We hebben eerder gerapporteerd dat de serumspiegels van het in de darmen geproduceerde tryptofaanmetaboliet indol-3-propionzuur (IPA) lager zijn bij patiënten met leverfibrose. In deze studie onderzochten we het transcriptoom en het DNA-methyloom in de lever van obese personen in relatie tot de serumspiegels van IPA, evenals de rol van IPA bij het induceren van fenotypische inactivatie van hepatische stellaatcellen (HSC's) in vitro.
De studie omvatte 116 obese patiënten zonder diabetes mellitus type 2 (T2DM) (leeftijd 46,8 ± 9,3 jaar; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) die een bariatrische ingreep ondergingen in het Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). De circulerende IPA-spiegels werden gemeten met vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), de transcriptoomanalyse van de lever werd uitgevoerd door middel van totale RNA-sequencing en de DNA-methyleringsanalyse werd uitgevoerd met behulp van de Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Voor de in vitro experimenten werden humane hepatische stellaatcellen (LX-2) gebruikt.
De serum-IPA-spiegels correleerden met de expressie van genen die betrokken zijn bij apoptose, mitofagische processen en verouderingsprocessen in de lever. Het AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1)-gen was het meest voorkomende en dominante interagerende gen in de transcript- en DNA-methyleringsprofielen van de lever. IPA-behandeling induceerde apoptose, verminderde mitochondriale ademhaling en veranderde de celmorfologie en mitochondriale dynamiek door de expressie te moduleren van genen waarvan bekend is dat ze fibrose, apoptose en overleving van LX-2-cellen reguleren.
Al met al ondersteunen deze gegevens de hypothese dat IPA potentiële therapeutische effecten heeft en apoptose kan induceren en het HSC-fenotype kan verschuiven naar een inactieve toestand. Dit vergroot de mogelijkheid om leverfibrose te remmen door de activering van HSC's en het mitochondriale metabolisme te beïnvloeden.
De prevalentie van obesitas en het metabool syndroom wordt in verband gebracht met een toenemende incidentie van metabool geassocieerde leververvetting (MASLD); deze ziekte treft 25% tot 30% van de algemene bevolking [1]. Het belangrijkste gevolg van de etiologie van MASLD is leverfibrose, een dynamisch proces dat wordt gekenmerkt door de continue accumulatie van vezelige extracellulaire matrix (ECM) [2]. De belangrijkste cellen die betrokken zijn bij leverfibrose zijn hepatische stellaatcellen (HSC's), die vier bekende fenotypen vertonen: rustend, geactiveerd, geïnactiveerd en senescent [3, 4]. HSC's kunnen worden geactiveerd en transdifferentiëren van een rustende vorm naar proliferatieve fibroblastachtige cellen met een hoge energiebehoefte, met een verhoogde expressie van α-gladde spieractine (α-SMA) en collageen type I (Col-I) [5, 6]. Tijdens de omkering van leverfibrose worden geactiveerde HSC's geëlimineerd via apoptose of inactivatie. Deze processen omvatten de downregulatie van fibrogene genen en de modulatie van overlevingsbevorderende genen (zoals de NF-κB- en PI3K/Akt-signaalroutes) [7, 8], evenals veranderingen in de mitochondriale dynamiek en functie [9].
Er is gebleken dat de serumspiegels van het tryptofaanmetaboliet indol-3-propionzuur (IPA), dat in de darm wordt geproduceerd, verlaagd zijn bij menselijke metabole ziekten, waaronder MASLD [10–13]. IPA wordt geassocieerd met de inname van voedingsvezels, staat bekend om zijn antioxiderende en ontstekingsremmende effecten en vermindert het door voeding geïnduceerde niet-alcoholische steatohepatitis (NASH)-fenotype in vivo en in vitro [11–14]. Enkele aanwijzingen hiervoor komen uit ons eerdere onderzoek, waarin werd aangetoond dat de serumspiegels van IPA lager waren bij patiënten met leverfibrose dan bij obese patiënten zonder leverfibrose in de Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Bovendien hebben we aangetoond dat IPA-behandeling de expressie van genen die klassieke markers zijn voor celadhesie, celmigratie en activering van hematopoëtische stamcellen kan verminderen in een model met menselijke hepatische stellaatcellen (LX-2) en dat het een potentieel hepatoprotectief metaboliet is [15]. Het is echter nog steeds onduidelijk hoe IPA de regressie van leverfibrose induceert door de activering van HSC-apoptose en mitochondriale bio-energetica.
In dit onderzoek tonen we aan dat serum-IPA geassocieerd is met de expressie van genen die betrokken zijn bij apoptose, mitofagie en een verhoogde levensduur in de lever van obese personen zonder diabetes type 2 (KOBS). Bovendien ontdekten we dat IPA de klaring en afbraak van geactiveerde hematopoëtische stamcellen (HSC's) kan induceren via het inactivatiepad. Deze resultaten onthullen een nieuwe rol voor IPA, waardoor het een potentieel therapeutisch doelwit is voor het bevorderen van regressie van leverfibrose.
Uit een eerder onderzoek in het KOBS-cohort bleek dat patiënten met leverfibrose lagere circulerende IPA-waarden hadden vergeleken met patiënten zonder leverfibrose [15]. Om het potentiële verstorende effect van diabetes type 2 uit te sluiten, rekruteerden we 116 obese patiënten zonder diabetes type 2 (gemiddelde leeftijd ± SD: 46,8 ± 9,3 jaar; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (Tabel 1) uit de lopende KOBS-studie als onderzoekspopulatie [16]. Alle deelnemers gaven schriftelijk hun toestemming en het studieprotocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Noord-Savo County Hospital in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki (54/2005, 104/2008 en 27/2010).
Leverbiopsieën werden verkregen tijdens bariatrische chirurgie en histologisch beoordeeld door ervaren pathologen volgens eerder beschreven criteria [17, 18]. De beoordelingscriteria zijn samengevat in aanvullende tabel S1 en zijn eerder beschreven [19].
