Bedankt voor uw bezoek aan nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we u aan de nieuwste browserversie te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, zal deze site bovendien geen stijlen of JavaScript bevatten.
Stofstormen vormen een ernstige bedreiging voor veel landen wereldwijd vanwege hun verwoestende impact op de landbouw, de volksgezondheid, transportnetwerken en infrastructuur. Winderosie wordt daarom beschouwd als een wereldwijd probleem. Een van de milieuvriendelijke methoden om winderosie tegen te gaan, is het gebruik van microbiële geïnduceerde carbonaatprecipitatie (MICP). De bijproducten van op ureum gebaseerde MICP, zoals ammoniak, zijn echter niet ideaal wanneer ze in grote hoeveelheden worden geproduceerd. Deze studie presenteert twee formuleringen van calciumformiaatbacteriën voor de afbraak van MICP zonder ureum te produceren en vergelijkt hun prestaties uitgebreid met twee formuleringen van niet-ammoniakproducerende calciumacetaatbacteriën. De onderzochte bacteriën zijn Bacillus subtilis en Bacillus amyloliquefaciens. Eerst werden de geoptimaliseerde waarden van de factoren die de CaCO3-vorming beïnvloeden, bepaald. Vervolgens werden windtunneltests uitgevoerd op zandduinmonsters die behandeld waren met de geoptimaliseerde formuleringen, waarbij de winderosieweerstand, de afschilferingsdrempelsnelheid en de weerstand tegen zandbombardementen werden gemeten. Calciumcarbonaat (CaCO3)-allomorfen werden geëvalueerd met behulp van optische microscopie, scanningelektronenmicroscopie (SEM) en röntgendiffractieanalyse. Formules op basis van calciumformiaat presteerden significant beter dan formules op basis van acetaat wat betreft de vorming van calciumcarbonaat. Bovendien produceerde B. subtilis meer calciumcarbonaat dan B. amyloliquefaciens. SEM-microfoto's toonden duidelijk de binding en afzetting van actieve en inactieve bacteriën op calciumcarbonaat als gevolg van sedimentatie. Alle formules verminderden winderosie aanzienlijk.
Winderosie wordt al lange tijd erkend als een groot probleem voor droge en semi-aride gebieden zoals het zuidwesten van de Verenigde Staten, westelijk China, de Sahara en een groot deel van het Midden-Oosten¹. De lage neerslag in droge en extreem droge klimaten heeft grote delen van deze regio's omgevormd tot woestijnen, zandduinen en onontgonnen land. Voortdurende winderosie vormt een bedreiging voor de infrastructuur, zoals transportnetwerken, landbouwgrond en industrieterreinen, wat leidt tot slechte leefomstandigheden en hoge kosten voor stedelijke ontwikkeling in deze regio's²,³,⁴. Belangrijk is dat winderosie niet alleen de locatie zelf treft, maar ook gezondheids- en economische problemen veroorzaakt in afgelegen gemeenschappen doordat de deeltjes door de wind worden verspreid naar gebieden ver van de bron⁵,⁶.
Winderosiebestrijding blijft een wereldwijd probleem. Diverse methoden voor bodemstabilisatie worden gebruikt om winderosie tegen te gaan. Deze methoden omvatten materialen zoals wateraanbrenging7, oliemulch8, biopolymeren5, microbiële geïnduceerde carbonaatprecipitatie (MICP)9,10,11,12 en enzymgeïnduceerde carbonaatprecipitatie (EICP)1. Bodembevochtiging is een standaardmethode voor stofbestrijding in het veld. De snelle verdamping maakt deze methode echter beperkt effectief in droge en semi-aride gebieden1. Het aanbrengen van oliemulch verhoogt de cohesie van het zand en de wrijving tussen de deeltjes. Hun cohesieve eigenschap bindt zandkorrels aan elkaar; oliemulch brengt echter ook andere problemen met zich mee; hun donkere kleur verhoogt de warmteabsorptie en leidt tot de dood van planten en micro-organismen. Hun geur en dampen kunnen ademhalingsproblemen veroorzaken, en vooral hun hoge kosten vormen een ander obstakel. Biopolymeren zijn een van de recent voorgestelde milieuvriendelijke methoden om winderosie te verminderen; ze worden gewonnen uit natuurlijke bronnen zoals planten, dieren en bacteriën. Xanthaangom, guargom, chitosan en gellangom zijn de meest gebruikte biopolymeren in technische toepassingen5. Wateroplosbare biopolymeren kunnen echter hun sterkte verliezen en uit de bodem spoelen wanneer ze aan water worden blootgesteld13,14. EICP is een effectieve methode gebleken voor stofbestrijding in diverse toepassingen, waaronder onverharde wegen, afvalvijvers en bouwplaatsen. Hoewel de resultaten veelbelovend zijn, moet rekening worden gehouden met enkele potentiële nadelen, zoals de kosten en het gebrek aan nucleatiepunten (die de vorming en precipitatie van CaCO3-kristallen versnellen15,16).
