Bedankt voor uw bezoek aan nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste ervaring raden we aan de nieuwste browserversie te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de website te blijven ondersteunen, zal deze bovendien geen stijlen of JavaScript bevatten.
Waterstofsulfide (H₂S) heeft diverse fysiologische en pathologische effecten op het menselijk lichaam. Natriumhydrosulfide (NaHS) wordt veel gebruikt als farmacologisch hulpmiddel om de effecten van H₂S in biologische experimenten te evalueren. Hoewel het verlies van H₂S uit NaHS-oplossingen slechts enkele minuten duurt, zijn NaHS-oplossingen in sommige dierstudies gebruikt als donorverbindingen voor H₂S in drinkwater. Deze studie onderzocht of drinkwater met een NaHS-concentratie van 30 μM, bereid in drinkflessen voor ratten/muizen, gedurende ten minste 12-24 uur stabiel kon blijven, zoals door sommige auteurs is gesuggereerd. Bereid een oplossing van NaHS (30 μM) in drinkwater en giet deze onmiddellijk in drinkflessen voor ratten/muizen. Monsters werden genomen van de opening en de binnenkant van de drinkfles op 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 en 24 uur om het sulfidegehalte te meten met behulp van de methyleenblauwe methode. Daarnaast werden mannelijke en vrouwelijke ratten gedurende twee weken geïnjecteerd met NaHS (30 μM) en werden de serumsulfideconcentraties om de twee dagen gemeten gedurende de eerste week en aan het einde van de tweede week. De NaHS-oplossing in het monster dat van de tuit van de waterfles werd genomen, was instabiel; de concentratie daalde met respectievelijk 72% en 75% na 12 en 24 uur. In monsters die van de binnenkant van de waterflessen werden genomen, was de afname van NaHS binnen 2 uur niet significant; na respectievelijk 12 en 24 uur daalde de concentratie echter met respectievelijk 47% en 72%. Injectie met NaHS had geen invloed op het serumsulfidegehalte van mannelijke en vrouwelijke ratten. Concluderend kunnen we stellen dat NaHS-oplossingen bereid uit drinkwater niet gebruikt mogen worden voor H2S-donatie, omdat de oplossing instabiel is. Deze toedieningsroute stelt dieren bloot aan onregelmatige en lagere dan verwachte hoeveelheden NaHS.
Waterstofsulfide (H2S) wordt al sinds 1700 als toxine gebruikt; de mogelijke rol ervan als endogeen biosignaalmolecuul werd echter pas in 1996 beschreven door Abe en Kimura. In de afgelopen drie decennia zijn talrijke functies van H2S in verschillende menselijke systemen opgehelderd, wat heeft geleid tot het inzicht dat H2S-donormoleculen klinische toepassingen kunnen hebben bij de behandeling of het beheersen van bepaalde ziekten; zie Chirino et al. voor een recent overzicht.
Natriumhydrosulfide (NaHS) wordt veel gebruikt als farmacologisch hulpmiddel om de effecten van H2S te beoordelen in diverse celkweek- en dierstudies5,6,7,8. NaHS is echter geen ideale H2S-donor, omdat het in oplossing snel wordt omgezet in H2S/HS-, gemakkelijk verontreinigd raakt met polysulfiden en gemakkelijk oxideert en vervluchtigt4,9. In veel biologische experimenten wordt NaHS opgelost in water, wat leidt tot passieve vervluchtiging en verlies van H2S10,11,12, spontane oxidatie van H2S11,12,13 en fotolyse14. Sulfide in de oorspronkelijke oplossing gaat zeer snel verloren door vervluchtiging van H2S11. In een open container is de halfwaardetijd (t1/2) van H2S ongeveer 5 minuten en neemt de concentratie ervan met ongeveer 13% per minuut af10. Hoewel het verlies van waterstofsulfide uit NaHS-oplossingen slechts enkele minuten duurt, hebben sommige dierstudies NaHS-oplossingen gebruikt als bron van waterstofsulfide in drinkwater gedurende 1 tot 21 weken, waarbij de NaHS-bevattende oplossing elke 12 tot 24 uur werd vervangen.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Deze praktijk strookt niet met de principes van wetenschappelijk onderzoek, aangezien de dosering van geneesmiddelen gebaseerd moet zijn op het gebruik ervan bij andere diersoorten, met name bij mensen.27
Preklinisch onderzoek in de biomedische wetenschappen is gericht op het verbeteren van de kwaliteit van de patiëntenzorg of de behandelresultaten. De resultaten van de meeste dierstudies zijn echter nog niet vertaald naar de mens28,29,30. Een van de redenen voor dit gebrek aan vertaling is het gebrek aan aandacht voor de methodologische kwaliteit van dierstudies30. Het doel van deze studie was daarom om te onderzoeken of 30 μM NaHS-oplossingen, bereid in waterflessen voor ratten/muizen, stabiel kunnen blijven in drinkwater gedurende 12-24 uur, zoals in sommige studies wordt beweerd of gesuggereerd.