Nuchtere serummonsters werden geanalyseerd met behulp van ongerichte vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) voor metabolomics-analyse (n = 116). De monsters werden geanalyseerd met een UHPLC-qTOF-MS-systeem (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Duitsland) zoals eerder beschreven19. De identificatie van isopropylalcohol (IPA) was gebaseerd op de retentietijd en vergelijking van het MS/MS-spectrum met zuivere standaarden. De signaalintensiteit van IPA (piekoppervlakte) werd in alle verdere analyses meegenomen [20].
RNA-sequencing van de gehele lever werd uitgevoerd met behulp van Illumina HiSeq 2500 en de gegevens werden voorbewerkt zoals eerder beschreven [19, 21, 22]. We voerden een gerichte differentiële expressieanalyse uit van transcripten die de mitochondriale functie/biogenese beïnvloeden met behulp van 1957 genen geselecteerd uit de MitoMiner 4.0-database [23]. DNA-methyleringsanalyse van de lever werd uitgevoerd met behulp van de Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, VS) met dezelfde methodologie als eerder beschreven [24, 25].
Menselijke hepatische stellaatcellen (LX-2) werden vriendelijk ter beschikking gesteld door prof. Stefano Romeo en werden gekweekt en onderhouden in DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Om de werkzame dosis IPA te selecteren, werden LX-2-cellen gedurende 24 uur behandeld met verschillende concentraties IPA (10 μM, 100 μM en 1 mM; Sigma, 220027) in DMEM/F12-medium. Om het vermogen van IPA om HSC's te inactiveren te onderzoeken, werden LX-2-cellen bovendien gedurende 24 uur behandeld met 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) en 1 mM IPA in serumvrij medium. Voor de overeenkomstige voertuigcontroles werd 4 nM HCl met 0,1% BSA gebruikt voor de TGF-β1-behandeling en 0,05% DMSO voor de IPA-behandeling. Beide oplossingen werden samen gebruikt voor de gecombineerde behandeling.
Apoptose werd beoordeeld met behulp van de FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit met 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, VS, Cat# 640922) volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden LX-2-cellen (1 × 10⁵ cellen/well) een nacht gekweekt in 12-wells platen en vervolgens behandeld met meerdere doses IPA of IPA en TGF-β1. De volgende dag werden zwevende en aangehechte cellen verzameld, getrypsineerd, gewassen met PBS, geresuspendeerd in Annexin V-bindingsbuffer en gedurende 15 minuten geïncubeerd met FITC-Annexin V en 7-AAD.
Mitochondriën in levende cellen werden gekleurd voor oxidatieve activiteit met behulp van Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Voor MTR-assays werden LX-2-cellen in gelijke dichtheden geïncubeerd met IPA en TGF-β1. Na 24 uur werden de levende cellen getrypsineerd, gewassen met PBS en vervolgens gedurende 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd met 100 μM MTR in serumvrij medium, zoals eerder beschreven [ 26 ]. Voor de analyse van de morfologie van levende cellen werden de celgrootte en de cytoplasmatische complexiteit geanalyseerd met behulp van respectievelijk de forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) parameters.
Alle gegevens (30.000 gebeurtenissen) werden verzameld met behulp van NovoCyte Quanteon (Agilent) en geanalyseerd met behulp van NovoExpress® 1.4.1 of FlowJo V.10 software.
De zuurstofverbruikssnelheid (OCR) en de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) werden in realtime gemeten met behulp van een Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) uitgerust met een Seahorse XF Cell Mito Stress volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werden 2 × 10⁴ LX-2 cellen/well gezaaid op XF96 celkweekplaten. Na een nacht incubatie werden de cellen behandeld met isopropanol (IPA) en TGF-β1 (Aanvullende methoden 1). De data-analyse werd uitgevoerd met behulp van de Seahorse XF Wave-software, die de Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator bevat. Hieruit werd een Bioenergetische Gezondheidsindex (BHI) berekend [27].
Totale RNA werd getranscribeerd naar cDNA. Zie referentie [15] voor specifieke methoden. De mRNA-niveaus van humaan 60S ribosomaal zuur proteïne P0 (RPLP0) en cyclofiline A1 (PPIA) werden gebruikt als constitutieve gencontroles. Het QuantStudio 6 pro Real-Time PCR-systeem (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederland) werd gebruikt met de TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) of de Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), en de relatieve genexpressievouw werd berekend met behulp van vergelijkende Ct-waardecyclusparameters (ΔΔCt) en de ∆∆Ct-methode. Details van de primers zijn te vinden in de aanvullende tabellen S2 en S3.
Nucleair DNA (ncDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA) werden geëxtraheerd met behulp van de DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) zoals eerder beschreven [28]. De relatieve hoeveelheid mtDNA werd berekend door de verhouding van elk doel-mtDNA-gebied tot het geometrisch gemiddelde van de drie nucleaire DNA-gebieden (mtDNA/ncDNA) te berekenen, zoals gedetailleerd beschreven in Aanvullende Methoden 2. Details van de primers voor mtDNA en ncDNA zijn te vinden in Aanvullende Tabel S4.
Levende cellen werden gekleurd met Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) om intercellulaire en intracellulaire mitochondriale netwerken te visualiseren. LX-2-cellen (1 × 10⁴ cellen/well) werden gekweekt op glazen objectglaasjes in bijbehorende kweekplaten met glazen bodem (Ibidi GmbH, Martinsried, Duitsland). Na 24 uur werden levende LX-2-cellen gedurende 20 minuten bij 37 °C geïncubeerd met 100 μM MTR en werden de celkernen gekleurd met DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) zoals eerder beschreven [29]. Mitochondriale netwerken werden gevisualiseerd met behulp van een Zeiss Axio Observer omgekeerde microscoop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Duitsland), uitgerust met een Zeiss LSM 800 confocale module, bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 en een 63×NA 1.3 objectief. We hebben tien Z-serie beelden per monstertype verkregen. Elke Z-serie bevat 30 secties, elk met een dikte van 9,86 μm. Voor elk monster werden beelden van tien verschillende gezichtsvelden verkregen met behulp van ZEN 2009 software (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Duitsland), en de mitochondriale morfologieanalyse werd uitgevoerd met ImageJ software (v1.54d) [30, 31] volgens de parameters die gedetailleerd zijn beschreven in Aanvullende Methoden 3.