MICP werd voor het eerst beschreven aan het einde van de 19e eeuw door Murray en Irwin (1890) en Steinmann (1901) in hun onderzoek naar de afbraak van ureum door mariene micro-organismen17. MICP is een natuurlijk voorkomend biologisch proces waarbij diverse microbiële activiteiten en chemische processen betrokken zijn, en waarbij calciumcarbonaat neerslaat door de reactie van carbonaationen uit microbiële metabolieten met calciumionen in de omgeving18,19. MICP waarbij de ureumafbrekende stikstofcyclus betrokken is (ureumafbrekende MICP) is het meest voorkomende type microbiële geïnduceerde carbonaatprecipitatie, waarbij urease, geproduceerd door bacteriën, de hydrolyse van ureum katalyseert20,21,22,23,24,25,26,27 als volgt:
Bij MICP, waarbij de koolstofcyclus van de oxidatie van organische zouten betrokken is (MICP zonder ureumafbraak), gebruiken heterotrofe bacteriën organische zouten zoals acetaat, lactaat, citraat, succinaat, oxalaat, malaat en glyoxylaat als energiebronnen om carbonaatmineralen te produceren28. In aanwezigheid van calciumlactaat als koolstofbron en calciumionen wordt de chemische reactie van calciumcarbonaatvorming weergegeven in vergelijking (5).
Bij het MICP-proces leveren bacteriële cellen nucleatiepunten die bijzonder belangrijk zijn voor de precipitatie van calciumcarbonaat; het oppervlak van de bacteriële cel is negatief geladen en kan fungeren als adsorptiemiddel voor tweewaardige kationen zoals calciumionen. Door calciumionen aan bacteriële cellen te adsorberen, reageren calciumkationen en carbonaatanionen met elkaar wanneer de carbonaatconcentratie voldoende is, waardoor calciumcarbonaat neerslaat op het bacteriële oppervlak29,30. Het proces kan als volgt worden samengevat31,32:
Biogegenereerde calciumcarbonaatkristallen kunnen worden onderverdeeld in drie typen: calciet, vateriet en aragoniet. Van deze drie zijn calciet en vateriet de meest voorkomende door bacteriën geïnduceerde allomorfen van calciumcarbonaat33,34. Calciet is de thermodynamisch meest stabiele allomorf van calciumcarbonaat35. Hoewel vateriet naar verluidt metastabiel is, transformeert het uiteindelijk in calciet36,37. Vateriet is het dichtste van deze kristallen. Het is een hexagonaal kristal dat, vanwege zijn grotere afmetingen, een beter vermogen heeft om poriën te vullen dan andere calciumcarbonaatkristallen38. Zowel door ureum afgebroken als niet door ureum afgebroken MICP kan leiden tot de precipitatie van vateriet13,39,40,41.
Hoewel MICP veelbelovende mogelijkheden heeft getoond bij het stabiliseren van problematische bodems en bodems die gevoelig zijn voor winderosie42,43,44,45,46,47,48, is een van de bijproducten van ureumhydrolyse ammoniak, dat afhankelijk van de blootstelling milde tot ernstige gezondheidsproblemen kan veroorzaken49. Deze bijwerking maakt het gebruik van deze specifieke technologie controversieel, vooral wanneer grote gebieden behandeld moeten worden, zoals bij stofbestrijding. Bovendien is de geur van ammoniak ondraaglijk wanneer het proces met hoge toepassingssnelheden en grote volumes wordt uitgevoerd, wat de praktische toepasbaarheid ervan kan beïnvloeden. Hoewel recente studies hebben aangetoond dat ammoniumionen kunnen worden gereduceerd door ze om te zetten in andere producten zoals struviet, verwijderen deze methoden ammoniumionen niet volledig50. Daarom is er nog steeds behoefte aan het onderzoeken van alternatieve oplossingen die geen ammoniumionen genereren. Het gebruik van niet-ureumafbraakroutes voor MICP zou een potentiële oplossing kunnen bieden die nog weinig is onderzocht in de context van de bestrijding van winderosie. Fattahi et al. Er is onderzoek gedaan naar ureumvrije MICP-afbraak met behulp van calciumacetaat en Bacillus megaterium41, terwijl Mohebbi et al. calciumacetaat en Bacillus amyloliquefaciens9 gebruikten. Hun onderzoek werd echter niet vergeleken met andere calciumbronnen en heterotrofe bacteriën die uiteindelijk de winderosiebestendigheid zouden kunnen verbeteren. Er is ook een gebrek aan literatuur waarin ureumvrije afbraakroutes worden vergeleken met ureumafbraakroutes bij de bestrijding van winderosie.
Daarnaast zijn de meeste onderzoeken naar winderosie en stofbeheersing uitgevoerd op bodemmonsters met een vlak oppervlak.^1,51,52,53 Vlakke oppervlakken komen echter minder vaak voor in de natuur dan heuvels en depressies. Daarom zijn zandduinen het meest voorkomende landschapselement in woestijngebieden.
Om de bovengenoemde tekortkomingen te ondervangen, had deze studie tot doel een nieuwe reeks niet-ammoniakproducerende bacteriële agentia te introduceren. Hiervoor hebben we MICP-routes (microbiële carbonaatprecipitatie) overwogen die geen ureum afbreken. De efficiëntie van twee calciumbronnen (calciumformiaat en calciumacetaat) werd onderzocht. Voor zover de auteurs weten, is carbonaatprecipitatie met behulp van twee combinaties van calciumbronnen en bacteriën (namelijk calciumformiaat-Bacillus subtilis en calciumformiaat-Bacillus amyloliquefaciens) nog niet eerder onderzocht. De keuze voor deze bacteriën was gebaseerd op de enzymen die ze produceren en die de oxidatie van calciumformiaat en calciumacetaat katalyseren, wat leidt tot microbiële carbonaatprecipitatie. We hebben een grondige experimentele studie opgezet om de optimale factoren te bepalen, zoals pH, soorten bacteriën en calciumbronnen en hun concentraties, de verhouding tussen bacteriën en calciumbronoplossing en de uithardingstijd. Ten slotte werd de effectiviteit van deze set bacteriële agenten bij het onderdrukken van winderosie door calciumcarbonaatprecipitatie onderzocht door een reeks windtunnelproeven uit te voeren op zandduinen. Hierbij werden de omvang van de winderosie, de drempelsnelheid voor losbreken en de windbestendigheid van het zand bepaald. Daarnaast werden penetrometermetingen en microstructuuronderzoeken (bijv. röntgendiffractieanalyse (XRD) en scanningelektronenmicroscopie (SEM)) uitgevoerd.