Alle experimenten in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met de gepubliceerde richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren in Iran31. Alle experimentele rapporten in deze studie volgden tevens de ARRIVE-richtlijnen32. De ethische commissie van het Instituut voor Endocriene Wetenschappen van de Shahid Beheshti Universiteit voor Medische Wetenschappen heeft alle experimentele procedures in deze studie goedgekeurd.
Zinkacetaatdihydraat (CAS: 5970-45-6) en watervrij ijzer(III)chloride (CAS: 7705-08-0) werden gekocht bij Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Frankrijk). Natriumhydrosulfidehydraat (CAS: 207683-19-0) en N,N-dimethyl-p-fenyleendiamine (DMPD) (CAS: 535-47-0) werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Isofluraan werd gekocht bij Piramal (Bethlehem, PA, VS). Zoutzuur (HCl) werd gekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland).
Bereid een oplossing van NaHS (30 μM) in drinkwater en giet deze onmiddellijk in de waterflesjes van de ratten/muizen. Deze concentratie is gekozen op basis van talrijke publicaties waarin NaHS als bron van H2S wordt gebruikt; zie de sectie Discussie. NaHS is een gehydrateerd molecuul dat variërende hoeveelheden hydratatiewater kan bevatten (d.w.z. NaHS•xH2O); volgens de fabrikant was het percentage NaHS dat in ons onderzoek werd gebruikt 70,7% (d.w.z. NaHS•1,3 H2O), en we hebben deze waarde in onze berekeningen meegenomen, waarbij we een molecuulgewicht van 56,06 g/mol gebruikten, wat het molecuulgewicht is van watervrij NaHS. Hydratatiewater (ook wel kristalwater genoemd) zijn de watermoleculen waaruit de kristalstructuur bestaat33. Hydraten hebben andere fysische en thermodynamische eigenschappen dan anhydraten34.
Voordat NaHS aan het drinkwater wordt toegevoegd, moeten de pH en de temperatuur van het oplosmiddel worden gemeten. Giet de NaHS-oplossing onmiddellijk in de drinkfles voor ratten/muizen in de kooi. Er werden monsters genomen van de punt en van de binnenkant van de drinkfles op 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 en 24 uur om het sulfidegehalte te meten. Sulfidemetingen werden direct na elke bemonstering uitgevoerd. We namen monsters van de punt van de buis omdat sommige studies hebben aangetoond dat de kleine poriegrootte van de waterbuis de verdamping van H2S kan minimaliseren15,19. Dit lijkt ook van toepassing te zijn op de oplossing in de fles. Dit was echter niet het geval voor de oplossing in de hals van de drinkfles, die een hogere verdampingssnelheid had en auto-oxideerde; de ​​dieren dronken dit water zelfs als eerste.
