Verschillende theorieën over plantenafweer bieden belangrijke theoretische richtlijnen voor het verklaren van de patronen van gespecialiseerd plantenmetabolisme, maar hun belangrijkste voorspellingen moeten nog worden getest. Hier hebben we onbevooroordeelde tandemmassaspectrometrie (MS/MS)-analyse gebruikt om systematisch het metaboloom van verzwakte tabaksstammen te onderzoeken, van individuele planten tot populaties en nauw verwante soorten. We hebben een groot aantal massaspectrometrische kenmerktheorieën verwerkt op basis van de spectra van verbindingen in de informatie. Dit kader werd gebruikt om de belangrijkste voorspellingen van de optimale verdedigingstheorie (OD) en de bewegende-doeltheorie (MT) te testen. De informatiecomponent van plantenmetabolomics is consistent met de OD-theorie, maar spreekt de belangrijkste voorspelling van de MT-theorie over de metabolomicsdynamiek veroorzaakt door herbivoren tegen. Van de micro- tot de macro-evolutionaire schaal werd het jasmonaatsignaal geïdentificeerd als de belangrijkste bepalende factor voor OD, terwijl het ethyleensignaal zorgde voor de verfijning van de herbivoorspecifieke respons, zoals geannoteerd door het MS/MS-moleculaire netwerk.
Speciale metabolieten met uiteenlopende structuren spelen een belangrijke rol in de aanpassing van planten aan de omgeving, met name bij de verdediging tegen vijanden (1). De verbazingwekkende diversificatie van het speciale metabolisme in planten heeft decennialang diepgaand onderzoek naar de vele aspecten van de ecologische functies ervan gestimuleerd en een lange lijst van plantenverdedigingstheorieën opgeleverd, die de evolutionaire en ecologische ontwikkeling van plant-insectinteracties beschrijven. Empirisch onderzoek biedt belangrijke richtlijnen (2). Deze plantenverdedigingstheorieën volgden echter niet het gebruikelijke pad van hypothetisch-deductief redeneren, waarbij belangrijke voorspellingen op hetzelfde analyseniveau werden gesteld (3) en experimenteel werden getest om de volgende cyclus van theoretische ontwikkeling te bevorderen (4). Technische beperkingen beperken de gegevensverzameling tot specifieke metabolische categorieën en sluiten een uitgebreide analyse van gespecialiseerde metabolieten uit, waardoor vergelijkingen tussen categorieën, die essentieel zijn voor de theoretische ontwikkeling, worden belemmerd (5). Het gebrek aan uitgebreide metabolomics-gegevens en een gemeenschappelijke maatstaf om de verwerkingsworkflow van de metabolische ruimte tussen verschillende plantengroepen te vergelijken, belemmert de wetenschappelijke volwassenheid van het vakgebied.
De nieuwste ontwikkelingen op het gebied van tandemmassaspectrometrie (MS/MS) metabolomics kunnen de metabolische veranderingen binnen en tussen soorten van een gegeven systeemclade uitgebreid karakteriseren en kunnen worden gecombineerd met computationele methoden om de structurele gelijkenis tussen deze complexe mengsels te berekenen. Voorkennis van chemie (5). De combinatie van geavanceerde technologieën in analyse en computerberekeningen biedt een noodzakelijk kader voor het langdurig testen van veel voorspellingen die worden gedaan door de ecologische en evolutionaire theorieën over metabolische diversiteit. Shannon (6) introduceerde de informatietheorie voor het eerst in zijn baanbrekende artikel in 1948, waarmee hij de basis legde voor de wiskundige analyse van informatie, die in veel andere vakgebieden dan de oorspronkelijke toepassing is gebruikt. In de genomica is de informatietheorie met succes toegepast om sequentieconservatieve informatie te kwantificeren (7). In transcriptomics-onderzoek analyseert de informatietheorie de algehele veranderingen in het transcriptoom (8). In eerder onderzoek hebben we het statistische kader van de informatietheorie toegepast op metabolomics om de metabolische expertise op weefselniveau in planten te beschrijven (9). Hier combineren we de op MS/MS gebaseerde workflow met het statistische raamwerk van de informatietheorie, gekenmerkt door de metabolische diversiteit in de gangbare terminologie, om de belangrijkste voorspellingen van de plantenafweertheorie van het door herbivoren geïnduceerde metaboloom te vergelijken.
De theoretische kaders van plantenverdediging zijn doorgaans onderling samenhangend en kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën: die welke de distributie van plantspecifieke metabolieten proberen te verklaren op basis van verdedigingsfuncties, zoals optimale verdediging (OD) (10), de bewegende-doel-theorie (MT) (11) en de verschijningstheorie (12), terwijl andere mechanische verklaringen zoeken voor hoe veranderingen in de beschikbaarheid van hulpbronnen de plantengroei en de accumulatie van gespecialiseerde metabolieten beïnvloeden, zoals de koolstof-voedingsstoffenbalanshypothese (13), de groeisnelheidshypothese (14) en de hypothese van het groei- en differentiatie-evenwicht (15). De twee sets theorieën bevinden zich op verschillende analyseniveaus (4). Twee theorieën die verdedigingsfuncties op functioneel niveau omvatten, domineren echter het gesprek over constitutieve en induceerbare plantenverdediging: de OD-theorie, die ervan uitgaat dat planten alleen in hun kostbare chemische verdedigingsstoffen investeren wanneer dat nodig is, bijvoorbeeld wanneer ze worden opgegeten. Wanneer een grasdier aanvalt, wordt daarom, afhankelijk van de mogelijkheid van een toekomstige aanval, de verbinding met een verdedigingsfunctie toegewezen (10); De MT-hypothese stelt dat er geen as van gerichte metabolietverandering bestaat, maar dat de metaboliet willekeurig verandert, waardoor de mogelijkheid ontstaat om het metabolische "bewegingsdoel" van aanvallende herbivoren te blokkeren. Met andere woorden, deze twee theorieën doen tegengestelde voorspellingen over de metabolische hermodellering die plaatsvindt na de aanval van herbivoren: de relatie tussen de unidirectionele accumulatie van metabolieten met een defensieve functie (OD) en niet-gerichte metabolische veranderingen (MT) (11).
De OD- en MT-hypothesen omvatten niet alleen de geïnduceerde veranderingen in het metaboloom, maar ook de ecologische en evolutionaire gevolgen van de accumulatie van deze metabolieten, zoals de adaptieve kosten en baten van deze metabolische veranderingen in een specifieke ecologische omgeving (16). Hoewel beide hypothesen de defensieve functie van gespecialiseerde metabolieten erkennen, die al dan niet kostbaar kunnen zijn, ligt de belangrijkste voorspelling die de OD- en MT-hypothesen onderscheidt in de richting van de geïnduceerde metabolische veranderingen. De voorspelling van de OD-theorie heeft tot nu toe de meeste experimentele aandacht gekregen. Deze tests omvatten de studie van de directe of indirecte defensieve functies van verschillende weefsels van specifieke verbindingen in kassen en natuurlijke omstandigheden, evenals veranderingen in het stadium van plantenontwikkeling (17-19). Tot nu toe moet echter, vanwege het ontbreken van een workflow en een statistisch kader voor een globale, alomvattende analyse van de metabolische diversiteit van elk organisme, het belangrijkste verschil in voorspelling tussen de twee theorieën (dat wil zeggen, de richting van de metabolische veranderingen) nog worden getest. Hier bieden we een dergelijke analyse.
Een van de belangrijkste kenmerken van plantspecifieke metabolieten is hun extreme structurele diversiteit op alle niveaus, van individuele planten en populaties tot verwante soorten (20). Veel kwantitatieve veranderingen in gespecialiseerde metabolieten kunnen op populatieniveau worden waargenomen, terwijl sterke kwalitatieve verschillen meestal op soortniveau behouden blijven (20). Plantmetabolische diversiteit is daarom het belangrijkste aspect van functionele diversiteit en weerspiegelt het aanpassingsvermogen aan verschillende niches, met name niches met verschillende invasiemogelijkheden door specifieke insecten en algemene herbivoren (21). Sinds Fraenkels (22) baanbrekende artikel over de redenen voor het bestaan ​​van plantspecifieke metabolieten worden interacties met verschillende insecten beschouwd als belangrijke selectiedrukken, en men gelooft dat deze interacties planten tijdens de evolutie hebben gevormd. Metabolische route (23). Verschillen tussen soorten in de diversiteit van gespecialiseerde metabolieten kunnen ook het fysiologische evenwicht weerspiegelen dat samenhangt met constitutieve en induceerbare plantenafweer tegen herbivore strategieën, aangezien de twee soorten vaak negatief met elkaar gecorreleerd zijn (24). Hoewel het wellicht gunstig is om te allen tijde een goede verdediging te handhaven, bieden tijdige metabolische veranderingen die met verdediging gepaard gaan duidelijke voordelen doordat planten waardevolle hulpbronnen kunnen toewijzen aan andere fysiologische investeringen (19, 24) en de noodzaak tot symbiose kunnen vermijden. Neveneffecten (25). Bovendien kunnen deze reorganisaties van gespecialiseerde metabolieten, veroorzaakt door insectenherbivoren, leiden tot een destructieve verspreiding in de populatie (26) en kunnen ze een directe weerspiegeling zijn van substantiële natuurlijke veranderingen in het jasmijnzuur (JA)-signaal, die in de populatie behouden kunnen blijven. Hoge en lage JA-signalen zijn afwegingen tussen verdediging tegen herbivoren en concurrentie met specifieke soorten (27). Daarnaast zullen gespecialiseerde metabolietenbiosynthesepaden tijdens de evolutie snel verloren gaan en transformeren, wat resulteert in een ongelijkmatige metabolische verspreiding tussen nauw verwante soorten (28). Deze polymorfismen kunnen snel ontstaan ​​als reactie op veranderende herbivorenpatronen (29), wat betekent dat de fluctuatie van herbivorengemeenschappen een belangrijke factor is die metabolische heterogeniteit aandrijft.