De cellen werden gefixeerd met 2% glutaraldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, gevolgd door fixatie met een 1% osmiumtetroxide-oplossing (Sigma Aldrich, MO, VS), geleidelijk gedehydrateerd met aceton (Merck, Darmstadt, Duitsland) en ten slotte ingebed in epoxyhars. Ultradunne coupes werden gemaakt en gekleurd met 1% uranylacetaat (Merck, Darmstadt, Duitsland) en 1% loodcitraat (Merck, Darmstadt, Duitsland). Ultrastructurele beelden werden verkregen met behulp van een JEM 2100F EXII transmissie-elektronenmicroscoop (JEOL Ltd, Tokio, Japan) bij een versnellingsspanning van 80 kV.
De morfologie van LX-2-cellen die 24 uur met IPA waren behandeld, werd geanalyseerd met behulp van fasecontrastmicroscopie bij een vergroting van 50x met een omgekeerde lichtmicroscoop van Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 en AxioCam MRm, Jena, Duitsland).
Klinische gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie of mediaan (interkwartielbereik: IQR). Eenrichtingsvariantieanalyse (continue variabelen) of de χ²-toets (categorische variabelen) werd gebruikt om verschillen tussen de drie studiegroepen te vergelijken. De vals-positieve ratio (FDR) werd gebruikt om te corrigeren voor meervoudige testen, en genen met een FDR < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd. Spearman-correlatieanalyse werd gebruikt om CpG-DNA-methylering te correleren met de IPA-signaalintensiteit, waarbij nominale p-waarden (p < 0,05) werden gerapporteerd.
Pathway-analyse werd uitgevoerd met behulp van een webgebaseerde tool voor genensetanalyse (WebGestalt) voor 268 transcripten (nominale p < 0,01), 119 mitochondria-geassocieerde transcripten (nominale p < 0,05) en 4350 CpGs van de 3093 levertranscripten die geassocieerd waren met circulerende serum-IPA-niveaus. De vrij beschikbare Venny DB-tool (versie 2.1.0) werd gebruikt om overlappende genen te vinden, en StringDB (versie 11.5) werd gebruikt om eiwit-eiwitinteracties te visualiseren.
Voor het LX-2-experiment werden de monsters getest op normaliteit met behulp van de D'Agostino-Pearson-test. De gegevens werden verkregen uit ten minste drie biologische replicaten en onderworpen aan een eenweg-ANOVA met Bonferroni-post-hoc-test. Een p-waarde kleiner dan 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, en het aantal experimenten is in elke figuur aangegeven. Alle analyses en grafieken werden uitgevoerd met behulp van de statistische software GraphPad Prism 8 voor Windows (GraphPad Software Inc., versie 8.4.3, San Diego, VS).
Allereerst onderzochten we de associatie tussen serum-IPA-niveaus en transcripten in de lever, het hele lichaam en de mitochondriën. In het totale transcriptprofiel was het gen met de sterkste associatie met serum-IPA-niveaus MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogeen-geactiveerde proteïnekinase-geactiveerde proteïnekinase 3); in het mitochondria-gerelateerde transcriptprofiel was het gen met de sterkste associatie AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Aanvullend bestand 1 en Aanvullend bestand 2).
Vervolgens analyseerden we globale transcripten (n = 268; p < 0,01) en mitochondria-geassocieerde transcripten (n = 119; p < 0,05), waarbij we uiteindelijk apoptose identificeerden als de meest significante canonieke route (p = 0,0089). Voor mitochondriale transcripten geassocieerd met serum IPA-niveaus richtten we ons op apoptose (FDR = 0,00001), mitofagie (FDR = 0,00029) en TNF-signaleringsroutes (FDR = 0,000006) (Figuur 1A, Tabel 2 en Aanvullende figuren 1A-B).
Overlappende analyse van globale, mitochondria-geassocieerde transcripten en DNA-methylering in de menselijke lever in verband met serum-IPA-niveaus. A vertegenwoordigt 268 globale transcripten, 119 mitochondria-geassocieerde transcripten en DNA-gemethyleerde transcripten die zijn gekoppeld aan 3092 CpG-sites die geassocieerd zijn met serum-IPA-niveaus (p-waarden < 0,01 voor globale transcripten en DNA-methylering, en p-waarden < 0,05 voor mitochondriale transcripten). De belangrijkste overlappende transcripten worden in het midden weergegeven (AKT1 en YKT6). B De interactiekaart van de 13 genen met de hoogste interactiescore (0,900) met andere genen werd geconstrueerd uit de 56 overlappende genen (zwarte lijn) die significant geassocieerd waren met serum-IPA-niveaus met behulp van de online tool StringDB. Groen: Genen gekoppeld aan de Gene Ontology (GO) cellulaire component: mitochondriën (GO:0005739). AKT1 is het eiwit met de hoogste score (0,900) voor interacties met andere eiwitten op basis van de gegevens (gebaseerd op tekstmining, experimenten, databases en co-expressie). Netwerkknooppunten representeren eiwitten en randen representeren verbindingen tussen eiwitten.
Omdat metabolieten van de darmmicrobiota de epigenetische samenstelling kunnen reguleren via DNA-methylering [32], onderzochten we of serum-IPA-niveaus geassocieerd waren met DNA-methylering in de lever. We ontdekten dat de twee belangrijkste methyleringsplaatsen die geassocieerd waren met serum-IPA-niveaus zich bevonden in de buurt van proline-serine-rijke regio 3 (C19orf55) en heat shock protein family B (small) member 6 (HSPB6) (Aanvullend bestand 3). DNA-methylering van 4350 CpG (p < 0,01) was gecorreleerd met serum-IPA-niveaus en was verrijkt in regulatiepaden voor een langere levensduur (p = 0,006) (Figuur 1A, Tabel 2 en Aanvullende Figuur 1C).