Voor het onderzoek werden mannelijke en vrouwelijke Wistar-ratten gebruikt. De ratten werden gehuisvest in polypropyleen kooien (2-3 ratten per kooi) onder standaardomstandigheden (temperatuur 21-26 °C, luchtvochtigheid 32-40%) met 12 uur licht (7.00-19.00 uur) en 12 uur donker (19.00-7.00 uur). De ratten hadden onbeperkt toegang tot kraanwater en werden gevoed met standaardvoer (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Leeftijdsgelijke (6 maanden) vrouwelijke (n=10, lichaamsgewicht: 190-230 g) en mannelijke (n=10, lichaamsgewicht: 320-370 g) Wistar-ratten werden willekeurig verdeeld in een controlegroep en een met NaHS (30 μM) behandelde groep (n=5 per groep). Om de steekproefgrootte te bepalen, gebruikten we de KISS-methode (Keep It Simple, Stupid), die eerdere ervaringen combineert met een poweranalyse35. We voerden eerst een pilotstudie uit met 3 ratten en bepaalden het gemiddelde serumgehalte aan totaal sulfide en de standaarddeviatie (8,1 ± 0,81 μM). Vervolgens bepaalden we, uitgaande van een power van 80% en een tweezijdig significantieniveau van 5%, een voorlopige steekproefomvang (n = 5, gebaseerd op eerdere literatuur) die overeenkwam met een gestandaardiseerde effectgrootte van 2,02, met de vooraf gedefinieerde waarde die Festing voorstelde voor het berekenen van de steekproefomvang van proefdieren35. Na vermenigvuldiging van deze waarde met de standaarddeviatie (2,02 × 0,81) was de voorspelde detecteerbare effectgrootte (1,6 μM) 20%, wat acceptabel is. Dit betekent dat n = 5/groep voldoende is om een ​​gemiddelde verandering van 20% tussen groepen te detecteren. De ratten werden willekeurig verdeeld in een controlegroep en een met NaSH behandelde groep met behulp van de random-functie van Excel-software36 (aanvullende figuur 1). Er werd blindering toegepast op het niveau van de uitkomsten, en de onderzoekers die de biochemische metingen uitvoerden, waren niet op de hoogte van de groepstoewijzingen.
De NaHS-groepen van beide geslachten werden gedurende twee weken behandeld met een 30 μM NaHS-oplossing, bereid in drinkwater. Elke 24 uur werd een verse oplossing verstrekt, gedurende welke tijd het lichaamsgewicht werd gemeten. Bloedmonsters werden om de dag afgenomen van de staartpuntjes van alle ratten onder isofluraan-anesthesie aan het einde van de eerste en tweede week. De bloedmonsters werden gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 3000 g, waarna het serum werd gescheiden en bewaard bij –80 °C voor de latere bepaling van serumureum, creatinine (Cr) en totaal sulfide. Serumureum werd bepaald met de enzymatische ureasemethode en serumcreatinine met de fotometrische Jaffe-methode met behulp van commercieel verkrijgbare kits (Man Company, Teheran, Iran) en een automatische analyzer (Selectra E, serienummer 0-2124, Nederland). De intra- en interassay variatiecoëfficiënten voor ureum en Cr waren lager dan 2,5%.
De methyleenblauwmethode (MB) wordt gebruikt om het totale sulfidegehalte in drinkwater en serum met NaHS te meten; MB is de meest gebruikte methode voor het meten van sulfide in bulkoplossingen en biologische monsters11,37. De MB-methode kan worden gebruikt om de totale sulfidepool te schatten38 en anorganische sulfiden in de vorm van H2S, HS- en S2 in de waterfase te meten39. Bij deze methode wordt zwavel neergeslagen als zinksulfide (ZnS) in aanwezigheid van zinkacetaat11,38. Neerslag met zinkacetaat is de meest gebruikte methode voor het scheiden van sulfiden van andere chromoforen11. ZnS werd opnieuw opgelost met HCl11 onder sterk zure omstandigheden. Het sulfide reageert met DMPD in een stoichiometrische verhouding van 1:2 in een reactie die gekatalyseerd wordt door ijzer(III)chloride (Fe3+ fungeert als oxidatiemiddel) om de kleurstof MB te vormen, die spectrofotometrisch wordt gedetecteerd bij 670 nm40,41. De detectielimiet van de MB-methode is ongeveer 1 μM11.
In dit onderzoek werd 100 μL van elk monster (oplossing of serum) aan een buisje toegevoegd; vervolgens werden 200 μL zinkacetaat (1% w/v in gedestilleerd water), 100 μL DMPD (20 mM in 7,2 M HCl) en 133 μL FeCl3 (30 mM in 1,2 M HCl) toegevoegd. Het mengsel werd 30 minuten bij 37°C in het donker geïncubeerd. De oplossing werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 10.000 g en de absorptie van het supernatant werd gemeten bij 670 nm met behulp van een microplaatlezer (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, VS). De sulfideconcentraties werden bepaald met behulp van een kalibratiecurve van NaHS (0–100 μM) in gedestilleerd water (zie Aanvullende Figuur 2). Alle voor de metingen gebruikte oplossingen werden vers bereid. De intra- en interassay variatiecoëfficiënten voor sulfidemetingen waren respectievelijk 2,8% en 3,4%. We hebben ook de totale hoeveelheid sulfide bepaald die werd teruggevonden in natriumthiosulfaat-bevattende drinkwater- en serummonsters met behulp van de verrijkte monstermethode42. De terugwinningspercentages voor natriumthiosulfaat-bevattende drinkwater- en serummonsters waren respectievelijk 91 ± 1,1% (n = 6) en 93 ± 2,4% (n = 6).
Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism software versie 8.0.2 voor Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, VS, www.graphpad.com). Een gepaarde t-test werd gebruikt om de temperatuur en pH van het drinkwater vóór en na toevoeging van NaHS te vergelijken. Het verlies van H2S in de NaHS-bevattende oplossing werd berekend als een percentage afname ten opzichte van de basisopname. Om te bepalen of het verlies statistisch significant was, werd een eenzijdige ANOVA met herhaalde metingen uitgevoerd, gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Dunnett. Lichaamsgewicht, serumureum, serumcreatinine en totaal serumsulfide werden in de loop van de tijd vergeleken tussen controle- en met NaHS behandelde ratten van verschillende geslachten met behulp van een tweezijdige gemengde (tussen-binnen) ANOVA, gevolgd door een Bonferroni post-hoc test. Tweezijdige P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.
De pH van het drinkwater was 7,60 ± 0,01 vóór toevoeging van NaHS en 7,71 ± 0,03 ná toevoeging van NaHS (n = 13, p = 0,0029). De temperatuur van het drinkwater was 26,5 ± 0,2 °C en daalde tot 26,2 ± 0,2 °C na toevoeging van NaHS (n = 13, p = 0,0128). Bereid een 30 μM NaHS-oplossing in drinkwater en bewaar deze in een waterfles. De NaHS-oplossing is instabiel en de concentratie ervan neemt in de loop van de tijd af. Bij het nemen van een monster uit de hals van de waterfles werd binnen het eerste uur een significante daling (68,0%) waargenomen, en het NaHS-gehalte in de oplossing daalde met respectievelijk 72% en 75% na 12 en 24 uur. In monsters uit waterflessen was de afname van NaHS tot 2 uur niet significant, maar na 12 en 24 uur was deze respectievelijk met 47% en 72% gedaald. Deze gegevens geven aan dat het percentage NaHS in een 30 μM-oplossing bereid in drinkwater na 24 uur was gedaald tot ongeveer een kwart van de oorspronkelijke waarde, ongeacht de bemonsteringslocatie (Figuur 1).
Stabiliteit van een NaHS-oplossing (30 μM) in drinkwater in drinkflessen voor ratten/muizen. Na bereiding van de oplossing werden monsters genomen van de punt en de binnenkant van de drinkfles. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD (n = 6/groep). * en #, P < 0,05 vergeleken met tijdstip 0. De foto van de drinkfles toont de punt (met opening) en de rest van de fles. Het volume van de punt is ongeveer 740 μL.
De concentratie van NaHS in de vers bereide 30 μM-oplossing was 30,3 ± 0,4 μM (bereik: 28,7–31,9 μM, n = 12). Na 24 uur daalde de concentratie van NaHS echter tot een lagere waarde (gemiddeld: 3,0 ± 0,6 μM). Zoals weergegeven in figuur 2, waren de concentraties van NaHS waaraan de ratten werden blootgesteld niet constant gedurende de onderzoeksperiode.
Het lichaamsgewicht van vrouwelijke ratten nam in de loop van de tijd significant toe (van 205,2 ± 5,2 g tot 213,8 ​​± 7,0 g in de controlegroep en van 204,0 ± 8,6 g tot 211,8 ± 7,5 g in de met NaHS behandelde groep); de NaHS-behandeling had echter geen effect op het lichaamsgewicht (Fig. 3). Het lichaamsgewicht van mannelijke ratten nam in de loop van de tijd significant toe (van 338,6 ± 8,3 g tot 352,4 ± 6,0 g in de controlegroep en van 352,4 ± 5,9 g tot 363,2 ± 4,3 g in de met NaHS behandelde groep); de NaHS-behandeling had echter geen effect op het lichaamsgewicht (Fig. 3).