Hier hebben we specifiek de volgende problemen opgelost: (I) Hoe herconfigureert het herbivore insect het plantenmetaboloom? (II) Wat zijn de belangrijkste informatiecomponenten van metabole plasticiteit die gekwantificeerd kunnen worden om de voorspellingen van de theorie van langetermijnverdediging te testen? (III) Als het plantenmetaboloom op een manier wordt geherprogrammeerd die uniek is voor de aanvaller, en zo ja, welke rol spelen plantenhormonen bij het afstemmen van een specifieke metabole respons, en welke metabolieten dragen bij aan de soortspecificiteit van de verdediging? (IV) Aangezien de voorspellingen van veel verdedigingstheorieën kunnen worden uitgebreid naar alle niveaus van biologische weefsels, hebben we onderzocht hoe consistent de veroorzaakte metabole respons is bij interne vergelijkingen en bij vergelijkingen tussen soorten. Daartoe hebben we systematisch het bladmetaboloom van nicotinetabak bestudeerd. Nicotinetabak is een ecologische modelplant met een rijk, gespecialiseerd metabolisme en is effectief tegen de larven van twee inheemse herbivoren, Lepidoptera Datura (Ms) (zeer agressief, voornamelijk gegeten door Solanaceae) en Spodoptera littoralis (Sl). Katoenbladwormen vormen een soort "geslacht", met Solanaceae als waardplanten en andere geslachten en families als voedselbron. We hebben het MS/MS-metabolomicsspectrum geanalyseerd en statistische descriptors uit de informatietheorie geëxtraheerd om OD- en MT-theorieën te vergelijken. Specificiteitskaarten werden gemaakt om de identiteit van belangrijke metabolieten te onthullen. De analyse werd uitgebreid naar de inheemse populatie van N. nasi en nauw verwante tabakssoorten om de covariantie tussen plantenhormoonsignalering en OD-inductie verder te analyseren.
Om een ​​algemeen beeld te schetsen van de plasticiteit en structuur van het bladmetaboloom van herbivore tabak, hebben we een eerder ontwikkelde analyse- en berekeningsworkflow gebruikt om op uitgebreide wijze data-onafhankelijke MS/MS-spectra met hoge resolutie van plantenextracten te verzamelen en te deconvolueren ( 9 ). Deze ongedifferentieerde methode (MS/MS genoemd) kan niet-redundante spectra van verbindingen construeren, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor alle hier beschreven analyses op verbindingsniveau. Deze gedeconvolueerde plantenmetabolieten zijn van verschillende typen en bestaan ​​uit honderden tot duizenden metabolieten (ongeveer 500-1000 s/MS/MS in dit geval). Hier beschouwen we metabolische plasticiteit in het kader van de informatietheorie en kwantificeren we de diversiteit en professionaliteit van het metaboloom op basis van de Shannon-entropie van de metabolische frequentieverdeling. Met behulp van de eerder geïmplementeerde formule (8) hebben we een reeks indicatoren berekend die kunnen worden gebruikt om de metaboloomdiversiteit (Hj-indicator), de specialisatie van het metabolische profiel (δj-indicator) en de metabolische specificiteit van een enkele metaboliet (Si-indicator) te kwantificeren. Daarnaast hebben we de Relative Distance Plasticity Index (RDPI) toegepast om de induceerbaarheid van het metaboloom door herbivoren te kwantificeren (Figuur 1A) (30). Binnen dit statistische kader behandelen we het MS/MS-spectrum als de basisinformatie-eenheid en verwerken we de relatieve abundantie van MS/MS tot een frequentieverdelingskaart. Vervolgens gebruiken we Shannon-entropie om hieruit de metaboloomdiversiteit te schatten. De metaboloomspecialisatie wordt gemeten aan de hand van de gemiddelde specificiteit van een enkel MS/MS-spectrum. De toename in de abundantie van sommige MS/MS-klassen na inductie door herbivoren wordt dus omgezet in spectrale induceerbaarheid, RDPI en specialisatie, dat wil zeggen de toename van de δj-index, omdat er meer gespecialiseerde metabolieten worden geproduceerd en een hoge Si-index wordt gegenereerd. De verlaging van de Hj-diversiteitsindex weerspiegelt dat ofwel het aantal gegenereerde MS/MS-spectra afneemt, ofwel de frequentieverdeling van het profiel in een minder uniforme richting verandert, terwijl de algehele onzekerheid afneemt. Door middel van de Si-indexberekening is het mogelijk om aan te tonen welke MS/MS worden geïnduceerd door bepaalde herbivoren, en welke MS/MS juist niet reageren op de inductie. Dit is een belangrijke indicator om onderscheid te maken tussen MT- en OD-voorspellingen.
(A) Statistische beschrijvers gebruikt voor herbivore (H1 tot Hx) MS/MS-gegevens: induceerbaarheid (RDPI), diversiteit (Hj-index), specialisatie (δj-index) en metabolietspecificiteit (Si-index). Een toename van de mate van specialisatie (δj) geeft aan dat er gemiddeld meer herbivore-specifieke metabolieten worden geproduceerd, terwijl een afname van de diversiteit (Hj) wijst op een afname van de productie van metabolieten of een ongelijke verdeling van metabolieten in de distributiekaart. De Si-waarde beoordeelt of de metaboliet specifiek is voor een bepaalde conditie (hier: herbivoor) of juist op hetzelfde niveau wordt gehandhaafd. (B) Conceptueel diagram van de voorspelling van de verdedigingstheorie met behulp van de informatietheorie-as. De OD-theorie voorspelt dat een aanval door herbivoren de productie van verdedigingsmetabolieten zal verhogen, waardoor δj toeneemt. Tegelijkertijd neemt Hj af omdat het profiel wordt gereorganiseerd in de richting van een verminderde onzekerheid van de metabolische informatie. De MT-theorie voorspelt dat de aanval van herbivoren niet-directionele veranderingen in het metaboloom zal veroorzaken, waardoor Hj toeneemt als indicator van toegenomen onzekerheid over metabolische informatie en een willekeurige verdeling van Si ontstaat. We hebben ook een gemengd model voorgesteld, de beste MT, waarin sommige metabolieten met een hogere defensieve waarde bijzonder sterk zullen toenemen (hoge Si-waarde), terwijl andere willekeurige reacties vertonen (lagere Si-waarde).
Met behulp van informatietheoretische descriptors interpreteren we de OD-theorie als volgt: door herbivoren geïnduceerde veranderingen in specifieke metabolieten in een niet-geïnduceerde, constitutieve toestand zullen leiden tot (i) een toename van de metabolische specificiteit (Si-index), wat de metabonomische specificiteit (δj-index) stimuleert (de toename van bepaalde specifieke metabolietgroepen met een hogere verdedigingswaarde), en (ii) een afname van de metaboloomdiversiteit (Hj-index) als gevolg van de verandering in de metabolische frequentieverdeling naar een grotere leptine-lichaamverdeling. Op het niveau van een enkele metaboliet wordt een geordende Si-verdeling verwacht, waarbij de metaboliet de Si-waarde verhoogt in overeenstemming met zijn verdedigingswaarde (Figuur 1B). In lijn hiermee verklaren we de MT-theorie als volgt: excitatie zal leiden tot (i) niet-directionele veranderingen in metabolieten, resulterend in een afname van de δj-index, en (ii) een toename van de Hj-index als gevolg van een toename van de metabolische onzekerheid, oftewel willekeurigheid, die gekwantificeerd kan worden door Shannon-entropie in de vorm van gegeneraliseerde diversiteit. Wat de metabolische samenstelling betreft, voorspelt de MT-theorie een willekeurige verdeling van Si. Rekening houdend met het feit dat bepaalde metabolieten onder specifieke omstandigheden aanwezig zijn en andere niet, en dat hun verdedigingswaarde afhangt van de omgeving, hebben we ook een gemengd verdedigingsmodel voorgesteld, waarin δj en Hj in twee richtingen verdeeld zijn. De Si-toename in alle richtingen zorgt ervoor dat alleen bepaalde metabolietengroepen met een hogere verdedigingswaarde de Si-concentratie significant verhogen, terwijl andere een willekeurige verdeling vertonen (Figuur 1B).
Om de herziene voorspelling van de verdedigingstheorie op de as van de informatietheorie-descriptor te testen, kweekten we expert (Ms) of generalist (Sl) herbivore larven op de bladeren van Nepenthes pallens (Figuur 2A). Met behulp van MS/MS-analyse haalden we 599 niet-redundante MS/MS-spectra (gegevensbestand S1) uit methanolextracten van bladweefsel dat na de vraat van de rupsen was verzameld. Door de RDPI-, Hj- en δj-indexen te gebruiken om de herconfiguratie van de informatie-inhoud in MS/MS-configuratiebestanden te visualiseren, komen interessante patronen naar voren (Figuur 2B). De algemene trend is dat, zoals beschreven door de informatiedescriptor, de mate van alle metabolische reorganisatie toeneemt naarmate de rupsen bladeren blijven eten: 72 uur nadat de herbivoor heeft gegeten, neemt de RDPI significant toe. Vergeleken met de onbeschadigde controlegroep was Hj significant verlaagd, wat te wijten was aan de toegenomen mate van specialisatie van het metabolische profiel, gekwantificeerd door de δj-index. Deze duidelijke trend is consistent met de voorspellingen van de OD-theorie, maar is inconsistent met de belangrijkste voorspellingen van de MT-theorie, die stelt dat willekeurige (niet-directionele) veranderingen in metabolietniveaus worden gebruikt als defensieve camouflage (Figuur 1B). Hoewel de inhoud van de orale secretie (OS) en het voedingsgedrag van deze twee herbivoren verschillen, resulteerde hun directe voeding in vergelijkbare veranderingen in de richting van Hj en δj gedurende de oogstperiodes van 24 en 72 uur. Het enige verschil deed zich voor na 72 uur RDPI. Vergeleken met de door Ms-voeding veroorzaakte metabolisatie was de algehele metabolisatie geïnduceerd door Sl-voeding hoger.
(A) Experimenteel ontwerp: gewone varkens (S1) of ervaren (Ms) herbivoren worden gevoed met ontzoute bladeren van bekerplanten, terwijl voor gesimuleerde herbivorie de OS van Ms (W + OSMs) wordt gebruikt om de punctie van gestandaardiseerde bladposities te bewerkstelligen. S1 (W + OSMs) larven of water (W + W). De controle (C) is een onbeschadigd blad. (B) Induceerbaarheid (RDPI vergeleken met de controlekaart), diversiteit (Hj-index) en specialisatie-index (δj-index) berekend voor de specifieke metabolietenkaart (599 MS/MS; databestand S1). Sterretjes geven significante verschillen aan tussen de directe voeding door herbivoren en de controlegroep (Student's t-test met gepaarde t-test, *P<0,05 en ***P<0,001). ns, niet significant. (C) Tijdresolutie-index van het hoofdmetabolietenspectrum (blauwe box, aminozuren, organische zuren en suikers; databestand S2) en het spectrum van specifieke metabolieten (rode box 443 MS/MS; databestand S1) na gesimuleerde herbivorie. De kleurband verwijst naar het 95%-betrouwbaarheidsinterval. De asterisk geeft een significant verschil aan tussen de behandeling en de controle [kwadratische variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door Tukey's honestly significant difference (HSD) voor post-hoc meervoudige vergelijkingen, *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001]. (D) Specificatie van spreidingsdiagrammen en profielen van specifieke metabolieten (herhaalde monsters met verschillende behandelingen).