Om de biologische mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de verbanden tussen serum-IPA-niveaus, globale transcripten, mitochondria-geassocieerde transcripten en DNA-methylering in de menselijke lever, hebben we een overlapanalyse uitgevoerd van de genen die in de eerdere pathway-analyse zijn geïdentificeerd (Figuur 1A). De resultaten van de pathway-verrijkingsanalyse van de 56 overlappende genen (binnen de zwarte lijn in Figuur 1A) toonden aan dat de apoptose-pathway (p = 0,00029) twee genen benadrukte die in de drie analyses voorkwamen: AKT1 en YKT6 (YKT6 v-SNARE-homoloog), zoals weergegeven in het Venn-diagram (Aanvullende figuur 2 en Figuur 1A). Interessant genoeg vonden we dat AKT1 (cg19831386) en YKT6 (cg24161647) positief gecorreleerd waren met serum-IPA-niveaus (Aanvullend bestand 3). Om potentiële eiwitinteracties tussen genproducten te identificeren, selecteerden we 13 genen met de hoogste score voor gemeenschappelijke regio's (0,900) uit 56 overlappende genen als input en construeerden we een interactiekaart. Op basis van het betrouwbaarheidsniveau (marginale betrouwbaarheid) stond het AKT1-gen met de hoogste score (0,900) bovenaan (Figuur 1B).
Op basis van de pathway-analyse vonden we dat apoptose de belangrijkste pathway was. Daarom onderzochten we of IPA-behandeling de apoptose van HSC's in vitro zou beïnvloeden. We hebben eerder aangetoond dat verschillende doses IPA (10 μM, 100 μM en 1 mM) niet toxisch waren voor LX-2-cellen [15]. Deze studie toonde aan dat IPA-behandeling met 10 μM en 100 μM het aantal levensvatbare en necrotische cellen verhoogde. In vergelijking met de controlegroep nam de cellevensvatbaarheid echter af bij een IPA-concentratie van 1 mM, terwijl de mate van celnecrose onveranderd bleef (Figuur 2A, B). Vervolgens testten we, om de optimale concentratie te vinden om apoptose in LX-2-cellen te induceren, 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA gedurende 24 uur (Figuur 2A-E en Aanvullende Figuur 3A-B). Interessant genoeg verlaagden IPA 10 μM en 100 μM de apoptosefrequentie (%), terwijl IPA 1 mM de late apoptose en de apoptosefrequentie (%) verhoogde in vergelijking met de controle en daarom werd gekozen voor verdere experimenten (Figuren 2A–D).
IPA induceert apoptose van LX-2-cellen. De annexine V- en 7-AAD-dubbelkleuringsmethode werd gebruikt om de apoptosefrequentie en celmorfologie te kwantificeren met behulp van flowcytometrie. BA-cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd met 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA of met F–H TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrij medium gedurende 24 uur. A: levende cellen (Annexine V -/ 7AAD-); B: necrotische cellen (Annexine V -/ 7AAD+); C, F: vroege apoptose (Annexine V +/ 7AAD-); D, G: late apoptose (Annexine V+/7AAD+); E, H: percentage van het totale aantal vroege en late apoptotische cellen in de apoptosefrequentie (%). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 3 onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-ANOVA met Bonferroni-post-hoctoets. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Zoals we eerder hebben aangetoond, kan 5 ng/ml TGF-β1 de activering van HSC's induceren door de expressie van klassieke markergenen te verhogen [15]. LX-2-cellen werden behandeld met een combinatie van 5 ng/ml TGF-β1 en 1 mM IPA (Fig. 2E–H). Behandeling met TGF-β1 veranderde de apoptosesnelheid niet, maar co-behandeling met IPA verhoogde de late apoptose en het apoptosepercentage (%) in vergelijking met behandeling met TGF-β1 (Fig. 2E–H). Deze resultaten geven aan dat 1 mM IPA apoptose in LX-2-cellen kan bevorderen, onafhankelijk van de inductie door TGF-β1.
We hebben het effect van IPA op de mitochondriale ademhaling in LX-2-cellen verder onderzocht. De resultaten toonden aan dat 1 mM IPA de parameters van de zuurstofverbruikssnelheid (OCR) verlaagde: niet-mitochondriale ademhaling, basale en maximale ademhaling, protonlekkage en ATP-productie in vergelijking met de controlegroep (Figuur 3A, B), terwijl de bio-energetische gezondheidsindex (BHI) niet veranderde.
IPA vermindert de mitochondriale ademhaling in LX-2-cellen. De mitochondriale ademhalingscurve (OCR) wordt weergegeven als mitochondriale ademhalingsparameters (niet-mitochondriale ademhaling, basale ademhaling, maximale ademhaling, protonenlekkage, ATP-productie, SRC en BHI). Cellen A en B werden respectievelijk 24 uur geïncubeerd met 10 μM, 100 μM en 1 mM IPA. Cellen C en D werden respectievelijk 24 uur geïncubeerd met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrij medium. Alle metingen werden genormaliseerd ten opzichte van het DNA-gehalte met behulp van de CyQuant-kit. BHI: bio-energetische gezondheidsindex; SRC: respiratoire reservecapaciteit; OCR: zuurstofverbruikssnelheid. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 5 onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-ANOVA en de Bonferroni post-hoc test. *p < 0,05; **p < 0,01; en ***p < 0,001
Om een ​​beter inzicht te krijgen in het effect van IPA op het bio-energetische profiel van TGF-β1-geactiveerde LX-2-cellen, analyseerden we de mitochondriale oxidatieve fosforylatie door middel van OCR (Fig. 3C,D). De resultaten toonden aan dat behandeling met TGF-β1 de maximale respiratie, de respiratoire reservecapaciteit (SRC) en de BHI kon verlagen in vergelijking met de controlegroep (Fig. 3C,D). Bovendien verlaagde de gecombineerde behandeling de basale respiratie, de protonlekkage en de ATP-productie, maar de SRC en BHI waren significant hoger dan bij behandeling met alleen TGF-β1 (Fig. 3C,D).