Voor de productie van calciumcarbonaat zijn calciumionen en carbonaationen nodig. Calciumionen kunnen worden verkregen uit verschillende calciumbronnen, zoals calciumchloride, calciumhydroxide en magere melkpoeder54,55. Carbonaationen kunnen worden geproduceerd via verschillende microbiële methoden, zoals ureumhydrolyse en aerobe of anaerobe oxidatie van organisch materiaal56. In deze studie werden carbonaationen verkregen uit de oxidatiereactie van formiaat en acetaat. Daarnaast gebruikten we calciumzouten van formiaat en acetaat om zuiver calciumcarbonaat te produceren, waardoor alleen CO2 en H2O als bijproducten werden verkregen. In dit proces dient slechts één stof als calciumbron én als carbonaatbron, en wordt er geen ammoniak geproduceerd. Deze kenmerken maken de door ons onderzochte methode voor de productie van calcium en carbonaat zeer veelbelovend.
De overeenkomstige reacties van calciumformiaat en calciumacetaat tot calciumcarbonaat worden weergegeven in formules (7)-(14). Formules (7)-(11) laten zien dat calciumformiaat oplost in water en daarbij mierenzuur of formiaat vormt. De oplossing is dus een bron van vrije calcium- en hydroxide-ionen (formules 8 en 9). Als gevolg van de oxidatie van mierenzuur worden de koolstofatomen in mierenzuur omgezet in koolstofdioxide (formule 10). Uiteindelijk wordt calciumcarbonaat gevormd (formules 11 en 12).
Op dezelfde manier wordt calciumcarbonaat gevormd uit calciumacetaat (vergelijkingen 13-15), met dien verstande dat in plaats van mierenzuur azijnzuur of acetaat wordt gevormd.
Zonder de aanwezigheid van enzymen kunnen acetaat en formiaat bij kamertemperatuur niet worden geoxideerd. FDH (formiaatdehydrogenase) en CoA (co-enzym A) katalyseren de oxidatie van formiaat en acetaat tot respectievelijk koolstofdioxide (vergelijkingen 16, 17) 57, 58, 59. Verschillende bacteriën zijn in staat deze enzymen te produceren, en heterotrofe bacteriën, namelijk Bacillus subtilis (PTCC #1204 (Persian Type Culture Collection), ook bekend als NCIMB #13061 (International Collection of Bacteria, Yeast, Phage, Plasmids, Plant Seeds and Plant Cell Tissue Cultures)) en Bacillus amyloliquefaciens (PTCC #1732, NCIMB #12077), werden in dit onderzoek gebruikt. Deze bacteriën werden gekweekt in een medium dat vleespepton (5 g/L) en vleesextract (3 g/L) bevatte, genaamd voedingsbouillon (NBR) (105443 Merck).
Er werden dus vier formuleringen bereid om de neerslag van calciumcarbonaat te induceren met behulp van twee calciumbronnen en twee bacteriën: calciumformiaat en Bacillus subtilis (FS), calciumformiaat en Bacillus amyloliquefaciens (FA), calciumacetaat en Bacillus subtilis (AS), en calciumacetaat en Bacillus amyloliquefaciens (AA).
In het eerste deel van het experimentele ontwerp werden tests uitgevoerd om de optimale combinatie te bepalen die een maximale calciumcarbonaatproductie zou opleveren. Omdat de bodemmonsters calciumcarbonaat bevatten, werd een reeks voorlopige evaluatietests ontworpen om de door de verschillende combinaties geproduceerde CaCO3 nauwkeurig te meten. Mengsels van kweekmedium en calciumbronoplossingen werden geëvalueerd. Voor elke combinatie van calciumbron en bacterieoplossing zoals hierboven gedefinieerd (FS, FA, AS en AA) werden optimalisatiefactoren (concentratie calciumbron, uithardingstijd, concentratie bacterieoplossing gemeten aan de hand van de optische dichtheid van de oplossing (OD), verhouding calciumbron/bacterieoplossing en pH) afgeleid en gebruikt in de windtunneltests met zandduinbehandeling die in de volgende paragrafen worden beschreven.
Voor elke combinatie werden 150 experimenten uitgevoerd om het effect van CaCO3-precipitatie te bestuderen en verschillende factoren te evalueren, namelijk de concentratie van de calciumbron, de uithardingstijd, de bacteriële OD-waarde, de verhouding tussen calciumbron en bacteriële oplossing en de pH tijdens de aerobe oxidatie van organisch materiaal (Tabel 1). Het pH-bereik voor het geoptimaliseerde proces werd geselecteerd op basis van de groeicurven van Bacillus subtilis en Bacillus amyloliquefaciens om een ​​snellere groei te verkrijgen. Dit wordt nader toegelicht in de sectie Resultaten.