Om te onderzoeken of de door herbivoren veroorzaakte veranderingen op metaboloomniveau worden weerspiegeld in de veranderingen in het niveau van individuele metabolieten, richtten we ons eerst op de metabolieten die eerder zijn bestudeerd in de bladeren van Nepenthes pallens, waarvan de resistentie tegen herbivoren is bewezen. Fenolamiden zijn hydroxycinnamamide-polyamineconjugaten die zich ophopen tijdens het vraatproces van insecten en waarvan bekend is dat ze de prestaties van insecten verminderen (32). We zochten naar de voorlopers van de corresponderende MS/MS en plotten hun cumulatieve kinetische curves (Figuur S1). Het is niet verrassend dat fenolderivaten die niet direct betrokken zijn bij de verdediging tegen herbivoren, zoals chlorogeenzuur (CGA) en rutine, worden gedownreguleerd na vraat. Daarentegen kunnen herbivoren fenolamiden zeer potent maken. De continue voeding van de twee herbivoren resulteerde in vrijwel hetzelfde excitatie spectrum van fenolamiden, en dit patroon was vooral duidelijk voor de de novo synthese van fenolamiden. Hetzelfde fenomeen zal worden waargenomen bij het onderzoeken van de route van 17-hydroxygeranyl nonanediol diterpeenglycosiden (17-HGL-DTGs), die een groot aantal acyclische diterpenen produceert met effectieve anti-herbivore functies (33), waarvan Ms Feeding with Sl een vergelijkbaar expressieprofiel teweegbracht (Figuur S1)).
Een mogelijk nadeel van directe voedingsproeven met herbivoren is het verschil in de snelheid waarmee herbivoren bladeren consumeren en de voedingstijd van de herbivoren, waardoor het moeilijk is om de soortspecifieke effecten van wonden en herbivoren te elimineren. Om de soortspecifieke aard van de geïnduceerde metabolische respons van het blad beter te kunnen bepalen, simuleerden we de voeding van Ms- en Sl-larven door de vers verzamelde OS (OSM en OSS1) direct aan te brengen op de standaard punctie W op consistente bladposities. Deze procedure wordt W + OS-behandeling genoemd en standaardiseert de inductie door het begin van de respons die door de herbivoor wordt opgewekt nauwkeurig te timen, zonder verstorende effecten van verschillen in de snelheid of hoeveelheid weefselverlies (Figuur 2A) (34). Met behulp van de MS/MS-analyse- en berekeningspipeline hebben we 443 MS/MS-spectra (gegevensbestand S1) verkregen, die overlapten met de spectra die eerder waren verzameld uit directe voedingsproeven. De informatietheoretische analyse van deze MS/MS-dataset toonde aan dat de herprogrammering van bladspecifieke metabolomen door gesimuleerde herbivoren OS-specifieke inducties vertoonde (Figuur 2C). In het bijzonder veroorzaakte OSM, vergeleken met de OSS1-behandeling, een versterking van de metaboloomspecialisatie na 4 uur. Het is opmerkelijk dat, vergeleken met de dataset van het experiment met directe herbivore voeding, de metabolische kinetiek, gevisualiseerd in een tweedimensionale ruimte met Hj en δj als coördinaten, en de richting van de metaboloomspecialisatie als reactie op de gesimuleerde herbivore behandeling in de loop van de tijd consistent toenemen (Figuur 2D). Tegelijkertijd kwantificeerden we de hoeveelheid aminozuren, organische zuren en suikers (databestand S2) om te onderzoeken of deze gerichte toename in metaboloomexpertise te wijten is aan de herconfiguratie van het centrale koolstofmetabolisme als reactie op gesimuleerde herbivoren (Figuur S2). Om dit patroon beter te verklaren, volgden we verder de metabolische accumulatiekinetiek van de eerder besproken fenolamide- en 17-HGL-DTG-routes. De OS-specifieke inductie van herbivoren wordt omgezet in een differentieel herschikkingspatroon binnen het fenolamide-metabolisme (Figuur S3). Fenolamiden die coumarine- en caffeoyl-groepen bevatten, worden bij voorkeur geïnduceerd door OSS1, terwijl OSM's een specifieke inductie van ferulylconjugaten teweegbrengen. Voor het 17-HGL-DTG-pad werd differentiële OS-inductie door stroomafwaartse malonylering- en dimalonyleringproducten gedetecteerd (Figuur S3).
Vervolgens bestudeerden we de door OS geïnduceerde transcriptoomplasticiteit met behulp van de tijdreeks-microarraydataset, die het gebruik van OSM's simuleert om de bladeren van de rozetplant te behandelen bij herbivoren. De bemonsteringskinetiek overlapt in principe met de kinetiek die in deze metabolomicsstudie is gebruikt (35). In vergelijking met de metaboloomherconfiguratie waarbij de metabolische plasticiteit in de loop van de tijd met name toeneemt, observeren we voorbijgaande transcriptie-uitbarstingen in bladeren die door Ms zijn geïnduceerd, waarbij de transcriptoominduceerbaarheid (RDPI) en specialisatie (δj) op 1 uur en diversiteit (Hj) significant toenemen op dit tijdstip, de expressie van BMP1 significant afneemt, gevolgd door een afname van de transcriptoomspecialisatie (Figuur S4). Metabolische genfamilies (zoals P450, glycosyltransferase en BAHD-acyltransferase) nemen deel aan het proces van het samenstellen van speciale metabolieten uit structurele eenheden afgeleid van het primaire metabolisme, volgens het eerdergenoemde vroege model van hoge specialisatie. Als casestudie werd het fenylalaninepad geanalyseerd. De analyse bevestigde dat de kerngenen in het fenolamidemetabolisme sterk geïnduceerd worden door oxidatieve stress bij herbivoren in vergelijking met niet-aangetrokken planten, en dat hun expressiepatronen nauw op elkaar aansluiten. De transcriptiefactor MYB8 en de structurele genen PAL1, PAL2, C4H en 4CL stroomopwaarts van dit pad vertoonden een vroege initiatie van transcriptie. Acyltransferasen die een rol spelen in de uiteindelijke assemblage van fenolamide, zoals AT1, DH29 en CV86, vertonen een langdurig opregulatiepatroon (Figuur S4). De bovenstaande observaties geven aan dat de vroege initiatie van transcriptoomspecialisatie en de latere versterking van metabolomicsspecialisatie een gekoppeld proces vormen, wat mogelijk te wijten is aan een synchroon regulatiesysteem dat een krachtige afweerreactie initieert.
De herconfiguratie in de signalering van plantenhormonen fungeert als een regulerende laag die informatie over herbivoren integreert om de fysiologie van planten te herprogrammeren. Na de simulatie van de herbivoren hebben we de cumulatieve dynamiek van belangrijke categorieën plantenhormonen gemeten en de temporele co-expressie ertussen gevisualiseerd [Pearson correlatiecoëfficiënt (PCC) > 0,4] (Figuur 3A). Zoals verwacht zijn plantenhormonen die verband houden met biosynthese met elkaar verbonden binnen het co-expressienetwerk van plantenhormonen. Daarnaast is de metabolische specificiteit (Si-index) in dit netwerk opgenomen om de plantenhormonen te benadrukken die door verschillende behandelingen worden geïnduceerd. Twee belangrijke gebieden van herbivore-specifieke respons worden onderscheiden: één in de JA-cluster, waar JA (de biologisch actieve vorm JA-Ile) en andere JA-derivaten de hoogste Si-score vertonen; de andere is ethyleen (ET). Gibberelline vertoonde slechts een matige toename in herbivore specificiteit, terwijl andere plantenhormonen, zoals cytokinine, auxine en abscisinezuur, een lage inductiespecificiteit voor herbivoren vertoonden. Vergeleken met het gebruik van alleen W + W, kan de versterking van de piekwaarde van JA-derivaten door de OS-toepassing (W + OS) in principe worden omgezet in een sterke specifieke indicator voor JA's. Verrassend genoeg is bekend dat OSM en OSS1 met verschillende elicitorgehaltes een vergelijkbare accumulatie van JA en JA-Ile veroorzaken. In tegenstelling tot OSS1 wordt OSM specifiek en sterk geïnduceerd door OSM's, terwijl OSS1 de respons van basale wonden niet versterkt (Figuur 3B).
(A) Co-expressienetwerkanalyse gebaseerd op PCC-berekening van de simulatie van de accumulatiekinetiek van plantenhormonen geïnduceerd door herbivoren. De knoop vertegenwoordigt een enkel plantenhormoon en de grootte van de knoop vertegenwoordigt de Si-index die specifiek is voor het plantenhormoon tussen de behandelingen. (B) Accumulatie van JA, JA-Ile en ET in bladeren veroorzaakt door verschillende behandelingen, aangegeven met verschillende kleuren: abrikoos, W + OSM; blauw, W + OSSl; zwart, W + W; grijs, C (controle). Sterretjes geven significante verschillen aan tussen behandeling en controle (tweeweg ANOVA gevolgd door Tukey HSD post-hoc meervoudige vergelijking, *** P <0,001). Informatietheoretische analyse van (C)697 MS/MS (gegevensbestand S1) in JA-biosynthese en verstoord perceptiespectrum (irAOC en irCOI1) en (D)585 MS/MS (gegevensbestand S1) in ETR1 met verstoord ET-signaal. Twee gesimuleerde behandelingen met herbivoren werden toegepast op plantenlijnen en lege voertuig (EV) controleplanten. Sterretjes geven significante verschillen aan tussen de W+OS-behandeling en de onbeschadigde controle (tweeweg-ANOVA gevolgd door Tukey HSD post-hoc meervoudige vergelijking, *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001). (E) Verspreidingsgrafieken van verspreide tegenstand tegen specialisatie. De kleuren vertegenwoordigen verschillende genetisch gemodificeerde stammen; de symbolen vertegenwoordigen verschillende behandelingsmethoden: driehoek, W + OSS1; rechthoek, W + OSM; cirkel C
Vervolgens gebruiken we een genetisch gemodificeerde stam van verzwakte Nepenthes (irCOI1 en sETR1) in de belangrijkste stappen van de JA- en ET-biosynthese (irAOC en irACO) en -perceptie (irCOI1 en sETR1) om het metabolisme van deze twee plantenhormonen bij herbivoren te analyseren en de relatieve bijdrage van herprogrammering te bepalen. In overeenstemming met eerdere experimenten bevestigden we de inductie van herbivore-OS in lege dragerplanten (EV-planten) (Figuur 3, C tot D) en de algehele afname van de Hj-index veroorzaakt door OSM, terwijl de δj-index toenam. De respons is sterker dan de respons die wordt veroorzaakt door OSS1. Een tweelijngrafiek met Hj en δj als coördinaten toont de specifieke deregulatie (Figuur 3E). De meest opvallende trend is dat in stammen zonder JA-signaal de door herbivoren veroorzaakte veranderingen in metaboloomdiversiteit en -specialisatie vrijwel volledig zijn geëlimineerd (Figuur 3C). Daarentegen verzwakt de stille ET-perceptie in sETR1-planten, hoewel het algehele effect op veranderingen in het herbivore metabolisme veel lager is dan dat van JA-signalering, het verschil in Hj- en δj-indices tussen OSM- en OSS1-stimulatie (Figuur 3D en Figuur S5). Dit duidt erop dat ET-signaaltransductie, naast de kernfunctie van JA-signaaltransductie, ook dient als een fijnregeling van de soortspecifieke metabolische respons van herbivoren. In overeenstemming met deze fijnregelingsfunctie was er geen verandering in de algehele induceerbaarheid van het metaboloom in sETR1-planten. Aan de andere kant induceerden irACO-planten, vergeleken met sETR1-planten, vergelijkbare algehele amplitudes van metabolische veranderingen veroorzaakt door herbivoren, maar vertoonden significant verschillende Hj- en δj-scores tussen OSM- en OSS1-stimulatie (Figuur S5).