We hebben ook de "Cellular Energy Phenotype Test" uitgevoerd, aangeboden door de Seahorse-software (aanvullende figuur 4A-D). Zoals weergegeven in aanvullende figuur 3B, namen zowel de OCR- als de ECAR-metabolische potentialen af ​​na behandeling met TGF-β1. Er werd echter geen verschil waargenomen tussen de combinatie- en IPA-behandelingsgroepen en de controlegroep. Bovendien namen zowel de basale als de stressniveaus van OCR af na behandeling met de combinatie en IPA in vergelijking met de controlegroep (aanvullende figuur 4C). Interessant genoeg werd een vergelijkbaar patroon waargenomen bij de combinatietherapie, waarbij geen verandering in de basale en stressniveaus van ECAR werd waargenomen in vergelijking met de behandeling met TGF-β1 (aanvullende figuur 4C). In HSC's veranderde de afname van mitochondriale oxidatieve fosforylatie en het vermogen van de combinatietherapie om SCR en BHI te herstellen na blootstelling aan TGF-β1-behandeling het metabolische potentieel (OCR en ECAR) niet. Al met al wijzen deze resultaten erop dat IPA de bio-energetica in HSC's kan verminderen, wat suggereert dat IPA een lager energieprofiel kan induceren dat het HSC-fenotype verschuift naar inactivatie (aanvullende figuur 4D).
Het effect van IPA op de mitochondriale dynamiek werd onderzocht met behulp van driedimensionale kwantificering van de mitochondriale morfologie en netwerkverbindingen, evenals MTR-kleuring (Figuur 4 en Aanvullende Figuur 5). Figuur 4 laat zien dat, vergeleken met de controlegroep, de TGF-β1-behandeling het gemiddelde oppervlak, het aantal vertakkingen, de totale vertakkingslengte en het aantal vertakkingsknooppunten verlaagde (Figuur 4A en B) en de verhouding van mitochondria veranderde van bolvormig naar intermediair morfologisch (Figuur 4C). Alleen de IPA-behandeling verlaagde het gemiddelde mitochondriale volume en veranderde de verhouding van mitochondria van bolvormig naar intermediair morfologisch vergeleken met de controlegroep (Figuur 4A). Daarentegen bleven de bolvormigheid, de gemiddelde vertakkingslengte en de mitochondriale activiteit, gemeten met behulp van mitochondriaal membraanpotentiaal-afhankelijke MTR (Figuur 4A en E), onveranderd en verschilden deze parameters niet tussen de groepen. Samengevat suggereren deze resultaten dat TGF-β1 en IPA-behandeling de vorm en grootte van mitochondria, evenals de complexiteit van het netwerk, in levende LX-2-cellen lijken te moduleren.
IPA verandert de mitochondriale dynamiek en de hoeveelheid mitochondriaal DNA in LX-2-cellen. A. Representatieve confocale beelden van levende LX-2-cellen geïncubeerd met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA gedurende 24 uur in serumvrij medium, met mitochondriale netwerken gekleurd met Mitotracker™ Red CMXRos en kernen blauw gekleurd met DAPI. Alle datasets bevatten ten minste 15 beelden per groep. We hebben 10 Z-stack beelden per monstertype verkregen. Elke Z-assequentie bevatte 30 plakken, elk met een dikte van 9,86 μm. Schaalbalk: 10 μm. B. Representatieve objecten (alleen mitochondriën) geïdentificeerd door adaptieve drempelwaarde-bepaling toe te passen op het beeld. Kwantitatieve analyse en vergelijking van de morfologische netwerkverbindingen van mitochondriën werden uitgevoerd voor alle cellen in elke groep. C. Frequentie van mitochondriale vormverhoudingen. Waarden dicht bij 0 duiden op bolvormige vormen en waarden dicht bij 1 op draadvormige vormen. D Het mitochondriale DNA (mtDNA)-gehalte werd bepaald zoals beschreven in Materialen en Methoden. E Mitotracker™ Red CMXRos-analyse werd uitgevoerd met behulp van flowcytometrie (30.000 gebeurtenissen) zoals beschreven in Materialen en Methoden. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, n = 3 onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-ANOVA en de Bonferroni post-hoc test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Vervolgens analyseerden we het mtDNA-gehalte in LX-2-cellen als indicator voor het aantal mitochondriën. Vergeleken met de controlegroep was het mtDNA-gehalte verhoogd in de met TGF-β1 behandelde groep (Figuur 4D). Vergeleken met de met TGF-β1 behandelde groep was het mtDNA-gehalte verlaagd in de groep met gecombineerde behandeling (Figuur 4D), wat suggereert dat IPA het mtDNA-gehalte en mogelijk ook het aantal mitochondriën en de mitochondriale ademhaling kan verminderen (Figuur 3C). Bovendien leek IPA het mtDNA-gehalte in de gecombineerde behandeling te verlagen, maar had het geen invloed op de MTR-gemedieerde mitochondriale activiteit (Figuren 4A-C).
We onderzochten de associatie van IPA met de mRNA-niveaus van genen die geassocieerd zijn met fibrose, apoptose, overleving en mitochondriale dynamiek in LX-2-cellen (Figuur 5A–D). In vergelijking met de controlegroep vertoonde de met TGF-β1 behandelde groep een verhoogde expressie van genen zoals collageen type I α2-keten (COL1A2), α-gladde spieractine (αSMA), matrixmetalloproteïnase 2 (MMP2), weefselremmer van metalloproteïnase 1 (TIMP1) en dynamine 1-achtig gen (DRP1), wat wijst op toegenomen fibrose en activering. Verder verlaagde de TGF-β1-behandeling, vergeleken met de controlegroep, de mRNA-niveaus van de nucleaire pregnane X-receptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inhibitor van B-cel α, enhancer van nucleaire factor κ gen licht peptide (NFκB1A) en inhibitor van nucleaire factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Figuur 5A–D). Vergeleken met de TGF-β1-behandeling verlaagde de gecombineerde behandeling met TGF-β1 en IPA de expressie van COL1A2 en MMP2, maar verhoogde de mRNA-niveaus van PXR, TIMP1, B-cellymfoom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β en IKBKB. IPA-behandeling verminderde significant de expressie van MMP2, Bcl-2-geassocieerd proteïne X (BAX), AKT1, optisch atrofie-proteïne 1 (OPA1) en mitochondriaal fusie-proteïne 2 (MFN2), terwijl de expressie van CASP8, NFκB1A, NFκB1B en IKBKB toenam in vergelijking met de controlegroep. Er werd echter geen verschil gevonden in de expressie van caspase-3 (CASP3), apoptotische peptidase-activerende factor 1 (APAF1), mitochondriaal fusie-proteïne 1 (MFN1) en splijtingsproteïne 1 (FIS1). Deze resultaten suggereren gezamenlijk dat IPA-behandeling de expressie moduleert van genen die geassocieerd zijn met fibrose, apoptose, overleving en mitochondriale dynamiek. Onze gegevens suggereren dat IPA-behandeling fibrose in LX-2-cellen vermindert en tegelijkertijd de overleving stimuleert door het fenotype te verschuiven naar inactivatie.