De volgende stappen werden gebruikt om de monsters voor de optimalisatiefase voor te bereiden. De MICP-oplossing werd eerst bereid door de initiële pH van het kweekmedium aan te passen en vervolgens gedurende 15 minuten bij 121 °C te autoclaveren. De bacteriestam werd vervolgens geënt in een laminaire luchtstroomkast en in een schudincubator gehouden bij 30 °C en 180 rpm. Zodra de OD van de bacteriën het gewenste niveau had bereikt, werd deze gemengd met de calciumbronoplossing in de gewenste verhouding (Figuur 1a). De MICP-oplossing werd vervolgens in een schudincubator bij 220 rpm en 30 °C gedurende een bepaalde tijd laten reageren en stollen totdat de streefwaarde was bereikt. Het neergeslagen CaCO3 werd na centrifugatie bij 6000 g gedurende 5 minuten afgescheiden en vervolgens gedroogd bij 40 °C om de monsters voor de calcimetertest voor te bereiden (Figuur 1b). De neerslag van CaCO3 werd vervolgens gemeten met een Bernard-calcimeter, waarbij CaCO3-poeder reageert met 1,0 N HCl (ASTM-D4373-02) om CO2 te produceren. Het volume van dit gas is een maat voor het CaCO3-gehalte (Figuur 1c). Om het volume CO2 om te rekenen naar CaCO3-gehalte, werd een kalibratiecurve gegenereerd door zuiver CaCO3-poeder te wassen met 1 N HCl en dit uit te zetten tegen de vrijgekomen CO2. De morfologie en zuiverheid van het neergeslagen CaCO3-poeder werden onderzocht met behulp van SEM-beeldvorming en XRD-analyse. Een optische microscoop met een vergroting van 1000x werd gebruikt om de vorming van calciumcarbonaat rond de bacteriën, de fase van het gevormde calciumcarbonaat en de activiteit van de bacteriën te bestuderen.
Het Dejegh-bekken is een bekend, sterk geërodeerd gebied in het zuidwesten van de Iraanse provincie Fars. Onderzoekers verzamelden in dit gebied door de wind geërodeerde bodemmonsters. De monsters werden voor het onderzoek van het bodemoppervlak genomen. Indicatortests op de bodemmonsters toonden aan dat de bodem een ​​slecht gesorteerde zandgrond met slib was en werd geclassificeerd als SP-SM volgens het Unified Soil Classification System (USC) (Figuur 2a). XRD-analyse toonde aan dat de Dejegh-bodem voornamelijk bestond uit calciet en kwarts (Figuur 2b). Daarnaast liet EDX-analyse zien dat ook andere elementen zoals Al, K en Fe in kleinere hoeveelheden aanwezig waren.
Om de duinen in het laboratorium voor te bereiden op winderosietesten, werd de grond vanaf een hoogte van 170 mm door een trechter met een diameter van 10 mm fijngemalen tot een stevig oppervlak. Dit resulteerde in een typische duin met een hoogte van 60 mm en een diameter van 210 mm. In de natuur worden zandduinen met de laagste dichtheid gevormd door winderosie. Op dezelfde manier had het monster dat met de bovenstaande procedure was voorbereid de laagste relatieve dichtheid, γ = 14,14 kN/m³, en vormde het een zandkegel die op een horizontaal oppervlak was afgezet met een hellingshoek van ongeveer 29,7°.
De optimale MICP-oplossing die in de vorige sectie was verkregen, werd op de duinhelling gespoten met toepassingshoeveelheden van 1, 2 en 3 lm-2. Vervolgens werden de monsters 9 dagen (de optimale uithardingstijd) in een incubator bij 30 °C bewaard (fig. 3) en daarna uit de incubator gehaald voor windtunneltests.
Voor elke behandeling werden vier monsters voorbereid: één voor het meten van het calciumcarbonaatgehalte en de oppervlaktesterkte met behulp van een penetrometer, en de overige drie monsters werden gebruikt voor erosietests bij drie verschillende windsnelheden. In de windtunneltests werd de hoeveelheid erosie bepaald bij verschillende windsnelheden, waarna de drempelsnelheid voor het loskomen van het materiaal voor elk behandeld monster werd bepaald aan de hand van een grafiek van de erosiehoeveelheid versus de windsnelheid. Naast de winderosietests werden de behandelde monsters ook onderworpen aan zandbombardementen (d.w.z. springexperimenten). Hiervoor werden twee extra monsters voorbereid met toepassingssnelheden van 2 en 3 L m−2. De zandbombardementstest duurde 15 minuten met een flux van 120 g m−1, wat binnen het bereik ligt van de waarden die in eerdere studies zijn geselecteerd60,61,62. De horizontale afstand tussen de abrasieve sproeier en de duinbasis was 800 mm, 100 mm boven de tunnelbodem. Deze positie werd zo gekozen dat bijna alle springende zanddeeltjes op de duin terechtkwamen.
De windtunneltest werd uitgevoerd in een open windtunnel met een lengte van 8 m, een breedte van 0,4 m en een hoogte van 1 m (Figuur 4a). De windtunnel is gemaakt van gegalvaniseerde staalplaten en kan een windsnelheid tot 25 m/s genereren. Daarnaast wordt een frequentieomvormer gebruikt om de ventilatorfrequentie aan te passen en deze geleidelijk te verhogen tot de gewenste windsnelheid. Figuur 4b toont het schematische diagram van de door wind geërodeerde zandduinen en het in de windtunnel gemeten windsnelheidsprofiel.