Om gespecialiseerde metabolieten te identificeren die een belangrijke bijdrage leveren aan de soortspecifieke respons van herbivoren en om hun productie via ET-signalen nauwkeurig af te stemmen, hebben we de eerder ontwikkelde structurele MS/MS-methode gebruikt. Deze methode is gebaseerd op de bi-clusteringmethode om de metabolische familie opnieuw af te leiden uit MS/MS-fragmenten [genormaliseerd dotproduct (NDP)] en een gelijkenisscore gebaseerd op neutraal verlies (NL). De MS/MS-dataset die is samengesteld door de analyse van ET-transgene lijnen leverde 585 MS/MS-fragmenten op (databestand S1), die werden opgelost door ze te clusteren in zeven hoofd-MS/MS-modules (M) (Figuur 4A). Sommige van deze modules zijn dicht opeengepakt met eerder gekarakteriseerde speciale metabolieten: zo zijn M1, M2, M3, M4 en M7 rijk aan verschillende fenolderivaten (M1), flavonoïdeglycosiden (M2), acylsuikers (M3 en M4) en 17-HGL-DTG (M7). Bovendien wordt de metabolische specifieke informatie (Si-index) van een enkele metaboliet in elke module berekend, waardoor de Si-verdeling intuïtief zichtbaar wordt. Kort gezegd worden MS/MS-spectra met een hoge herbivorie- en genotypespecificiteit gekenmerkt door hoge Si-waarden, en kurtosisstatistieken geven de verdeling van de vacht in de rechter staarthoek aan. Een dergelijke slanke colloïdverdeling werd gedetecteerd in M1, waarin fenolamide de hoogste Si-fractie vertoonde (Figuur 4B). De eerder genoemde herbivore induceerbare 17-HGL-DTG in M7 vertoonde een matige Si-score, wat wijst op een matige mate van differentiële regulatie tussen de twee OS-typen. Daarentegen behoren de meeste constitutief geproduceerde gespecialiseerde metabolieten, zoals rutine, CGA en acylsuikers, tot de laagste Si-scores. Om de structurele complexiteit en Si-verdeling tussen speciale metabolieten beter te onderzoeken, werd voor elke module een moleculair netwerk geconstrueerd (Figuur 4B). Een belangrijke voorspelling van de OD-theorie (samengevat in Figuur 1B) is dat de reorganisatie van specifieke metabolieten na vraat door herbivoren zou moeten leiden tot eenrichtingsveranderingen in metabolieten met een hoge verdedigingswaarde, met name door hun specificiteit te verhogen (in tegenstelling tot een willekeurige verdeling). De verdedigingsmetabolieten worden voorspeld door de MT-theorie. De meeste fenolderivaten die zich in M1 ophopen, zijn functioneel gerelateerd aan de afname van de prestaties van insecten (32). Bij het vergelijken van de Si-waarden in de M1-metabolieten tussen de geïnduceerde bladeren en de bladeren van de EV-controleplanten na 24 uur, observeerden we dat de metabolische specificiteit van veel metabolieten na vraat door herbivoren een significant stijgende trend vertoont (Figuur 4C). De specifieke toename in Si-waarde werd alleen waargenomen in verdedigende fenolamiden, maar er werd geen toename in Si-waarde waargenomen in andere fenolen en onbekende metabolieten die in deze module voorkomen. Dit is een gespecialiseerd model, dat gerelateerd is aan de OD-theorie. De belangrijkste voorspellingen van metabolische veranderingen veroorzaakt door herbivoren zijn consistent. Om te testen of deze bijzonderheid van het fenolamidespectrum werd veroorzaakt door OS-specifieke ET, hebben we de metaboliet Si-index uitgezet en een differentieel expressieniveau tussen OSM en OSS1 in de EV- en sETR1-genotypen bepaald (Figuur 4D). In sETR1 was het door fenolamide geïnduceerde verschil tussen OSM en OSS1 sterk verminderd. De bi-clusteringmethode werd ook toegepast op MS/MS-gegevens verzameld in stammen met onvoldoende JA om de belangrijkste MS/MS-modules te bepalen die verband houden met JA-gereguleerde metabolische specialisatie (Figuur S6).
(A) De clusteringresultaten van 585 MS/MS-analyses op basis van gedeelde fragmenten (NDP-gelijkenis) en gedeeld neutraal verlies (NL-gelijkenis) resulteren in een module (M) die consistent is met de bekende verbindingenfamilie, of met een onbekende of slecht gemetaboliseerde metabolietensamenstelling. Naast elke module wordt de metabolietspecifieke (MS/MS) distributie (Si) weergegeven. (B) Modulair moleculair netwerk: Knooppunten representeren MS/MS-scores en randen, NDP (rood) en NL (blauw) MS/MS-scores (drempelwaarde > 0,6). De gegradeerde metabolietspecificiteitsindex (Si) is gekleurd op basis van de module (links) en afgebeeld op het moleculaire netwerk (rechts). (C) Module M1 van de EV-plant in constitutieve (controle) en geïnduceerde toestand (gesimuleerde herbivoor) na 24 uur: moleculair netwerkdiagram (Si-waarde is de grootte van het knooppunt, defensief fenolamide is blauw gemarkeerd). (D) Het M1-moleculaire netwerkdiagram van de spectrumlijn sETR1 met verminderde EV- en ET-perceptie: de fenolische verbinding weergegeven door de groene cirkelknoop, en het significante verschil (P-waarde) tussen de W + OSM- en W + OSS1-behandelingen als knoopgrootte. CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-ferulinezuurester-urinezuur; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl-feruloyl-spermidine; Lycium barbarum in wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acylsuiker.
We hebben de analyse verder uitgebreid van een enkel verzwakt Nepenthes-genotype naar natuurlijke populaties, waar sterke intraspecifieke veranderingen in de JA-niveaus en specifieke metabolietniveaus van herbivoren eerder zijn beschreven in natuurlijke populaties (26). We hebben deze dataset gebruikt om 43 kiemplasma's te bestuderen. Deze kiemplasma's bestaan ​​uit 123 plantensoorten van N. pallens. Deze planten zijn afkomstig van zaden die zijn verzameld in verschillende natuurlijke habitats in Utah, Nevada, Arizona en Californië (Figuur S7). We hebben de metaboloomdiversiteit (hier populatieniveau β-diversiteit genoemd) en de specialisatie veroorzaakt door OSM berekend. In overeenstemming met eerdere studies observeerden we een breed scala aan metabolische veranderingen langs de Hj- en δj-assen, wat aangeeft dat kiemplasma's significante verschillen vertonen in de plasticiteit van hun metabolische reacties op herbivoren (Figuur S7). Deze organisatie doet denken aan eerdere observaties over het dynamische bereik van JA-veranderingen veroorzaakt door herbivoren, en heeft een zeer hoge waarde behouden in een enkele populatie (26, 36). Door JA en JA-Ile te gebruiken om de algehele correlatie tussen Hj en δj te testen, vonden we een significant positieve correlatie tussen JA en de metaboloom β-diversiteit en specialisatie-index (Figuur S7). Dit suggereert dat de door herbivoren geïnduceerde heterogeniteit in JA-inductie die op populatieniveau is waargenomen, mogelijk te wijten is aan belangrijke metabolische polymorfismen die worden veroorzaakt door selectie door insectenherbivoren.
Uit eerdere onderzoeken is gebleken dat tabakssoorten sterk verschillen in type en relatieve afhankelijkheid van geïnduceerde en constitutieve metabolische afweermechanismen. Men vermoedt dat deze veranderingen in de signaaltransductie en afweercapaciteiten tegen herbivoren worden gereguleerd door de populatiedruk van insecten, de levenscyclus van de plant en de productiekosten van de afweer in de niche waarin een bepaalde soort groeit. We hebben de consistentie van de door herbivoren geïnduceerde veranderingen in het bladmetaboloom van zes Nicotiana-soorten, afkomstig uit Noord- en Zuid-Amerika, onderzocht. Deze soorten zijn nauw verwant aan Nepenthes North America, namelijk Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineaire tabak, tabak (Nicotiana spegazzinii) en tabaksbladtabak (Nicotiana obtusifolia) (Figuur 5A) (37). Zes van deze soorten, waaronder de goed gekarakteriseerde soort N. please, zijn eenjarige planten van de petunia-clade, en obtusifolia N. zijn meerjarige planten van de zusterclade Trigonophyllae (38). Vervolgens werden W + W, W + OSM en W + OSS1-inducties uitgevoerd op deze zeven soorten om de metabolische herschikking van de insectenvoeding op soortniveau te bestuderen.
(A) Een bootstrap fylogenetische boom gebaseerd op maximale waarschijnlijkheid [voor nucleaire glutaminesynthese (38)] en de geografische verspreiding van zeven nauw verwante Nicotiana-soorten (verschillende kleuren) (37). (B) Een spreidingsdiagram van gespecialiseerde diversiteit voor de metabolische profielen van zeven Nicotiana-soorten (939 MS/MS; databestand S1). Op soortniveau is de metaboloomdiversiteit negatief gecorreleerd met de mate van specialisatie. De analyse van de correlatie op soortniveau tussen metabolische diversiteit en specialisatie en JA-accumulatie wordt weergegeven in Figuur 2. S9. Kleur, verschillende typen; driehoek, W + OSS1; rechthoek, W + OSM; (C) Nicotiana JA en JA-Ile-dynamiek zijn gerangschikt op basis van OS-excitatieamplitude (tweeweg ANOVA en Tukey HSD post-meervoudige vergelijking, * P <0,05, ** P <0,01 en ** Voor vergelijking van W + OS en W + W, P <0,001). Boxplot van (D) diversiteit en (E) specialisatie van elke soort na simulatie van herbivorie en methyl JA (MeJA). De asterisk geeft het significante verschil aan tussen W + OS en W + W of lanoline plus W (Lan + W) of Lan plus MeJA (Lan + MeJA) en Lan-controle (tweeweg-variantieanalyse, gevolgd door Tukey's HSD post-hoc meervoudige vergelijking, *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001).