Veranderingen in lichaamsgewicht bij vrouwelijke en mannelijke ratten na toediening van NaHS (30 μM). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM en werden vergeleken met behulp van een tweeweg gemengde (binnen-tussen) variantieanalyse met Bonferroni post-hoc toets. n = 5 van elk geslacht in elke groep.
De serumconcentraties van ureum en creatinefosfaat waren gedurende het hele onderzoek vergelijkbaar bij de controle- en de met NaSH behandelde ratten. Bovendien had de NaSH-behandeling geen invloed op de serumconcentraties van ureum en creatinechrome (Tabel 1).
De basale serumconcentraties van totaal sulfide waren vergelijkbaar tussen controle- en met NaHS behandelde mannelijke (8,1 ± 0,5 μM versus 9,3 ± 0,2 μM) en vrouwelijke (9,1 ± 1,0 μM versus 6,1 ± 1,1 μM) ratten. Toediening van NaHS gedurende 14 dagen had geen effect op de serumconcentraties van totaal sulfide bij zowel mannelijke als vrouwelijke ratten (Fig. 4).
Veranderingen in de totale sulfideconcentratie in het serum van mannelijke en vrouwelijke ratten na toediening van NaHS (30 μM). De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM en werden vergeleken met behulp van een tweeweg gemengde (binnen-binnen) variantieanalyse met Bonferroni post-hoc toets. Per geslacht, n = 5/groep.
De belangrijkste conclusie van dit onderzoek is dat drinkwater dat NaHS bevat, instabiel is: slechts ongeveer een kwart van het oorspronkelijke totale sulfidegehalte kan 24 uur na bemonstering van de opening en binnenkant van drinkflessen voor ratten/muizen nog worden gedetecteerd. Bovendien werden ratten blootgesteld aan instabiele NaHS-concentraties als gevolg van het verlies van H₂S in de NaHS-oplossing, en had de toevoeging van NaHS aan het drinkwater geen invloed op het lichaamsgewicht, serumureum en creatinechroom, of het totale serumsulfidegehalte.
In deze studie bedroeg het verlies van H2S uit 30 μM NaHS-oplossingen bereid in drinkwater ongeveer 3% per uur. In een gebufferde oplossing (100 μM natriumsulfide in 10 mM PBS, pH 7,4) nam de sulfideconcentratie naar verluidt met 7% af gedurende 8 uur11. We hebben eerder de intraperitoneale toediening van NaHS verdedigd door te rapporteren dat het verlies van sulfide uit een 54 μM NaHS-oplossing in drinkwater ongeveer 2,3% per uur bedroeg (4%/uur in de eerste 12 uur en 1,4%/uur in de laatste 12 uur na bereiding)8. Eerdere studies43 toonden een constant verlies van H2S uit NaHS-oplossingen aan, voornamelijk als gevolg van vervluchtiging en oxidatie. Zelfs zonder toevoeging van bellen gaat sulfide in de stamoplossing snel verloren door H2S-vervluchtiging11. Uit onderzoek is gebleken dat tijdens het verdunningsproces, dat ongeveer 30-60 seconden duurt, ongeveer 5-10% van het H2S verloren gaat door verdamping⁶. Om verdamping van H2S uit de oplossing te voorkomen, hebben onderzoekers verschillende maatregelen genomen, waaronder het voorzichtig roeren van de oplossing¹², het afdekken van de stamoplossing met plastic folie⁶ en het minimaliseren van de blootstelling van de oplossing aan lucht, aangezien de verdampingssnelheid van H2S afhankelijk is van het grensvlak tussen lucht en vloeistof¹³. Spontane oxidatie van H2S vindt voornamelijk plaats door overgangsmetaalionen, met name ijzer(III)ionen, die onzuiverheden in water zijn¹³. Oxidatie van H2S resulteert in de vorming van polysulfiden (zwavelatomen verbonden door covalente bindingen)¹¹. Om oxidatie te voorkomen, worden oplossingen die H2S bevatten bereid in zuurstofvrije oplosmiddelen44,45 en vervolgens gedurende 20-30 minuten gespoeld met argon of stikstof om de deoxygenatie te garanderen.11,12,37,44,45,46 Diethylenetriaminepentaazijnzuur (DTPA) is een metaalchelator (10–4 M) die HS--autoxidatie in aerobe oplossingen voorkomt. Zonder DTPA bedraagt ​​de autoxidatiesnelheid van HS- ongeveer 50% over een periode van ongeveer 3 uur bij 25 °C37,47. Bovendien, aangezien de oxidatie van 1e-sulfide wordt gekatalyseerd door ultraviolet licht, moet de oplossing op ijs worden bewaard en tegen licht worden beschermd11.
