia sclerotiorum. (A) Vergelijking van de antibacteriële activiteit van verschillende concentraties L-ornithine tegen S. sclerotiorum met het commerciële fungicide Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Remmingspercentage (%) van de myceliumgroei van S. sclerotiorum na behandeling met verschillende concentraties L-ornithine (12,5, 25, 50, 75, 100 en 125 mg/L) of Rizolex-T (2, 4, 6, 8 en 10 mg/L), respectievelijk. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van vijf biologische replicaten (n = 5). Verschillende letters duiden op statistisch significante verschillen tussen de behandelingen (p < 0,05). (D, E) Probit-modelregressieanalyse van respectievelijk L-ornithine en het commerciële fungicide Rizolex-T. De regressielijn van het probitmodel wordt weergegeven als een ononderbroken blauwe lijn en het betrouwbaarheidsinterval (95%) als een gestippelde rode lijn.
Daarnaast werd een probit-regressieanalyse uitgevoerd en de bijbehorende grafieken zijn weergegeven in Tabel 1 en Figuren 2D en 2E. Kort samengevat duiden de acceptabele hellingswaarde (y = 2,92x − 4,67) en de bijbehorende significante statistieken (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 en p < 0,0001; Figuur 2D) van L-ornithine op een verbeterde schimmelwerende activiteit tegen S. sclerotiorum in vergelijking met het commerciële fungicide Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 en p < 0,0001) (Tabel 1).
Tabel 1. Waarden van de halfmaximale remmende concentratie (IC50) en IC99 (mg/l) van L-ornithine en het commerciële fungicide “Rizolex-T” tegen S. sclerotiorum.
Over het geheel genomen verminderde L-ornithine (250 mg/L) de ontwikkeling en ernst van witte schimmel op behandelde gewone bonenplanten aanzienlijk in vergelijking met onbehandelde, met S. sclerotiorum geïnfecteerde planten (controle; Figuur 3A). Kort gezegd, hoewel de ziekte-ernst van onbehandelde geïnfecteerde controleplanten geleidelijk toenam (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 en 92,33 ± 3,06%), verminderde L-ornithine de ziekte-ernst (%) gedurende het hele experiment significant (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 en 26,36 ± 3,07) op respectievelijk 7, 14 en 21 dagen na de behandeling (dpt) (Figuur 3A). Op dezelfde manier daalde het oppervlak onder de ziekteprogressiecurve (AUDPC) bij behandeling van met S. sclerotiorum geïnfecteerde bonenplanten met 250 mg/L L-ornithine van 1274,33 ± 33,13 in de onbehandelde controlegroep naar 281,03 ± 7,95. Dit was iets lager dan dat van de positieve controle met 50 mg/L Rizolex-T fungicide (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). Dezelfde trend werd waargenomen in het tweede experiment.
Figuur 3. Effect van exogene toepassing van L-ornithine op de ontwikkeling van witrot bij gewone bonen, veroorzaakt door Sclerotinia sclerotiorum onder kasomstandigheden. (A) Ziekteverloopcurve van witrot bij gewone bonen na behandeling met 250 mg/L L-ornithine. (B) Oppervlakte onder de ziekteverloopcurve (AUDPC) van witrot bij gewone bonen na behandeling met L-ornithine. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± SD van vijf biologische replicaten (n = 5). Verschillende letters duiden op statistisch significante verschillen tussen de behandelingen (p < 0,05).
Exogene toediening van 250 mg/L L-ornithine leidde na 42 dagen tot een geleidelijke toename van de planthoogte (Fig. 4A), het aantal takken per plant (Fig. 4B) en het aantal bladeren per plant (Fig. 4C). Hoewel het commerciële fungicide Rizolex-T (50 mg/L) het grootste effect had op alle onderzochte voedingsparameters, had exogene toediening van 250 mg/L L-ornithine het op één na grootste effect in vergelijking met onbehandelde controles (Figs. 4A–C). Aan de andere kant had de behandeling met L-ornithine geen significant effect op het gehalte aan fotosynthetische pigmenten chlorofyl a (Fig. 4D) en chlorofyl b (Fig. 4E), maar verhoogde het het totale carotenoïdegehalte licht (0,56 ± 0,03 mg/g versgewicht) in vergelijking met de negatieve controle (0,44 ± 0,02 mg/g versgewicht) en de positieve controle (0,46 ± 0,02 mg/g versgewicht; Fig. 4F). Over het geheel genomen wijzen deze resultaten erop dat L-ornithine niet fytotoxisch is voor behandelde peulvruchten en mogelijk zelfs hun groei stimuleert.
Figuur 4. Effect van exogene L-ornithine-toepassing op de groeikenmerken en fotosynthetische pigmenten van bonenbladeren geïnfecteerd met Sclerotinia sclerotiorum onder kasomstandigheden. (A) Planthoogte (cm), (B) Aantal takken per plant, (C) Aantal bladeren per plant, (D) Chlorofyl a-gehalte (mg g-1 versgewicht), (E) Chlorofyl b-gehalte (mg g-1 versgewicht), (F) Totaal carotenoïdegehalte (mg g-1 versgewicht). De waarden zijn het gemiddelde ± SD van vijf biologische replicaten (n = 5). Verschillende letters geven statistisch significante verschillen tussen behandelingen aan (p < 0,05).
In situ histochemische lokalisatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS; uitgedrukt als waterstofperoxide [H2O2]) en vrije radicalen (uitgedrukt als superoxide-anionen [O2•−]) toonde aan dat exogene toepassing van L-ornithine (250 mg/L) de accumulatie van H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) en O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) significant verminderde in vergelijking met de accumulatie van zowel onbehandelde geïnfecteerde planten (173,31 ± 12,06 en 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW, respectievelijk) als planten behandeld met 50 mg/L van het commerciële fungicide Rizolex-T (170,12 ± 9,50 en 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 versgewicht, respectievelijk) na 72 uur. Hoge niveaus van H2O2 en O2•− accumuleerden onder hpt (Fig. 5A, B). Op vergelijkbare wijze toonde de TCA-gebaseerde malondialdehyde (MDA)-test aan dat met S. sclerotiorum geïnfecteerde bonenplanten hogere niveaus van MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g versgewicht) in hun bladeren accumuleerden (Fig. 5C). Exogene toepassing van L-ornithine verminderde echter de lipideperoxidatie significant, zoals blijkt uit de afname van het MDA-gehalte in behandelde planten (33,08 ± 4,00 nmol.g versgewicht).
Figuur 5. Effect van exogene L-ornithine-toepassing op belangrijke markers van oxidatieve stress en niet-enzymatische antioxidant-afweermechanismen in bonenbladeren geïnfecteerd met S. sclerotiorum 72 uur na infectie onder kasomstandigheden. (A) Waterstofperoxide (H2O2; nmol g−1 FW) na 72 uur, (B) superoxide-anion (O2•−; nmol g−1 FW) na 72 uur, (C) malondialdehyde (MDA; nmol g−1 FW) na 72 uur, (D) totale oplosbare fenolen (mg GAE g−1 FW) na 72 uur, (E) totale oplosbare flavonoïden (mg RE g−1 FW) na 72 uur, (F) totale vrije aminozuren (mg g−1 FW) na 72 uur en (G) prolinegehalte (mg g−1 FW) na 72 uur. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD) van 5 biologische replicaten (n = 5). Verschillende letters geven statistisch significante verschillen tussen behandelingen aan (p < 0,05).