Met behulp van de duale clustermethode identificeerden we 9 modules van 939 MS/MS (gegevensbestand S1). De samenstelling van de MS/MS, geherconfigureerd door verschillende behandelingen, varieert sterk tussen de verschillende modules en soorten (Figuur S8). Visualisatie van Hj (hier aangeduid als γ-diversiteit op soortniveau) en δj laat zien dat verschillende soorten zich groeperen in zeer verschillende groepen in de metabolische ruimte, waar de verdeling op soortniveau meestal prominenter is dan de excitatie. Met uitzondering van N. linear en N. obliquus vertonen ze een breed dynamisch bereik van inductie-effecten (Figuur 5B). Soorten zoals N. purpurea en N. obtusifolia daarentegen hebben een minder duidelijke metabolische respons op de behandeling, maar het metaboloom is diverser. De soortspecifieke verdeling van de geïnduceerde metabolische respons resulteerde in een significant negatieve correlatie tussen specialisatie en gamma-diversiteit (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10⁻⁸). OS-geïnduceerde veranderingen in JA-niveaus zijn positief gecorreleerd met metaboloomspecialisatie en negatief gecorreleerd met de metabolische gamma-diversiteit die door elke soort wordt vertoond (Figuur 5B en Figuur S9). Het is opmerkelijk dat de soorten die in Figuur 5C informeel worden aangeduid als "signaalresponsieve" soorten, zoals Nepenthes nematoden, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute en Nepenthes attenuated, significante tekenen vertoonden na 30 minuten. De recente OS-specifieke JA- en JA-Ile-uitbraken, terwijl andere bacteriën die "signaal-ongevoelig" worden genoemd, zoals Nepenthes mills, Nepenthes powdery en N. obtusifolia, alleen JA-Ile Edge-inductie vertonen zonder enige OS-specificiteit (Figuur 5C). Op metabolisch niveau, zoals hierboven vermeld, vertoonden de signaalresponsieve stoffen bij attenuated Nepenthes OS-specificiteit en verhoogden ze δj significant, terwijl ze Hj verlaagden. Dit OS-specifieke priming-effect werd niet waargenomen bij soorten die geclassificeerd zijn als signaal-niet-reactieve soorten (Figuur 5, D en E). OS-specifieke metabolieten worden vaker gedeeld tussen signaal-responsieve soorten, en deze signaalclusters clusteren met soorten met zwakkere signaalresponsen, terwijl soorten met zwakkere signaalresponsen minder onderlinge afhankelijkheid vertonen (Figuur S8). Dit resultaat geeft aan dat de OS-specifieke inductie van JAs en de OS-specifieke herconfiguratie van het stroomafwaartse metaboloom op soortniveau gekoppeld zijn.
Vervolgens gebruikten we een lanolinepasta met methyl-JA (MeJA) om planten te behandelen en te onderzoeken of deze koppelingsmodi worden beperkt door de beschikbaarheid van exogene JA, die zich in het cytoplasma van de planten bevindt. Snelle de-esterificatie is kenmerkend voor JA. We vonden dezelfde trend van de geleidelijke verandering van signaalgevoelige soorten naar signaal-niet-signaalgevoelige soorten, veroorzaakt door de continue toevoer van JA (Figuur 5, D en E). Kortom, de MeJA-behandeling herprogrammeerde de metabolomen van lineaire nematoden, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens en N. mikimotoi, sterk, wat resulteerde in een significante toename van δj en een afname van Hj. N. purpurea vertoonde alleen een toename van δj, maar niet van Hj. N. obtusifolia, waarvan eerder is aangetoond dat het extreem lage niveaus van JA accumuleert, reageert ook slecht op de MeJA-behandeling wat betreft de herconfiguratie van het metaboloom. Deze resultaten geven aan dat de JA-productie of signaaltransductie fysiologisch beperkt is in signaalongevoelige soorten. Om deze hypothese te testen, bestudeerden we de vier soorten (N. pallens, N. mills, N. pink en N. microphylla) geïnduceerd door W + W, W + OSMs en W + OSS1 Transcriptoom (39). In overeenstemming met het patroon van metaboloomhermodellering zijn de soorten goed gescheiden in de transcriptoomruimte, waarbij N. attenuated de hoogste OS-geïnduceerde RDPI vertoonde, terwijl N. gracilis de laagste had (Figuur 6A). Er werd echter vastgesteld dat de transcriptoomdiversiteit geïnduceerd door N. oblonga het laagst was van de vier soorten, in tegenstelling tot de hoogste metabonomische diversiteit van N. oblonga die eerder in zeven soorten werd aangetoond. Eerdere studies hebben aangetoond dat een reeks genen gerelateerd aan vroege afweersignalen, waaronder JA-signalen, de specificiteit verklaart van vroege afweerreacties geïnduceerd door herbivore-gerelateerde elicitoren in Nicotiana-soorten (39). Een vergelijking van de JA-signaleringsroutes tussen deze vier soorten bracht een interessant patroon aan het licht (Figuur 6B). De meeste genen in deze route, zoals AOC, OPR3, ACX en COI1, vertoonden relatief hoge inductieniveaus in deze vier soorten. Een belangrijk gen, JAR4, zet JA echter om in de biologisch actieve vorm van JA-Ile, waarvan de transcripten geaccumuleerd zijn. Het transcriptieniveau van JAR4 is zeer laag, met name in N. mills, Nepenthes pieris en N. microphylla. Bovendien werd alleen het transcript van een ander gen, AOS, niet gedetecteerd in N. bifidum. Deze veranderingen in genexpressie zouden verantwoordelijk kunnen zijn voor de extreme fenotypes die worden veroorzaakt door de lage JA-productie in signaal-anergische soorten en de inductie van N. gracilis.
(A) Informatietheoretische analyse van de herprogrammering van vroege transcriptionele responsen van vier nauw verwante tabakssoorten, bemonsterd 30 minuten na inductie door herbivorie. RDPI wordt berekend door de bladeren die geïnduceerd zijn door de herbivoor OS te vergelijken met de wondcontrole. De kleuren geven verschillende soorten aan en de symbolen verschillende behandelingsmethoden. (B) Analyse van genexpressie in JA-signaleringsroutes bij vier soorten. Het vereenvoudigde JA-pad wordt naast de boxplot weergegeven. Verschillende kleuren geven verschillende verwerkingsmethoden aan. De asterisk geeft aan dat er een significant verschil is tussen de W + OS-behandeling en de W + W-controle (voor de Student's t-test voor paarsgewijze verschillen, *P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001). OPDA: 12-oxofytodienoïnezuur; OPC-8: 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentaan-1-octaanzuur.
In het laatste deel bestudeerden we hoe soortspecifieke hermodellering van het metaboloom van verschillende plantensoorten door insecten resistentie kan bieden tegen herbivoren. Eerder onderzoek richtte zich op het geslacht Nicotiana. Hun resistentie tegen Ms en larven verschilt sterk (40). Hier bestudeerden we het verband tussen dit model en hun metabolische plasticiteit. Met behulp van de bovengenoemde vier tabakssoorten, en door de correlatie te testen tussen de diversiteit en specialisatie van het metaboloom veroorzaakt door herbivoren en de resistentie van planten tegen Ms en Sl, vonden we dat resistentie, diversiteit en specialisatie tegen de generalistische Sl allemaal positief gecorreleerd zijn, terwijl de correlatie tussen resistentie tegen de expert-dames en specialisatie zwak is en de correlatie met diversiteit niet significant is (Figuur S10). Wat betreft S1-resistentie, vertoonden zowel de verzwakte N. chinensis als N. gracilis, waarvan eerder was aangetoond dat ze zowel JA-signaaltransductieniveaus als metaboloomplasticiteit vertonen, zeer verschillende reacties op inductie door herbivoren, en ze vertoonden ook een vergelijkbare hoge resistentie. Geslacht.
In de afgelopen zestig jaar heeft de plantenverdedigingstheorie een theoretisch kader geboden, op basis waarvan onderzoekers een aanzienlijk aantal evoluties en functies van gespecialiseerde plantenmetabolieten hebben voorspeld. De meeste van deze theorieën volgen niet de gebruikelijke procedure van sterke gevolgtrekkingen (41). Ze doen belangrijke voorspellingen (3) op hetzelfde analyseniveau. Wanneer het testen van belangrijke voorspellingen het mogelijk maakt om specifieke theorieën te analyseren, zal dit het veld vooruit helpen. De nieuwe theorie doet voorspellingen op verschillende analyseniveaus en voegt een nieuwe laag beschrijvende overwegingen toe (42). De twee theorieën die op functioneel niveau zijn voorgesteld, MT en OD, kunnen echter gemakkelijk worden verklaard als belangrijke voorspellingen van gespecialiseerde metabolische veranderingen veroorzaakt door herbivoren: de OD-theorie gaat ervan uit dat veranderingen in de gespecialiseerde metabolische "ruimte" sterk directioneel zijn. De MT-theorie gaat ervan uit dat deze veranderingen niet-directioneel en willekeurig in de metabolische ruimte zullen zijn en de neiging hebben om metabolieten met een hoge verdedigingswaarde te bevatten. Eerdere onderzoeken naar OD- en MT-voorspellingen zijn uitgevoerd met behulp van een beperkte set a priori "verdedigings"-verbindingen. Deze op metabolieten gerichte tests sluiten de mogelijkheid uit om de omvang en het verloop van de metaboloomherconfiguratie tijdens herbivorie te analyseren, en staan ​​geen testen binnen een consistent statistisch kader toe om belangrijke voorspellingen te vereisen die als geheel kunnen worden beschouwd. Kwantificeer veranderingen in het plantenmetaboloom. Hier hebben we de innovatieve technologie in de metabolomics, gebaseerd op computationele MS, gebruikt en deconvolutie-MS-analyse uitgevoerd in de algemene context van informatietheorie-descriptors om het onderscheid tussen de twee voorgestelde modellen op globaal metabolomics-niveau te testen. De belangrijkste voorspelling van deze theorie is dat informatietheorie in veel vakgebieden is toegepast, met name in de context van biodiversiteit en onderzoek naar nutriëntenstromen (43). Voor zover wij weten, is dit echter de eerste toepassing die wordt gebruikt om de metabolische informatieruimte van planten te beschrijven en ecologische problemen op te lossen die verband houden met tijdelijke metabolische veranderingen als reactie op omgevingssignalen. De kracht van deze methode ligt met name in het vermogen om patronen binnen en tussen plantensoorten te vergelijken, om zo te onderzoeken hoe herbivoren zich van verschillende soorten hebben ontwikkeld tot macro-evolutionaire patronen op verschillende evolutieniveaus. Metabolisme.