Om de resultaten van de in deze studie voorgestelde niet-urealytische MICP-formulering te vergelijken met de resultaten van de urealytische MICP-controletest, werden ten slotte ook duinmonsters voorbereid en behandeld met een biologische oplossing die ureum, calciumchloride en Sporosarcina pasteurii bevatte (aangezien Sporosarcina pasteurii een significant vermogen heeft om urease te produceren63). De optische dichtheid van de bacteriële oplossing was 1,5 en de concentraties van ureum en calciumchloride waren 1 M (gekozen op basis van de waarden die in eerdere studies werden aanbevolen36,64,65). Het kweekmedium bestond uit voedingsbouillon (8 g/L) en ureum (20 g/L). De bacteriële oplossing werd op het duinoppervlak gespoten en 24 uur laten inwerken voor hechting van de bacteriën. Na 24 uur hechting werd een cementerende oplossing (calciumchloride en ureum) gespoten. De urealytische MICP-controletest wordt hierna aangeduid als UMC. Het calciumcarbonaatgehalte van met urealytica en niet met urealytica behandelde bodemmonsters werd bepaald door te wassen volgens de procedure voorgesteld door Choi et al.66
Figuur 5 toont de groeilijnen van Bacillus amyloliquefaciens en Bacillus subtilis in het kweekmedium (voedingsoplossing) met een initiële pH-waarde tussen 5 en 10. Zoals in de figuur te zien is, groeiden Bacillus amyloliquefaciens en Bacillus subtilis respectievelijk sneller bij een pH van 6-8 en 7-9. Daarom werd dit pH-bereik gebruikt in de optimalisatiefase.
Groeicurven van (a) Bacillus amyloliquefaciens en (b) Bacillus subtilis bij verschillende initiële pH-waarden van het voedingsmedium.
Figuur 6 toont de hoeveelheid koolstofdioxide die in de Bernard-kalkmeter wordt geproduceerd, wat neergeslagen calciumcarbonaat (CaCO3) vertegenwoordigt. Omdat in elke combinatie één factor vast was en de andere factoren werden gevarieerd, komt elk punt op deze grafieken overeen met het maximale volume koolstofdioxide in die reeks experimenten. Zoals in de figuur te zien is, nam de productie van calciumcarbonaat toe naarmate de concentratie van de calciumbron toenam. De concentratie van de calciumbron heeft dus een directe invloed op de productie van calciumcarbonaat. Omdat de calciumbron en de koolstofbron hetzelfde zijn (d.w.z. calciumformiaat en calciumacetaat), geldt: hoe meer calciumionen vrijkomen, hoe meer calciumcarbonaat er wordt gevormd (Figuur 6a). In de AS- en AA-formuleringen bleef de calciumcarbonaatproductie toenemen met toenemende uithardingstijd totdat de hoeveelheid neerslag na 9 dagen vrijwel onveranderd bleef. In de FA-formulering nam de snelheid van calciumcarbonaatvorming af wanneer de uithardingstijd langer dan 6 dagen was. Vergeleken met andere formuleringen vertoonde formulering FS een relatief lage calciumcarbonaatvormingssnelheid na 3 dagen (Figuur 6b). In de formuleringen FA en FS werd na drie dagen respectievelijk 70% en 87% van de totale calciumcarbonaatproductie bereikt, terwijl dit in de formuleringen AA en AS slechts ongeveer 46% en 45% bedroeg. Dit wijst erop dat de formulering op basis van mierenzuur in de beginfase een hogere CaCO3-vormingssnelheid heeft dan de formulering op basis van acetaat. De vormingssnelheid neemt echter af naarmate de uithardingstijd toeneemt. Uit figuur 6c kan worden geconcludeerd dat zelfs bij bacteriële concentraties boven OD1 er geen significante bijdrage is aan de calciumcarbonaatvorming.
Verandering in CO2-volume (en overeenkomstige CaCO3-inhoud) gemeten met de Bernard-calcimeter als functie van (a) calciumbronconcentratie, (b) uithardingstijd, (c) OD, (d) initiële pH, (e) verhouding van calciumbron tot bacteriële oplossing (voor elke formulering); en (f) maximale hoeveelheid geproduceerd calciumcarbonaat voor elke combinatie van calciumbron en bacteriën.
Wat betreft het effect van de initiële pH van het medium, toont figuur 6d aan dat voor FA en FS de CaCO3-productie een maximum bereikte bij pH 7. Deze waarneming komt overeen met eerdere studies waaruit blijkt dat FDH-enzymen het meest stabiel zijn bij pH 7-6,7. Voor AA en AS nam de CaCO3-precipitatie echter toe wanneer de pH hoger was dan 7. Eerdere studies toonden ook aan dat het optimale pH-bereik voor CoA-enzymactiviteit tussen 8 en 9,2-6,8 ligt. Aangezien de optimale pH-bereiken voor CoA-enzymactiviteit en de groei van B. amyloliquefaciens respectievelijk (8-9,2) en (6-8) zijn (figuur 5a), wordt verwacht dat de optimale pH voor de AA-formulering 8 is, en de twee pH-bereiken overlappen elkaar. Dit werd bevestigd door experimenten, zoals weergegeven in figuur 6d. Aangezien de optimale pH voor de groei van B. subtilis 7-9 is (Figuur 5b) en de optimale pH voor de activiteit van het CoA-enzym 8-9,2 is, wordt verwacht dat de maximale CaCO3-precipitatieopbrengst zich in het pH-bereik van 8-9 bevindt, wat wordt bevestigd door Figuur 6d (d.w.z. de optimale precipitatie-pH is 9). De resultaten in Figuur 6e geven aan dat de optimale verhouding tussen calciumbronoplossing en bacteriële oplossing 1 is voor zowel acetaat- als formiaatoplossingen. Ter vergelijking werd de prestatie van verschillende formuleringen (d.w.z. AA, AS, FA en FS) geëvalueerd op basis van de maximale CaCO3-productie onder verschillende omstandigheden (d.w.z. calciumbronconcentratie, uithardingstijd, OD, verhouding calciumbron/bacteriële oplossing en initiële pH). Van de onderzochte formuleringen had formulering FS de hoogste CaCO3-productie, die ongeveer drie keer zo hoog was als die van formulering AA (Figuur 6f). Vier bacterievrije controle-experimenten werden uitgevoerd voor beide calciumbronnen en er werd na 30 dagen geen CaCO3-precipitatie waargenomen.