IPA moduleert de expressie van genen die betrokken zijn bij fibroblasten, apoptose, celoverleving en mitochondriale dynamiek in LX-2-cellen. Histogrammen tonen de mRNA-expressie ten opzichte van de endogene controle (RPLP0 of PPIA) nadat LX-2-cellen gedurende 24 uur in serumvrij medium werden geïnduceerd met TGF-β1 en IPA. A staat voor fibroblasten, B voor apoptotische cellen, C voor overlevende cellen en D voor genexpressie die betrokken is bij mitochondriale dynamiek. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 3 onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-ANOVA en de Bonferroni post-hoc test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Vervolgens werden veranderingen in celgrootte (FSC-H) en cytoplasmatische complexiteit (SSC-H) beoordeeld met behulp van flowcytometrie (Figuur 6A,B), en werden veranderingen in celmorfologie na IPA-behandeling beoordeeld met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en fasecontrastmicroscopie (Aanvullende figuur 6A-B). Zoals verwacht namen de cellen in de met TGF-β1 behandelde groep in grootte toe in vergelijking met de controlegroep (Figuur 6A,B), wat de klassieke expansie van ruw endoplasmatisch reticulum (ER*) en fagolysosomen (P) liet zien, wat duidt op activering van hematopoëtische stamcellen (HSC) (Aanvullende figuur 6A). In vergelijking met de met TGF-β1 behandelde groep waren de celgrootte, cytoplasmatische complexiteit (Fig. 6A,B) en het ER*-gehalte echter afgenomen in de groep die behandeld werd met de combinatie van TGF-β1 en IPA (Aanvullende figuur 6A). Bovendien verminderde de IPA-behandeling de celgrootte, de cytoplasmatische complexiteit (figuren 6A,B), het P- en ER*-gehalte (aanvullende figuur 6A) in vergelijking met de controlegroep. Daarnaast nam het aantal apoptotische cellen toe na 24 uur IPA-behandeling in vergelijking met de controlegroep (witte pijlen, aanvullende figuur 6B). Samengevat suggereren deze resultaten dat 1 mM IPA de apoptose van HSC's kan stimuleren en de door TGF-β1 geïnduceerde veranderingen in celmorfologische parameters kan omkeren, waardoor de celgrootte en -complexiteit worden gereguleerd, wat mogelijk verband houdt met de inactivatie van HSC's.
IPA verandert de celgrootte en cytoplasmatische complexiteit in LX-2-cellen. Representatieve afbeeldingen van flowcytometrie-analyse. De analyse maakte gebruik van een gatingstrategie specifiek voor LX-2-cellen: SSC-A/FSC-A om de celpopulatie te definiëren, FSC-H/FSC-A om dubbele cellen te identificeren en SSC-H/FSC-H voor analyse van celgrootte en cytoplasmatische complexiteit. Cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd met TGF-β1 (5 ng/ml) en 1 mM IPA in serumvrij medium. LX-2-cellen werden verdeeld over het linkeronderkwadrant (SSC-H-/FSC-H-), het linkerbovenkwadrant (SSC-H+/FSC-H-), het rechteronderkwadrant (SSC-H-/FSC-H+) en het rechterbovenkwadrant (SSC-H+/FSC-H+) voor analyse van celgrootte en cytoplasmatische complexiteit. B. De celmorfologie werd geanalyseerd met behulp van flowcytometrie met FSC-H (voorwaartse verstrooiing, celgrootte) en SSC-H (zijwaartse verstrooiing, cytoplasmatische complexiteit) (30.000 gebeurtenissen). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 3 onafhankelijke experimenten. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA en de Bonferroni post-hoc test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 en ****p < 0,0001
Darmmetabolieten zoals IPA zijn een populair onderzoeksonderwerp geworden, wat suggereert dat er mogelijk nieuwe doelwitten in de darmmicrobiota ontdekt kunnen worden. Het is daarom interessant dat IPA, een metaboliet die we in verband hebben gebracht met leverfibrose bij mensen [15], een potentieel antifibrotisch middel is gebleken in diermodellen [13, 14]. Hier tonen we voor het eerst een verband aan tussen serum-IPA en globale levertranscriptomics en DNA-methylatie bij obese personen zonder type 2 diabetes (T2D), waarbij apoptose, mitofagie en levensduur worden benadrukt, evenals een mogelijk kandidaatgen, AKT1, dat de leverhomeostase reguleert. Een andere noviteit van ons onderzoek is dat we de interactie van IPA-behandeling met apoptose, celmorfologie, mitochondriale bio-energetica en dynamiek in LX-2-cellen hebben aangetoond, wat wijst op een lager energiespectrum dat het HSC-fenotype verschuift naar inactivatie, waardoor IPA een potentiële kandidaat is voor het verbeteren van leverfibrose.