Zoals weergegeven in figuur 5, dissocieert NaHS in Na+ en HS-6 wanneer het in water wordt opgelost; deze dissociatie wordt bepaald door de pK1 van de reactie, die temperatuurafhankelijk is: pK1 = 3,122 + 1132/T, waarbij T varieert van 5 tot 30 °C en wordt gemeten in Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- heeft een hoge pK2 (pK2 = 19), dus bij pH < 96,49 wordt S2- niet gevormd of slechts in zeer kleine hoeveelheden. Daarentegen fungeert HS- als een base en neemt H+ op van een H2O-molecuul, terwijl H2O als een zuur fungeert en wordt omgezet in H2S en OH-.
Vorming van opgelost H2S-gas in een NaHS-oplossing (30 µM). aq, waterige oplossing; g, gas; l, vloeistof. Alle berekeningen gaan ervan uit dat de pH van het water 7,0 is en de watertemperatuur 20 °C. Gemaakt met BioRender.com.
Ondanks bewijs dat NaHS-oplossingen instabiel zijn, hebben verschillende dierstudies NaHS-oplossingen in drinkwater gebruikt als H2S-donorverbinding15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 met interventieduur variërend van 1 tot 21 weken (Tabel 2). Tijdens deze studies werd de NaHS-oplossing elke 12 uur, 15, 17, 18, 24, 25 uur of 24 uur, 19, 20, 21, 22, 23 uur ververst. Onze resultaten toonden aan dat ratten werden blootgesteld aan instabiele geneesmiddelconcentraties als gevolg van het verlies van H2S uit de NaHS-oplossing, en dat het NaHS-gehalte in het drinkwater van de ratten significant fluctueerde gedurende 12 of 24 uur (zie Figuur 2). Twee van deze studies rapporteerden dat de H2S-niveaus in water gedurende 24 uur stabiel bleven22 of dat er slechts 2-3% H2S-verlies werd waargenomen gedurende 12 uur15, maar ze leverden geen ondersteunende gegevens of meetdetails. Twee studies hebben aangetoond dat de kleine diameter van waterflessen de verdamping van H2S kan minimaliseren15,19. Onze resultaten lieten echter zien dat dit het H2S-verlies uit een waterfles slechts met 2 uur kan vertragen in plaats van met 12-24 uur. Beide studies vermelden dat we ervan uitgaan dat het NaHS-niveau in het drinkwater niet veranderde omdat we geen kleurverandering in het water waarnamen; daarom was de oxidatie van H2S door de lucht niet significant19,20. Verrassend genoeg beoordeelt deze subjectieve methode de stabiliteit van NaHS in water in plaats van de verandering in de concentratie ervan in de loop van de tijd te meten.
Het verlies van H2S in een NaHS-oplossing is gerelateerd aan de pH en de temperatuur. Zoals in ons onderzoek is vastgesteld, leidt het oplossen van NaHS in water tot de vorming van een alkalische oplossing50. Wanneer NaHS in water wordt opgelost, hangt de vorming van opgelost H2S-gas af van de pH-waarde6. Hoe lager de pH van de oplossing, hoe groter het aandeel NaHS dat aanwezig is als H2S-gasmoleculen en hoe meer sulfide er uit de waterige oplossing verloren gaat11. Geen van deze onderzoeken rapporteerde de pH van het drinkwater dat als oplosmiddel voor NaHS werd gebruikt. Volgens de aanbevelingen van de WHO, die door de meeste landen worden overgenomen, moet de pH van drinkwater tussen 6,5 en 8,5 liggen51. In dit pH-bereik neemt de snelheid van de spontane oxidatie van H2S ongeveer tienvoudig toe13. Het oplossen van NaHS in water in dit pH-bereik zal resulteren in een concentratie van opgelost H2S-gas van 1 tot 22,5 μM, wat het belang benadrukt van het controleren van de pH van het water voordat NaHS wordt opgelost. Bovendien zou het temperatuurbereik dat in het bovengenoemde onderzoek is gerapporteerd (18–26 °C) resulteren in een verandering van de concentratie opgelost H2S-gas in de oplossing van ongeveer 10%, aangezien temperatuurveranderingen de pK1 beïnvloeden en kleine veranderingen in pK1 een aanzienlijke impact kunnen hebben op de concentratie opgelost H2S-gas48. Daarnaast verergert de lange duur van sommige onderzoeken (5 maanden)22, waarin grote temperatuurschommelingen worden verwacht, dit probleem ook.