De optische microscopiebeelden van alle formuleringen toonden aan dat vateriet de belangrijkste fase was waarin calciumcarbonaat werd gevormd (Figuur 7). De vaterietkristallen waren bolvormig69,70,71. Er werd vastgesteld dat calciumcarbonaat neersloeg op de bacteriële cellen omdat het oppervlak van de bacteriële cellen negatief geladen was en kon fungeren als adsorbent voor tweewaardige kationen. In dit onderzoek werd formulering FS als voorbeeld genomen: na 24 uur begon calciumcarbonaat zich te vormen op sommige bacteriële cellen (Figuur 7a), en na 48 uur nam het aantal met calciumcarbonaat bedekte bacteriële cellen significant toe. Bovendien konden, zoals weergegeven in Figuur 7b, ook vaterietdeeltjes worden gedetecteerd. Ten slotte leek na 72 uur een groot aantal bacteriën gebonden te zijn aan de vaterietkristallen, en nam het aantal vaterietdeeltjes significant toe (Figuur 7c).
Optische microscopische waarnemingen van CaCO3-precipitatie in FS-samenstellingen in de loop van de tijd: (a) 24, (b) 48 en (c) 72 uur.
Om de morfologie van de geprecipiteerde fase verder te onderzoeken, werden röntgendiffractie (XRD) en SEM-analyses van de poeders uitgevoerd. De XRD-spectra (Fig. 8a) en SEM-microfoto's (Fig. 8b, c) bevestigden de aanwezigheid van vaterietkristallen, aangezien deze een sla-achtige vorm hadden en er een overeenkomst werd waargenomen tussen de vaterietpieken en de pieken van de precipitaten.
(a) Vergelijking van röntgendiffractiespectra van gevormd CaCO3 en vateriet. SEM-microfoto's van vateriet bij respectievelijk (b) 1 kHz en (c) 5,27 kHz vergroting.
De resultaten van de windtunnelproeven worden weergegeven in figuur 9a en 9b. Uit figuur 9a blijkt dat de drempel-erosiesnelheid (TDV) van het onbehandelde zand ongeveer 4,32 m/s bedraagt. Bij een toepassingssnelheid van 1 l/m² (figuur 9a) zijn de hellingen van de lijnen die de bodemerosiesnelheid weergeven voor de fracties FA, FS, AA en UMC nagenoeg gelijk aan die van de onbehandelde duin. Dit wijst erop dat de behandeling bij deze toepassingssnelheid niet effectief is en dat zodra de windsnelheid de TDV overschrijdt, de dunne bodemkorst verdwijnt en de erosiesnelheid van de duin gelijk is aan die van de onbehandelde duin. De erosiehelling van fractie AS is ook lager dan die van de andere fracties met een lagere abscis (d.w.z. TDV) (figuur 9a). De pijlen in figuur 9b geven aan dat bij een maximale windsnelheid van 25 m/s geen erosie optrad in de behandelde duinen bij toepassingssnelheden van 2 en 3 l/m². Met andere woorden, voor FS, FA, AS en UMC waren de duinen beter bestand tegen winderosie veroorzaakt door CaCO³-afzetting bij toepassingshoeveelheden van 2 en 3 l/m² dan bij de maximale windsnelheid (d.w.z. 25 m/s). De TDV-waarde van 25 m/s die in deze tests is verkregen, is dus de ondergrens voor de toepassingshoeveelheden die in figuur 9b worden weergegeven, behalve in het geval van AA, waar de TDV vrijwel gelijk is aan de maximale windsnelheid in de windtunnel.
Winderosietest (a) Gewichtsverlies versus windsnelheid (toepassingssnelheid 1 l/m2), (b) Drempelwaarde voor afscheursnelheid versus toepassingssnelheid en formulering (CA voor calciumacetaat, CF voor calciumformiaat).
Figuur 10 toont de oppervlakte-erosie van zandduinen behandeld met verschillende formuleringen en toepassingshoeveelheden na de zandbombardementstest. De kwantitatieve resultaten worden weergegeven in figuur 11. Het onbehandelde geval wordt niet getoond omdat het geen weerstand vertoonde en volledig geërodeerd was (totaal massaverlies) tijdens de zandbombardementstest. Uit figuur 11 blijkt duidelijk dat het monster behandeld met biocompositie AA 83,5% van zijn gewicht verloor bij een toepassingshoeveelheid van 2 l/m², terwijl alle andere monsters minder dan 30% erosie vertoonden tijdens het zandbombardement. Toen de toepassingshoeveelheid werd verhoogd tot 3 l/m², verloren alle behandelde monsters minder dan 25% van hun gewicht. Bij beide toepassingshoeveelheden vertoonde verbinding FS de beste weerstand tegen zandbombardement. De maximale en minimale bombardementsweerstand in de met FS en AA behandelde monsters kan worden toegeschreven aan hun maximale en minimale CaCO₃-precipitatie (figuur 6f).