Hoofdcomponentenanalyse (PCA) zet een multivariate dataset om in een ruimte met gereduceerde dimensies, waardoor de belangrijkste trend in de data kan worden verklaard. Het wordt daarom meestal gebruikt als een verkennende techniek om de dataset te ontleden, bijvoorbeeld bij de deconvolutie van het metaboloom. Dimensionale reductie leidt echter tot verlies van een deel van de informatie in de dataset, en PCA kan geen kwantitatieve informatie verschaffen over kenmerken die met name relevant zijn voor de ecologische theorie, zoals: hoe herbivoren de diversiteit in gespecialiseerde metabolieten (bijvoorbeeld soortenrijkdom, verspreiding en abundantie) herconfigureren? Welke metabolieten zijn voorspellend voor de geïnduceerde toestand van een bepaalde herbivoor? Vanuit het perspectief van specificiteit, diversiteit en induceerbaarheid wordt de informatie-inhoud van het bladspecifieke metabolietenprofiel ontleed, en wordt ontdekt dat het eten van herbivoren een specifiek metabolisme kan activeren. Onverwacht observeerden we dat, zoals beschreven in de geïmplementeerde informatietheoretische indicatoren, de resulterende metabolische situatie een grote overlap vertoont na de aanvallen van de twee herbivoren (de nachtactieve generalist Sl) en de Solanaceae-expert Ms. Hoewel hun voedingsgedrag en concentratie significant verschillen. Vetzuur-aminozuurconjugaat (FAC)-initiator in OS (31). Door herbivore OS te gebruiken om gestandaardiseerde prikwonden te behandelen, vertoonde de gesimuleerde herbivore behandeling ook een vergelijkbare trend. Deze gestandaardiseerde procedure voor het simuleren van de reactie van planten op herbivore aanvallen elimineert de verstorende factoren die worden veroorzaakt door veranderingen in het eetgedrag van herbivoren, wat leidt tot verschillende mate van schade op verschillende tijdstippen (34). FAC, waarvan bekend is dat het de belangrijkste oorzaak is van OSM, vermindert JAS en andere plantenhormoonreacties in OSS1, terwijl OSS1 honderden keren wordt verminderd (31). OSS1 veroorzaakte echter vergelijkbare niveaus van JA-accumulatie als OSM. Er is eerder aangetoond dat de JA-respons in verzwakte Nepenthes zeer gevoelig is voor OSM, waarbij FAC zijn activiteit kan behouden, zelfs wanneer het 1:1000 met water wordt verdund (44). Daarom is de FAC in OSS1, hoewel zeer laag, vergeleken met OSM, voldoende om een ​​aanzienlijke JA-uitbraak te induceren. Eerdere studies hebben aangetoond dat porine-achtige eiwitten (45) en oligosacchariden (46) kunnen worden gebruikt als moleculaire aanwijzingen om plantenafweerreacties in OSS1 te activeren. Het is echter nog steeds onduidelijk of deze elicitoren in OSS1 verantwoordelijk zijn voor de accumulatie van JA die in de huidige studie is waargenomen.
Hoewel er weinig studies zijn die de differentiële metabolische vingerafdrukken beschrijven die worden veroorzaakt door de toepassing van verschillende herbivoren of exogene JA of SA (salicylzuur) (47), heeft niemand de soortspecifieke verstoring van de herbivoren in het plantengrasnetwerk en de effecten daarvan op de specifieke impact van het metabolisme systematisch onderzocht. Deze analyse bevestigde verder dat de interne hormoonnetwerkverbinding met andere plantenhormonen dan JA's de specificiteit van de metabolische reorganisatie door herbivoren bepaalt. In het bijzonder ontdekten we dat de ET veroorzaakt door OSM significant groter was dan die veroorzaakt door OSS1. Deze modus is consistent met een hoger FAC-gehalte in OSM, wat een noodzakelijke en voldoende voorwaarde is voor het triggeren van een ET-burst (48). In de context van de interactie tussen planten en herbivoren is de signaalfunctie van ET op de plant-specifieke metabolietendynamiek nog steeds sporadisch en richt zich slechts op één enkele verbindingsgroep. Bovendien hebben de meeste studies gebruikgemaakt van exogene toepassing van ET of de voorlopers ervan of verschillende remmers om de regulatie van ET te bestuderen. Deze exogene chemische toepassingen veroorzaken echter veel niet-specifieke bijwerkingen. Voor zover wij weten, is dit onderzoek het eerste grootschalige systematische onderzoek naar de rol van ET bij het gebruik ervan om transgene planten met een verstoorde metaboloomfunctie te produceren en te detecteren, teneinde de dynamiek van het plantenmetaboloom te coördineren. Herbivoorspecifieke ET-inductie kan uiteindelijk de metaboloomrespons moduleren. Het meest significant is de transgene manipulatie van de genen voor ET-biosynthese (ACO) en -perceptie (ETR1), die de herbivoorspecifieke de novo-accumulatie van fenolamiden aan het licht bracht. Eerder is aangetoond dat ET de JA-geïnduceerde nicotineaccumulatie kan verfijnen door de regulatie van putrescine N-methyltransferase (49). Vanuit mechanisch oogpunt is het echter niet duidelijk hoe ET de inductie van fenamide verfijnt. Naast de signaaltransductiefunctie van ET kan de metabolische flux ook worden omgeleid naar S-adenosyl-1-methionine om de investering in polyaminofenolamiden te reguleren. S-adenosyl-1-methionine is een ET- en een veelvoorkomend intermediair in de polyaminebiosyntheseroute. Het mechanisme waarmee het ET-signaal het fenolamideniveau reguleert, vereist verder onderzoek.
Door het grote aantal bijzondere metabolieten met een onbekende structuur was het lange tijd niet mogelijk om, ondanks de intense aandacht voor specifieke metabolische categorieën, de temporele veranderingen in metabolische diversiteit na biologische interacties nauwkeurig te beoordelen. Momenteel blijkt uit analyses op basis van informatietheorie dat MS/MS-spectra, verkregen met behulp van onbevooroordeelde metabolieten, aantonen dat herbivoren die herbivoren eten of nabootsen, de algehele metabolische diversiteit van het bladmetaboloom blijven verminderen, terwijl de mate van specialisatie ervan toeneemt. Deze tijdelijke toename in metaboloomspecificiteit, veroorzaakt door herbivoren, gaat gepaard met een synergetische toename in transcriptoomspecificiteit. Het kenmerk dat het meest bijdraagt ​​aan deze grotere metaboloomspecialisatie (met een hogere Si-waarde) is de bijzondere metaboliet met de eerder gekarakteriseerde herbivore functie. Dit model is consistent met de voorspelling van de OD-theorie, maar niet met de voorspelling van de MT-theorie met betrekking tot de willekeurigheid van metaboloomherprogrammering. Deze gegevens zijn echter ook consistent met de voorspelling van het gemengde model (beste MT; Figuur 1B), omdat andere niet-gekarakteriseerde metabolieten met onbekende afweerfuncties nog steeds een willekeurige Si-verdeling kunnen volgen.
Een opmerkelijk patroon dat verder door dit onderzoek wordt vastgelegd, is dat van het micro-evolutionaire niveau (een enkele plant en een tabakspopulatie) tot een grotere evolutionaire schaal (nauw verwante tabakssoorten) verschillende niveaus van evolutionaire organisatie in de "beste verdediging" significante verschillen vertonen in de capaciteiten van herbivoren. Moore et al. (20) en Kessler en Kalske (1) stelden onafhankelijk van elkaar voor om de drie functionele niveaus van biodiversiteit die oorspronkelijk door Whittaker (50) werden onderscheiden, om te zetten in de constitutieve en geïnduceerde temporele veranderingen van chemische diversiteit; deze auteurs hebben de procedures voor het verzamelen van grootschalige metaboloomgegevens echter niet samengevat en beschrijven evenmin hoe de metabolische diversiteit uit deze gegevens kan worden berekend. In deze studie zullen kleine aanpassingen aan Whittakers functionele classificatie α-metabolische diversiteit beschouwen als de diversiteit van MS/MS-spectra in een bepaalde plant, β-metabolische diversiteit als het basale intraspecifieke metabolisme van een groep populaties en γ-metabolische diversiteit als een uitbreiding van de analyse van vergelijkbare soorten.
Het JA-signaal is essentieel voor een breed scala aan metabole reacties bij herbivoren. Er is echter een gebrek aan rigoureus kwantitatief onderzoek naar de bijdrage van intraspecifieke regulatie van de JA-biosynthese aan de diversiteit van het metaboloom, en het is nog steeds onduidelijk of het JA-signaal een algemene plaats is voor stress-geïnduceerde metabole diversificatie op een hogere macro-evolutionaire schaal. We observeerden dat de herbivore aard van Nepenthes herbivorous metaboloomspecialisatie induceert en dat de variatie in metaboloomspecialisatie binnen de populatie van Nicotiana-soorten en tussen nauw verwante Nicotiana-soorten systematisch positief gecorreleerd is met JA-signalering. Bovendien zal de metabole specificiteit die door een enkel genotype herbivoor wordt geïnduceerd, verdwijnen wanneer het JA-signaal verstoord is (Figuur 3, C en E). Aangezien de veranderingen in het metabole spectrum van de van nature verzwakte Nepenthes-populaties voornamelijk kwantitatief zijn, kunnen de veranderingen in de metabole β-diversiteit en -specificiteit in deze analyse grotendeels worden veroorzaakt door de sterke excitatie van metabolietrijke verbindingcategorieën. Deze stofklassen domineren een deel van het metaboloomprofiel en leiden tot een positieve correlatie met JA-signalen.