We ontdekten dat apoptose, mitofagie en levensduurverlenging de belangrijkste canonieke pathways waren die verrijkt waren in levergenen geassocieerd met circulerend serum-IPA. Verstoring van het mitochondriale kwaliteitscontrolesysteem (MQC) kan leiden tot mitochondriale disfunctie, mitofagie en apoptose, waardoor het ontstaan ​​van MASLD wordt bevorderd [33, 34]. Daarom kunnen we speculeren dat IPA mogelijk betrokken is bij het handhaven van de celdynamiek en mitochondriale integriteit via apoptose, mitofagie en levensduurverlenging in de lever. Onze gegevens toonden aan dat twee genen gemeenschappelijk waren in de drie assays: YKT6 en AKT1. Het is belangrijk op te merken dat YKT6 een SNARE-eiwit is dat betrokken is bij het proces van celmembraanfusie. Het speelt een rol in autofagie en mitofagie door een initiatiecomplex te vormen met STX17 en SNAP29 op het autofagosoom, waardoor de fusie van autofagosomen en lysosomen wordt bevorderd [35]. Bovendien leidt verlies van YKT6-functie tot een verminderde mitofagie[36], terwijl opregulatie van YKT6 geassocieerd wordt met de progressie van hepatocellulair carcinoom (HCC), wat wijst op een verhoogde celoverleving[37]. Aan de andere kant is AKT1 het belangrijkste interagerende gen en speelt het een belangrijke rol bij leverziekten, waaronder de PI3K/AKT-signaleringsroute, de celcyclus, celmigratie, proliferatie, focale adhesie, mitochondriale functie en collageensecretie[38-40]. Een geactiveerde PI3K/AKT-signaleringsroute kan hematopoëtische stamcellen (HSC's) activeren, de cellen die verantwoordelijk zijn voor de productie van de extracellulaire matrix (ECM), en de ontregeling ervan kan bijdragen aan het ontstaan ​​en de progressie van leverfibrose[40]. Daarnaast is AKT een van de belangrijkste celoverlevingsfactoren die p53-afhankelijke celapoptose remt, en AKT-activering kan geassocieerd worden met de remming van levercelapoptose[41, 42]. De verkregen resultaten suggereren dat IPA mogelijk betrokken is bij mitochondriale apoptose in de lever door de beslissing van hepatocyten tussen apoptose en overleving te beïnvloeden. Deze effecten zouden gereguleerd kunnen worden door de kandidaatgenen AKT en/of YKT6, die cruciaal zijn voor de leverhomeostase.
Onze resultaten toonden aan dat 1 mM IPA apoptose induceerde en de mitochondriale ademhaling in LX-2-cellen verminderde, onafhankelijk van TGF-β1-behandeling. Het is opmerkelijk dat apoptose een belangrijke route is voor de resolutie van fibrose en de activering van hematopoëtische stamcellen (HSC's), en tevens een sleutelgebeurtenis is in de omkeerbare fysiologische respons van leverfibrose [4, 43]. Bovendien gaf het herstel van BHI in LX-2-cellen na gecombineerde behandeling nieuwe inzichten in de potentiële rol van IPA bij de regulatie van mitochondriale bio-energetica. Onder rustende en inactieve omstandigheden gebruiken hematopoëtische cellen normaal gesproken mitochondriale oxidatieve fosforylatie om ATP te produceren en hebben ze een lage metabolische activiteit. Aan de andere kant verhoogt de activering van HSC's de mitochondriale ademhaling en biosynthese om te compenseren voor de energiebehoefte van het overgaan naar de glycolytische toestand [44]. Het feit dat IPA geen invloed had op het metabolische potentieel en ECAR suggereert dat de glycolytische route minder prioriteit heeft. Op vergelijkbare wijze toonde een andere studie aan dat 1 mM IPA de activiteit van de mitochondriale ademhalingsketen kon moduleren in cardiomyocyten, de humane hepatocytcellijn (Huh7) en humane navelstrengendotheelcellen (HUVEC). Er werd echter geen effect van IPA op de glycolyse in cardiomyocyten gevonden, wat suggereert dat IPA de bio-energetica van andere celtypen kan beïnvloeden [45]. Daarom speculeren we dat 1 mM IPA als een milde chemische ontkoppelaar kan fungeren, aangezien het de expressie van fibrogene genen, de celmorfologie en de mitochondriale bio-energetica significant kan verminderen zonder de hoeveelheid mtDNA te veranderen [46]. Mitochondriale ontkoppelaars kunnen door kweek geïnduceerde fibrose en HSC-activering remmen [47] en de mitochondriale ATP-productie verminderen die wordt gereguleerd of geïnduceerd door bepaalde eiwitten zoals ontkoppelingsproteïnen (UCP) of adeninenucleotide-translocase (ANT). Afhankelijk van het celtype kan dit fenomeen cellen beschermen tegen apoptose en/of apoptose bevorderen [46]. Er zijn echter verdere studies nodig om de rol van IPA als mitochondriale ontkoppelaar bij de inactivatie van hematopoëtische stamcellen op te helderen.
Vervolgens onderzochten we of de veranderingen in de mitochondriale ademhaling worden weerspiegeld in de mitochondriale morfologie in levende LX-2-cellen. Interessant genoeg verandert de behandeling met TGF-β1 de verhouding van mitochondriën van bolvormig naar intermediair, met een afname van de mitochondriale vertakkingen en een toename van de expressie van DRP1, een sleutelfactor bij mitochondriale splitsing [48]. Bovendien is mitochondriale fragmentatie geassocieerd met de algehele complexiteit van het netwerk, en is de overgang van fusie naar splitsing cruciaal voor de activering van hematopoëtische stamcellen (HSC's), terwijl remming van mitochondriale splitsing leidt tot apoptose van HSC's [49]. Onze resultaten wijzen er dus op dat de behandeling met TGF-β1 een afname van de complexiteit van het mitochondriale netwerk kan veroorzaken met een afname van de vertakkingen, wat vaker voorkomt bij mitochondriale splitsing in geactiveerde hematopoëtische stamcellen (HSC's). Verder toonden onze gegevens aan dat IPA de verhouding van mitochondriën van bolvormig naar intermediair kan veranderen, waardoor de expressie van OPA1 en MFN2 afneemt. Uit onderzoek is gebleken dat downregulatie van OPA1 een afname van het mitochondriale membraanpotentiaal kan veroorzaken en celapoptose kan triggeren[50]. Van MFN2 is bekend dat het mitochondriale fusie en apoptose medieert[51]. De verkregen resultaten suggereren dat inductie van LX-2-cellen door TGF-β1 en/of IPA de vorm en grootte van mitochondriën, evenals de activatiestatus en de complexiteit van het netwerk, lijkt te moduleren.