Resultaten van het bombarderen van zandduinen met verschillende samenstellingen bij debieten van 2 en 3 l/m2 (pijlen geven de windrichting aan, kruisen geven de windrichting loodrecht op het vlak van de tekening aan).
Zoals weergegeven in figuur 12, nam het calciumcarbonaatgehalte van alle formules toe naarmate de toepassingssnelheid steeg van 1 L/m² tot 3 L/m². Bovendien had formule FS bij alle toepassingssnelheden het hoogste calciumcarbonaatgehalte, gevolgd door FA en UMC. Dit suggereert dat deze formules mogelijk een hogere oppervlaktebestendigheid hebben.
Figuur 13a toont de verandering in oppervlakteweerstand van onbehandelde, controle- en behandelde bodemmonsters, gemeten met een permeameter. Uit deze figuur blijkt dat de oppervlakteweerstand van de UMC-, AS-, FA- en FS-formuleringen significant toenam met een hogere toepassingssnelheid. De toename in oppervlaktesterkte was echter relatief klein bij de AA-formulering. Zoals in de figuur te zien is, hebben de FA- en FS-formuleringen van niet-ureum-afgebroken MICP een betere oppervlaktepermeabiliteit vergeleken met ureum-afgebroken MICP. Figuur 13b toont de verandering in TDV (Threshold Stripping Velocity) met de oppervlakteweerstand van de bodem. Uit deze figuur blijkt duidelijk dat voor duinen met een oppervlakteweerstand van meer dan 100 kPa de drempel-strippingsnelheid hoger zal zijn dan 25 m/s. Aangezien de oppervlakteweerstand ter plaatse eenvoudig kan worden gemeten met een permeameter, kan deze kennis helpen om de TDV te schatten in afwezigheid van windtunneltesten, en dient zo als kwaliteitscontrole-indicator voor veldtoepassingen.
De SEM-resultaten worden weergegeven in Figuur 14. Figuren 14a-b tonen de vergrote deeltjes van het onbehandelde bodemmonster, waaruit duidelijk blijkt dat het cohesief is en geen natuurlijke binding of cementering vertoont. Figuur 14c toont de SEM-microfoto van het controlemonster behandeld met ureum-afgebroken MICP. Deze afbeelding toont de aanwezigheid van CaCO3-precipitaten als calcietpolymorfen. Zoals weergegeven in Figuren 14d-o, bindt het geprecipiteerde CaCO3 de deeltjes aan elkaar; in de SEM-microfoto's zijn ook bolvormige vaterietkristallen te herkennen. De resultaten van dit onderzoek en eerdere onderzoeken tonen aan dat de CaCO3-bindingen die als vaterietpolymorfen worden gevormd, ook een redelijke mechanische sterkte kunnen bieden; onze resultaten laten zien dat de oppervlakteweerstand toeneemt tot 350 kPa en de drempelsnelheid voor scheiding toeneemt van 4,32 tot meer dan 25 m/s. Dit resultaat komt overeen met de resultaten van eerdere studies waaruit blijkt dat de matrix van MICP-geprecipiteerd CaCO3 vateriet is, dat een redelijke mechanische sterkte en winderosiebestendigheid heeft13,40 en een redelijke winderosiebestendigheid kan behouden, zelfs na 180 dagen blootstelling aan omgevingsomstandigheden in het veld13.
(a, b) SEM-microfoto's van onbehandelde grond, (c) MICP-ureumafbraakcontrole, (df) met AA behandelde monsters, (gi) met AS behandelde monsters, (jl) met FA behandelde monsters en (mo) met FS behandelde monsters bij een toepassingssnelheid van 3 L/m2 bij verschillende vergrotingen.
Figuur 14d-f laat zien dat na behandeling met AA-verbindingen calciumcarbonaat neersloeg op het oppervlak en tussen de zandkorrels, terwijl ook enkele onbedekte zandkorrels werden waargenomen. Bij AS-componenten nam de hoeveelheid gevormd CaCO3 weliswaar niet significant toe (fig. 6f), maar de hoeveelheid contacten tussen zandkorrels veroorzaakt door CaCO3 nam significant toe in vergelijking met AA-verbindingen (fig. 14g-i).
Uit figuren 14j-l en 14m-o blijkt duidelijk dat het gebruik van calciumformiaat als calciumbron leidt tot een verdere toename van de CaCO3-precipitatie in vergelijking met de AS-verbinding, wat overeenkomt met de calciummeter-metingen in figuur 6f. Deze extra CaCO3 lijkt voornamelijk op de zanddeeltjes te worden afgezet en verbetert niet per se de contactkwaliteit. Dit bevestigt het eerder waargenomen gedrag: ondanks de verschillen in de hoeveelheid CaCO3-precipitatie (figuur 6f), verschillen de drie formuleringen (AS, FA en FS) niet significant in termen van windbestendigheid (figuur 11) en oppervlakteweerstand (figuur 13a).