Omdat de biochemische mechanismen van de nauw verwante tabakssoorten sterk verschillen, worden de metabolieten specifiek kwalitatief geïdentificeerd, waardoor de analyse meer analytisch is. De verwerking van het vastgelegde metabolische profiel door informatietheorie onthult dat inductie door herbivoren de afweging tussen metabolische gamma-diversiteit en specialisatie versterkt. Het JA-signaal speelt een centrale rol in deze afweging. De toename in metaboloomspecialisatie is consistent met de belangrijkste OD-voorspelling en is positief gecorreleerd met het JA-signaal, terwijl het JA-signaal negatief gecorreleerd is met metabolische gamma-diversiteit. Deze modellen geven aan dat de OD-capaciteit van planten voornamelijk wordt bepaald door de plasticiteit van JA, zowel op micro-evolutionaire als op grotere evolutionaire schaal. Experimenten met exogene JA-toepassing die defecten in de JA-biosynthese omzeilen, laten verder zien dat nauw verwante tabakssoorten kunnen worden onderscheiden in signaalgevoelige en signaal-niet-signaalgevoelige soorten, net zoals hun wijze van JA- en metaboloomplasticiteit die door herbivoren wordt geïnduceerd. Soorten die niet reageren op signalen kunnen niet reageren omdat ze geen endogeen JA kunnen produceren en zijn daarom onderhevig aan fysiologische beperkingen. Dit kan worden veroorzaakt door mutaties in enkele belangrijke genen in de JA-signaalroute (AOS en JAR4 in N. crescens). Dit resultaat benadrukt dat deze macro-evolutionaire patronen tussen soorten voornamelijk kunnen worden veroorzaakt door veranderingen in de interne hormoonperceptie en -responsiviteit.
Naast de interactie tussen planten en herbivoren is het onderzoek naar metabolische diversiteit verbonden met alle belangrijke theoretische ontwikkelingen in het onderzoek naar biologische aanpassing aan de omgeving en de evolutie van complexe fenotypische kenmerken. Met de toename van de hoeveelheid data die wordt verkregen met moderne MS-instrumenten, kan hypothesetoetsing over metabolische diversiteit nu verder gaan dan individuele/categorische metabolietverschillen en een globale analyse uitvoeren om onverwachte patronen te onthullen. In het proces van grootschalige analyse is het idee van het ontwerpen van betekenisvolle kaarten die gebruikt kunnen worden om data te verkennen een belangrijke metafoor. Een belangrijk resultaat van de huidige combinatie van onbevooroordeelde MS/MS-metabolomics en informatietheorie is dan ook dat het een eenvoudige maatstaf biedt die gebruikt kan worden om kaarten te construeren waarmee de metabolische diversiteit op verschillende taxonomische schalen in kaart gebracht kan worden. Dit is een fundamentele vereiste voor deze methode. Het onderzoek naar micro/macro-evolutie en gemeenschapsecologie.
Op macro-evolutionair niveau is de kern van de co-evolutietheorie tussen planten en insecten van Ehrlich en Raven (51) de voorspelling dat de variatie in metabolische diversiteit tussen soorten de oorzaak is van de diversificatie van plantengeslachten. In de vijftig jaar sinds de publicatie van dit baanbrekende werk is deze hypothese echter zelden getest (52). Dit komt grotendeels door de fylogenetische kenmerken van vergelijkbare metabolische eigenschappen over grote afstanden tussen plantengeslachten. Deze zeldzaamheid kan worden gebruikt om doelgerichte analysemethoden te verankeren. De huidige MS/MS-workflow, verwerkt door informatietheorie, kwantificeert de MS/MS-structurele gelijkenis van onbekende metabolieten (zonder voorafgaande metabolietenselectie) en zet deze MS/MS-waarden om in een set MS/MS-waarden. Op deze manier worden in professionele metabolismeanalyses deze macro-evolutionaire modellen vergeleken op een classificatieschaal met behulp van eenvoudige statistische indicatoren. Het proces is vergelijkbaar met fylogenetische analyse, waarbij sequentie-uitlijning kan worden gebruikt om de snelheid van diversificatie of karakterevolutie te kwantificeren zonder voorafgaande voorspelling.
Op biochemisch niveau laat de screeninghypothese van Firn en Jones (53) zien dat metabolische diversiteit op verschillende niveaus wordt gehandhaafd om grondstoffen te leveren voor de biologische activiteiten van voorheen niet-verwante of gesubstitueerde metabolieten. Methoden uit de informatietheorie bieden een kader waarin deze metaboliet-specifieke evolutionaire transities die plaatsvinden tijdens metabolietspecialisatie kunnen worden gekwantificeerd als onderdeel van het voorgestelde evolutionaire screeningproces: biologisch actieve adaptatie van lage specificiteit naar hoge specificiteit van geremde metabolieten van een gegeven omgeving.
Al met al werden in de beginjaren van de moleculaire biologie belangrijke theorieën over plantenafweer ontwikkeld, en worden deductieve, hypothesegestuurde methoden algemeen beschouwd als de enige manier om wetenschappelijke vooruitgang te boeken. Dit is grotendeels te wijten aan de technische beperkingen van het meten van het gehele metaboloom. Hoewel hypothesegestuurde methoden bijzonder nuttig zijn bij het kiezen van andere causale mechanismen, is hun vermogen om ons begrip van biochemische netwerken te vergroten beperkter dan de computationele methoden die momenteel beschikbaar zijn in de hedendaagse data-intensieve wetenschap. Daarom liggen theorieën die niet voorspelbaar zijn ver buiten het bereik van de beschikbare data, waardoor de hypothetische formule/test-cyclus van vooruitgang in het onderzoeksveld niet kan worden afgeschaft (4). We verwachten dat de hier geïntroduceerde computationele workflow van metabolomics de interesse in de recente (hoe) en uiteindelijke (waarom) vraagstukken van metabolische diversiteit kan aanwakkeren en kan bijdragen aan een nieuw tijdperk van theoretisch gestuurde datawetenschap. In dit tijdperk worden de belangrijke theorieën die eerdere generaties inspireerden opnieuw onder de loep genomen.
Directe voeding door herbivoren wordt uitgevoerd door een larve in het tweede stadium (Sl-larve) te kweken op een enkel blad van een lichtgekleurde bekerplant van een bloeiende rozenplant, met 10 herhalingen per plant. De insectenlarven werden vastgeklemd met klemmen en het resterende bladweefsel werd 24 en 72 uur na infectie verzameld en snel ingevroren, waarna de metabolieten werden geëxtraheerd.
Simuleer de behandeling van herbivoren op een zeer gesynchroniseerde manier. De methode is om met behulp van stoffen patroonwielen drie rijen doornen aan elke kant van de hoofdnerf van de drie volledig ontwikkelde bladeren van de plant te doorboren tijdens het groeistadium van de stoffen slinger, en onmiddellijk 1:5 verdunde Ms. aan te brengen. Of gebruik gehandschoende vingers om S1 OS in de prikwond in te brengen. Oogst en verwerk een blad zoals hierboven beschreven. Gebruik de eerder beschreven methode om primaire metabolieten en plantenhormonen te extraheren (54).
Voor de exogene JA-toepassingen werden de drie bladstelen van elk van de zes bloeiende rozenplanten van elke soort behandeld met 20 μl lanolinepasta met 150 μg MeJA (Lan + MeJA), en 20 μl lanoline plus wondbehandeling (Lan + W), of werd 20 μl pure lanoline als controle gebruikt. De bladeren werden 72 uur na de behandeling geoogst, direct ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C tot gebruik.
In onze onderzoeksgroep zijn vier transgene JA- en ET-lijnen geïdentificeerd, namelijk irAOC (36), irCOI1 (55), irACO en sETR1 (48). irAOC vertoonde een sterke afname van de JA- en JA-Ile-niveaus, terwijl irCOI1 niet gevoelig was voor JA's. In vergelijking met EV nam de JA-Ile-accumulatie toe. Op dezelfde manier zal irACO de productie van ET verminderen, en in vergelijking met EV zal sETR1, dat ongevoelig is voor ET, de productie van ET verhogen.
Een fotoakoestische laserspectrometer (Sensor Sense ETD-300 real-time ET-sensor) wordt gebruikt om niet-invasief ET-metingen uit te voeren. Direct na de behandeling werd de helft van de bladeren afgesneden en overgebracht naar een afgesloten glazen flesje van 4 ml, waarna de gasfase zich gedurende 5 uur kon ophopen. Tijdens de meting werd elk flesje gedurende 8 minuten gespoeld met een stroom van 2 liter/uur zuivere lucht, die vooraf door een door Sensor Sense geleverde katalysator was geleid om CO2 en water te verwijderen.
De microarray-gegevens werden oorspronkelijk gepubliceerd in (35) en opgeslagen in de Gene Expression Comprehensive Database van het National Center for Biotechnology Information (NCBI) (toegangsnummer GSE30287). Voor dit onderzoek werden de gegevens van de bladeren die werden aangetast door de W + OSMs-behandeling en de onbeschadigde controlebladeren geëxtraheerd. De ruwe intensiteit is log2. Vóór de statistische analyse werd de baseline omgerekend en genormaliseerd naar het 75e percentiel met behulp van het R-softwarepakket.
De originele RNA-sequencing (RNA-seq) data van Nicotiana-soorten werden opgehaald uit de NCBI Short Reading Archives (SRA), projectnummer PRJNA301787, zoals gerapporteerd door Zhou et al. (39) en verder verwerkt zoals beschreven in (56). De ruwe data verwerkt door W + W, W + OSM en W + OSS1 die overeenkomen met Nicotiana-soorten werden geselecteerd voor analyse in deze studie en op de volgende manier verwerkt: Eerst werden de ruwe RNA-seq-gegevens geconverteerd naar FASTQ-formaat. HISAT2 converteert FASTQ naar SAM, en SAMtools converteert SAM-bestanden naar gesorteerde BAM-bestanden. StringTie wordt gebruikt om genexpressie te berekenen, waarbij de expressiemethode gebaseerd is op het aantal fragmenten per duizend basen per miljoen gesequenceerde transcriptiefragmenten.
De Acclaim chromatografische kolom (150 mm x 2,1 mm; deeltjesgrootte 2,2 μm) die voor de analyse wordt gebruikt en de 4 mm x 4 mm voorfilterkolom bestaan ​​uit hetzelfde materiaal. Het volgende binaire gradiëntprogramma wordt gebruikt in het Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) systeem: 0 tot 0,5 minuten, isocratisch 90% A [gedemineraliseerd water, 0,1% (v/v) acetonitril en 0,05% mierenzuur], 10% B (acetonitril en 0,05% mierenzuur); 0,5 tot 23,5 minuten, de gradiëntfase is respectievelijk 10% A en 90% B; 23,5 tot 25 minuten, isocratisch 10% A en 90% B. De stroomsnelheid bedraagt ​​400 μl/min. Voor alle MS-analyses wordt het kolomeluens geïnjecteerd in een quadrupool- en time-of-flight (qTOF)-analysator die is uitgerust met een elektrospraybron die werkt in de positieve ionisatiemodus (capillaire spanning, 4500 V; capillaire uitgang 130 V; droogtemperatuur 200 °C; droogluchtstroom 10 liter/min).