Onze resultaten tonen aan dat de gecombineerde behandeling met TGFβ-1 en IPA de mtDNA- en celmorfologische parameters kan verlagen door de mRNA-expressie van genen die betrokken zijn bij fibrose, apoptose en overleving in apoptose-ontwijkende cellen te reguleren. IPA verlaagde inderdaad het mRNA-expressieniveau van AKT1 en belangrijke fibrosegenen zoals COL1A2 en MMP2, maar verhoogde het expressieniveau van CASP8, dat geassocieerd is met apoptose. Onze resultaten lieten zien dat na behandeling met IPA de BAX-expressie afnam en de mRNA-expressie van TIMP1-familie-subeenheden, BCL-2 en NF-κB toenam, wat suggereert dat IPA overlevingssignalen kan stimuleren in hematopoëtische stamcellen (HSC's) die apoptose ontwijken. Deze moleculen kunnen fungeren als overlevingssignalen in geactiveerde hematopoëtische stamcellen, wat mogelijk verband houdt met een verhoogde expressie van anti-apoptotische eiwitten (zoals Bcl-2), een verlaagde expressie van het pro-apoptotische BAX en een complexe wisselwerking tussen TIMP en NF-κB [5, 7]. IPA oefent zijn effecten uit via PXR, en we ontdekten dat een gecombineerde behandeling met TGF-β1 en IPA de PXR mRNA-expressieniveaus verhoogde, wat duidt op onderdrukking van HSC-activering. Het is bekend dat geactiveerde PXR-signalering de HSC-activering remt, zowel in vivo als in vitro [52, 53]. Onze resultaten suggereren dat IPA mogelijk bijdraagt ​​aan de verwijdering van geactiveerde HSC's door apoptose te bevorderen, fibrose en mitochondriaal metabolisme te verminderen en overlevingssignalen te versterken. Dit zijn typische processen die het geactiveerde HSC-fenotype omzetten in een geïnactiveerd fenotype. Een andere mogelijke verklaring voor het potentiële mechanisme en de rol van IPA bij apoptose is dat het disfunctionele mitochondriën opruimt, voornamelijk via mitofagie (intrinsieke route) en de extrinsieke TNF-signaleringsroute (Tabel 1), die direct gekoppeld is aan de NF-κB-overlevingssignaleringsroute (Aanvullende figuur 7). Interessant is dat IPA-gerelateerde verrijkte genen in staat zijn om pro-apoptotische en pro-overlevingssignalen in de apoptotische route te induceren [54], wat suggereert dat IPA de apoptotische route of overleving kan induceren door interactie met deze genen. Hoe IPA echter apoptose of overleving induceert tijdens HSC-activering en welke mechanismen hierbij een rol spelen, blijft onduidelijk.
IPA is een microbiële metaboliet die wordt gevormd uit tryptofaan uit de voeding via de darmmicrobiota. Studies hebben aangetoond dat het ontstekingsremmende, antioxiderende en epigenetische regulerende eigenschappen heeft in de darmomgeving.[55] Studies hebben aangetoond dat IPA de darmbarrièrefunctie kan moduleren en oxidatieve stress kan verminderen, wat kan bijdragen aan de lokale fysiologische effecten ervan.[56] IPA wordt namelijk via de bloedsomloop naar doelorganen getransporteerd, en aangezien IPA een vergelijkbare structuur heeft als tryptofaan, serotonine en indolderivaten, oefent IPA metabolische effecten uit die leiden tot concurrerende metabolische lotgevallen.[52] IPA kan concurreren met van tryptofaan afgeleide metabolieten om bindingsplaatsen op enzymen of receptoren, waardoor normale metabolische routes mogelijk worden verstoord. Dit benadrukt de noodzaak van verder onderzoek naar de farmacokinetiek en farmacodynamiek ervan om het therapeutische venster beter te begrijpen.[57] Het valt nog te bezien of dit ook kan voorkomen in hematopoëtische stamcellen (HSC's).
We erkennen dat ons onderzoek enkele beperkingen kent. Om specifiek verbanden met IPA te onderzoeken, hebben we patiënten met diabetes mellitus type 2 (T2DM) uitgesloten. We erkennen dat dit de brede toepasbaarheid van onze bevindingen op patiënten met diabetes mellitus type 2 en gevorderde leverziekte beperkt. Hoewel de fysiologische concentratie van IPA in menselijk serum 1–10 μM bedraagt ​​[11, 20], werd een concentratie van 1 mM IPA gekozen op basis van de hoogste niet-toxische concentratie [15] en de hoogste mate van apoptose, zonder verschil in het percentage necrotische cellen. Hoewel in dit onderzoek suprafysiologische niveaus van IPA werden gebruikt, bestaat er momenteel geen consensus over de effectieve dosis IPA [52]. Hoewel onze resultaten significant zijn, blijft het bredere metabolische lot van IPA een actief onderzoeksgebied. Bovendien werden onze bevindingen over het verband tussen serum-IPA-niveaus en DNA-methylering van levertranscripten niet alleen verkregen uit hematopoëtische stamcellen (HSC's), maar ook uit leverweefsel. We kozen ervoor om menselijke LX-2-cellen te gebruiken op basis van onze eerdere bevindingen uit transcriptoomanalyse waaruit bleek dat IPA geassocieerd is met de activering van hematopoëtische stamcellen (HSC's) [15], en HSC's zijn de belangrijkste cellen die betrokken zijn bij de progressie van leverfibrose. De lever bestaat uit meerdere celtypen, dus andere celmodellen, zoals een co-kweeksysteem van hepatocyten, HSC's en immuuncellen in combinatie met caspase-activering en DNA-fragmentatie, evenals het werkingsmechanisme, inclusief het eiwitniveau, zouden overwogen moeten worden om de rol van IPA en de interactie ervan met andere leverceltypen te bestuderen.