Om de met CaCO3 gecoate bacteriële cellen en de bacteriële afdruk op de geprecipiteerde kristallen beter te visualiseren, werden SEM-microfoto's met hoge vergroting gemaakt. De resultaten hiervan zijn weergegeven in Figuur 15. Zoals te zien is, precipiteert calciumcarbonaat op de bacteriële cellen en levert het de kernen die nodig zijn voor de precipitatie. De figuur toont ook de actieve en inactieve bindingen die door CaCO3 worden geïnduceerd. Hieruit kan worden geconcludeerd dat een toename van inactieve bindingen niet noodzakelijkerwijs leidt tot een verdere verbetering van het mechanische gedrag. Daarom leidt een toename van de CaCO3-precipitatie niet per se tot een hogere mechanische sterkte en speelt het precipitatiepatroon een belangrijke rol. Dit punt is ook onderzocht in de werken van Terzis en Laloui72 en Soghi en Al-Kabani45,73. Om de relatie tussen precipitatiepatroon en mechanische sterkte verder te onderzoeken, worden MICP-studies met behulp van µCT-beeldvorming aanbevolen, wat buiten het bestek van deze studie valt (d.w.z. het introduceren van verschillende combinaties van calciumbron en bacteriën voor ammoniakvrije MICP).
CaCO3 induceerde actieve en inactieve bindingen in monsters behandeld met (a) AS-samenstelling en (b) FS-samenstelling en liet een afdruk van bacteriële cellen achter op het sediment.
Zoals weergegeven in figuren 14j-o en 15b, is er een CaCO₃-film aanwezig (volgens EDX-analyse is de procentuele samenstelling van elk element in de film als volgt: 11% koolstof, 46,62% zuurstof en 42,39% calcium, wat zeer dicht in de buurt komt van het percentage CaCO₃ in figuur 16). Deze film bedekt de vaterietkristallen en bodemdeeltjes en draagt ​​bij aan het behoud van de integriteit van het bodem-sedimentsysteem. De aanwezigheid van deze film werd alleen waargenomen in de monsters die behandeld waren met de formulering op basis van formiaat.
Tabel 2 vergelijkt de oppervlaktesterkte, de drempelwaarde voor loslatingssnelheid en het bio-geïnduceerde CaCO3-gehalte van bodems die in eerdere studies en in deze studie zijn behandeld met ureum-afbrekende en niet-ureum-afbrekende MICP-processen. Studies naar de winderosiebestendigheid van met MICP behandelde duinmonsters zijn beperkt. Meng et al. onderzochten de winderosiebestendigheid van met MICP behandelde ureum-afbrekende duinmonsters met behulp van een bladblazer,¹³ terwijl in deze studie niet-ureum-afbrekende duinmonsters (evenals ureum-afbrekende controlemonsters) in een windtunnel werden getest en behandeld met vier verschillende combinaties van bacteriën en stoffen.
Zoals te zien is, hebben sommige eerdere studies hoge toepassingssnelheden van meer dan 4 L/m2 overwogen13,41,74. Het is belangrijk op te merken dat hoge toepassingssnelheden vanuit economisch oogpunt in de praktijk mogelijk niet gemakkelijk toepasbaar zijn vanwege de kosten die gepaard gaan met wateraanvoer, transport en het aanbrengen van grote hoeveelheden water. Lagere toepassingssnelheden, zoals 1,62-2 L/m2, leverden ook redelijk goede oppervlaktesterktes op tot 190 kPa en een TDV van meer dan 25 m/s. In de huidige studie bereikten duinen die behandeld waren met formiaat-gebaseerde MICP zonder ureumafbraak hoge oppervlaktesterktes die vergelijkbaar waren met die verkregen met de ureumafbraakroute in hetzelfde bereik van toepassingssnelheden (d.w.z. monsters behandeld met formiaat-gebaseerde MICP zonder ureumafbraak konden ook dezelfde waarden voor oppervlaktesterkte bereiken als gerapporteerd door Meng et al., 13, Figuur 13a) bij hogere toepassingssnelheden. Het is ook te zien dat bij een toepassingssnelheid van 2 L/m2 de opbrengst aan calciumcarbonaat voor de bestrijding van winderosie bij een windsnelheid van 25 m/s 2,25% bedroeg voor de op formiaat gebaseerde MICP zonder ureumafbraak. Dit ligt zeer dicht bij de benodigde hoeveelheid CaCO3 (namelijk 2,41%) in vergelijking met duinen die behandeld zijn met de controle-MICP met ureumafbraak bij dezelfde toepassingssnelheid en dezelfde windsnelheid (25 m/s).
Uit deze tabel kan dus worden geconcludeerd dat zowel de ureumafbraakroute als de ureumvrije afbraakroute acceptabele prestaties leveren wat betreft oppervlaktebestendigheid en TDV. Het belangrijkste verschil is dat de ureumvrije afbraakroute geen ammoniak bevat en daardoor een lagere milieubelasting heeft. Bovendien lijkt de in deze studie voorgestelde MICP-methode op basis van formiaat zonder ureumafbraak beter te presteren dan de MICP-methode op basis van acetaat zonder ureumafbraak. Hoewel Mohebbi et al. de MICP-methode op basis van acetaat zonder ureumafbraak hebben onderzocht, omvatte hun studie monsters op vlakke oppervlakken⁹. Vanwege de hogere mate van erosie veroorzaakt door wervelvorming rond de duinmonsters en de daaruit voortvloeiende schuifspanning, wat resulteert in een lagere TDV, wordt verwacht dat de winderosie van de duinmonsters bij dezelfde snelheid duidelijker zal zijn dan die van vlakke oppervlakken.