Voer een MS/MS-fragmentanalyse uit (hierna MS/MS genoemd) die irrelevant of niet te onderscheiden is van de data om structurele informatie te verkrijgen over het algehele detecteerbare metabolische profiel. Het concept van de indiscriminate MS/MS-methode is gebaseerd op het feit dat de quadrupool een zeer groot massa-isolatievenster heeft [beschouw daarom alle massa-ladingverhouding (m/z) signalen als fragmenten]. Omdat het Impact II-instrument geen CE-kanteling kon creëren, werden daarom verschillende onafhankelijke analyses uitgevoerd met verhoogde botsingsgeïnduceerde dissociatie-botsingsenergie (CE) waarden. Kortom, analyseer eerst het monster met UHPLC-elektrospray-ionisatie/qTOF-MS in de modus voor enkelvoudige massaspectrometrie (lage fragmentatieomstandigheden gegenereerd door in-source fragmentatie), waarbij gescand wordt van m/z 50 tot 1500 met een herhalingsfrequentie van 5 Hz. Gebruik stikstof als botsingsgas voor MS/MS-analyse en voer onafhankelijke metingen uit bij de volgende vier verschillende botsingsgeïnduceerde dissociatiespanningen: 20, 30, 40 en 50 eV. Gedurende het hele meetproces heeft de quadrupool het grootste massa-isolatievenster, van m/z 50 tot 1500. Wanneer de m/z-waarde en isolatiebreedte van het frontlichaam zijn ingesteld op 200, wordt het massabereik automatisch geactiveerd door de instrumentsoftware en ingesteld op 0 Da. Scan op massafragmenten zoals in de modus voor één massa. Gebruik natriumformiaat (50 ml isopropanol, 200 μl mierenzuur en 1 ml 1M NaOH-oplossing) voor massacalibratie. Met behulp van Brukers zeer nauwkeurige calibratiealgoritme wordt het databestand gekalibreerd na het berekenen van het gemiddelde spectrum over een bepaalde tijdsperiode. Gebruik de exportfunctie van de Data Analysis v4.0-software (Brook Dalton, Bremen, Duitsland) om de ruwe databestanden naar NetCDF-formaat te converteren. De MS/MS-dataset is opgeslagen in de open metabolomics-database MetaboLights (www.ebi.ac.uk) onder toegangsnummer MTBLS1471.
MS/MS-assemblage kan worden gerealiseerd door correlatieanalyse tussen MS1- en MS/MS-kwaliteitssignalen voor lage en hoge botsingsenergie en nieuw geïmplementeerde regels. Het R-script wordt gebruikt om de correlatieanalyse van de verdeling van de precursor naar het product uit te voeren, en het C#-script (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) wordt gebruikt om de regels te implementeren.
Om valse positieven als gevolg van achtergrondruis en valse correlaties door het detecteren van bepaalde m/z-kenmerken in slechts enkele monsters te verminderen, gebruiken we de functie "gevulde piek" van het R-pakket XCMS (voor achtergrondruiscorrectie). Deze functie moet worden gebruikt om de intensiteit van "NA" (niet-gedetecteerde pieken) te vervangen. Wanneer de functie "gevulde piek" wordt gebruikt, blijven er nog steeds veel intensiteitswaarden van "0" in de dataset aanwezig die de correlatieberekening beïnvloeden. Vervolgens vergelijken we de resultaten van de gegevensverwerking met en zonder de functie "gevulde piek". Op basis van de gemiddelde gecorrigeerde geschatte achtergrondruis berekenen we de achtergrondruiswaarde en vervangen we deze intensiteitswaarden van "0" door de berekende achtergrondwaarde. We beschouwen alleen kenmerken waarvan de intensiteit driemaal hoger is dan de achtergrondwaarde als "echte pieken". Voor de PCC-berekeningen worden alleen de m/z-signalen van de precursor (MS1) en fragmentdatasets met ten minste acht echte pieken meegenomen.
Als de intensiteit van het precursor-kwaliteitskenmerk in het gehele monster significant gecorreleerd is met de verminderde intensiteit van hetzelfde kwaliteitskenmerk dat wordt blootgesteld aan lage of hoge botsingsenergie, en het kenmerk niet door CAMERA als isotopenpiek wordt gelabeld, kan het verder worden gedefinieerd. Vervolgens wordt de correlatieanalyse uitgevoerd door alle mogelijke precursor-productparen binnen 3 seconden (het geschatte retentietijdvenster voor piekretentie) te berekenen. Alleen wanneer de m/z-waarde lager is dan de precursorwaarde en MS/MS-fragmentatie plaatsvindt op dezelfde locatie in de dataset als de precursor waaruit deze is afgeleid, wordt het als een fragment beschouwd.
Op basis van deze twee eenvoudige regels sluiten we de gespecificeerde fragmenten uit met m/z-waarden die groter zijn dan de m/z-waarde van de geïdentificeerde precursor, en op basis van de positie in het monster waar de precursor verschijnt en het gespecificeerde fragment. Het is ook mogelijk om de kwaliteitskenmerken die gegenereerd worden door vele in-source fragmenten in MS1-modus te selecteren als kandidaat-precursors, waardoor redundante MS/MS-verbindingen ontstaan. Om deze dataredundantie te verminderen, zullen we de spectra samenvoegen als de NDP-gelijkenis van de spectra groter is dan 0,6 en ze behoren tot de chromatogramgroep "pcgroup" die door CAMERA is geannoteerd. Ten slotte voegen we alle vier CE-resultaten die geassocieerd zijn met de precursor en fragmenten samen tot het uiteindelijke gedeconvolueerde composietspectrum door de piek met de hoogste intensiteit te selecteren uit alle kandidaatpieken met dezelfde m/z-waarde bij verschillende botsingsenergieën. De daaropvolgende verwerkingsstappen zijn gebaseerd op het concept van het composietspectrum en houden rekening met de verschillende CE-condities die nodig zijn om de fragmentatiekans te maximaliseren, omdat sommige fragmenten alleen onder een specifieke botsingsenergie kunnen worden gedetecteerd.
RDPI (30) werd gebruikt om de induceerbaarheid van het metabolische profiel te berekenen. De diversiteit van het metabolische spectrum (Hj-index) wordt afgeleid van de abundantie van MS/MS-precursoren met behulp van de Shannon-entropie van de MS/MS-frequentieverdeling met behulp van de volgende vergelijking beschreven door Martínez et al. (8): Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), waarbij Pij overeenkomt met de relatieve frequentie van de i-de MS/MS in het j-de monster (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolische specificiteit (Si-index) wordt gedefinieerd als de expressie-identiteit van een gegeven MS/MS in relatie tot de frequentie tussen de beschouwde monsters. MS/MS-specificiteit wordt berekend als Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Gebruik de volgende formule om de metaboloomspecifieke δj-index van elk j-monster te meten, en het gemiddelde van de MS/MS-specificiteit δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spectra worden paarsgewijs uitgelijnd en de gelijkenis wordt berekend op basis van de twee scores. Eerst wordt met behulp van de standaard NDP (ook bekend als de cosinuscorrelatiemethode) de volgende vergelijking gebruikt om de segmentgelijkenis tussen spectra te scoren: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, waarbij S1 en S2 corresponderend zijn. Voor spectrum 1 en spectrum 2, en voor WS1, i en WS2, i, vertegenwoordigt i het gewicht op basis van de piekintensiteit waarbij het verschil van de i-de gemeenschappelijke piek tussen de twee spectra kleiner is dan 0,01 Da. Het gewicht wordt als volgt berekend: W = [piekintensiteit] m [kwaliteit] n, m = 0,5, n = 2, zoals voorgesteld door MassBank.
Er werd een tweede scoringsmethode geïmplementeerd, waarbij de gedeelde NL tussen MS/MS werd geanalyseerd. Hiervoor gebruikten we de 52 NL-lijsten die frequent voorkomen tijdens het MS-fragmentatieproces, en de meer specifieke NL (gegevensbestand S1) die eerder is geannoteerd voor het MS/MS-spectrum van de secundaire metabolieten van de verzwakte Nepenthes-soorten (9, 26). Voor elke MS/MS werd een binaire vector van 1 en 0 aangemaakt, die respectievelijk de aanwezigheid en afwezigheid van bepaalde NL aangeeft. Op basis van de gelijkenis in Euclidische afstand werd de NL-gelijkenisscore berekend voor elk paar binaire NL-vectoren.
Om dubbele clustering uit te voeren, gebruikten we het R-pakket DiffCoEx, dat gebaseerd is op een uitbreiding van Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Met behulp van de NDP- en NL-scorematrices van MS/MS-spectra berekenden we met DiffCoEx de vergelijkende correlatiematrix. Binaire clustering wordt uitgevoerd door de parameter “cutreeDynamic” in te stellen op method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T en minClusterSize = 10. De R-broncode van DiffCoEx werd gedownload uit aanvullend bestand 1 door Tesson et al. (57); het benodigde R-softwarepakket voor WGCNA is te vinden op https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Om een ​​MS/MS-moleculaire netwerkanalyse uit te voeren, berekenden we de gepaarde spectrale connectiviteit op basis van NDP- en NL-gelijkenistypen en gebruikten we de Cytoscape-software om de netwerktopologie te visualiseren met behulp van een organische lay-out in de CyFilescape yFiles-lay-outalgoritme-extensie.
Gebruik R versie 3.0.1 om statistische analyses op de gegevens uit te voeren. Statistische significantie werd beoordeeld met behulp van een tweeweg-variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de Tukey's honestly significant difference (HSD) post-hoc test. Om het verschil tussen de herbivore behandeling en de controle te analyseren, werd de tweezijdige verdeling van de twee groepen monsters met dezelfde variantie geanalyseerd met behulp van de Student's t-test.
Voor aanvullend materiaal bij dit artikel kunt u terecht op http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Dit is een open access-artikel dat is gepubliceerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License. Deze licentie staat gebruik, verspreiding en reproductie in elk medium toe, zolang het uiteindelijke gebruik niet commercieel is en ervan uitgaat dat het originele werk correct is. Referentie.
Let op: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u de pagina aanbeveelt weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat het geen spam is. We zullen geen e-mailadressen opslaan.
Deze vraag wordt gebruikt om te controleren of u een bezoeker bent en om automatische spaminzendingen te voorkomen.
Informatietheorie biedt een universele maatstaf voor de vergelijking van specifieke metabolomen en de voorspelling van testverdedigingstheorieën.
Informatietheorie biedt een universele maatstaf voor de vergelijking van specifieke metabolomen en de voorspelling van testverdedigingstheorieën.
©2021 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap. alle rechten voorbehouden. AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.