Alle studies, met uitzondering van één21, gebruikten een 30 μM NaHS-oplossing in drinkwater. Om de gebruikte dosis (30 μM) te verklaren, wezen sommige auteurs erop dat NaHS in de waterfase precies dezelfde concentratie H2S-gas produceert en dat het fysiologische bereik van H2S 10 tot 100 μM is, waardoor deze dosis binnen het fysiologische bereik valt15,16. Anderen verklaarden dat 30 μM NaHS het plasma-H2S-niveau binnen het fysiologische bereik kan houden, namelijk 5–300 μM19,20. We beschouwen de concentratie van NaHS in water van 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), die in sommige studies werd gebruikt om de effecten van H2S te onderzoeken. We kunnen berekenen dat de concentratie opgelost H2S-gas 14,7 μM bedraagt, wat ongeveer 50% van de initiële NaHS-concentratie is. Deze waarde is vergelijkbaar met de waarde die door andere auteurs onder dezelfde omstandigheden is berekend13,48.
In onze studie veranderde de toediening van NaHS het lichaamsgewicht niet; dit resultaat komt overeen met de resultaten van andere studies bij mannelijke muizen22,23 en mannelijke ratten18. Twee studies rapporteerden echter dat NaSH het verlaagde lichaamsgewicht bij nefrectomiseerde ratten herstelde24,26, terwijl andere studies geen effect van NaSH-toediening op het lichaamsgewicht rapporteerden15,16,17,19,20,21,25. Bovendien had de toediening van NaSH in onze studie geen invloed op de serumureum- en creatinechromiumspiegels, wat overeenkomt met de resultaten van een ander rapport25.
Uit het onderzoek bleek dat de toevoeging van NaHS aan het drinkwater gedurende 2 weken geen invloed had op de totale serumsulfideconcentraties bij mannelijke en vrouwelijke ratten. Deze bevinding komt overeen met de resultaten van Sen et al. (16): een behandeling van 8 weken met 30 μM NaHS in het drinkwater had geen invloed op de plasmasulfidespiegels bij controle ratten; zij rapporteerden echter dat deze interventie de verlaagde H2S-spiegels in het plasma van nefrectomiseerde muizen herstelde. Li et al. (22) rapporteerden ook dat een behandeling met 30 μM NaHS in het drinkwater gedurende 5 maanden de plasma-vrije sulfidespiegels bij oudere muizen met ongeveer 26% verhoogde. Andere studies hebben geen veranderingen in circulerend sulfide gerapporteerd na toevoeging van NaHS aan het drinkwater.
Zeven studies rapporteerden het gebruik van Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, maar gaven geen verdere details over het hydratatiewater, en vijf studies vermeldden de bron van het NaHS dat in hun bereidingsmethoden werd gebruikt niet17,18,24,25,26. NaHS is een gehydrateerd molecuul en het gehalte aan hydratatiewater kan variëren, wat van invloed is op de hoeveelheid NaHS die nodig is om een ​​oplossing met een bepaalde molariteit te bereiden. Het NaHS-gehalte in onze studie was bijvoorbeeld NaHS•1,3 H2O. De werkelijke NaHS-concentraties in deze studies kunnen dus lager zijn dan de gerapporteerde waarden.
“Hoe kan zo’n kortlevende verbinding zo’n langdurig effect hebben?” Pozgay et al.21 stelden deze vraag bij het evalueren van de effecten van NaHS op colitis bij muizen. Ze hopen dat toekomstige studies deze vraag zullen kunnen beantwoorden en speculeren dat NaHS-oplossingen naast H2S en disulfiden die het effect van NaHS bewerkstelligen, mogelijk ook stabielere polysulfiden bevatten21. Een andere mogelijkheid is dat zeer lage concentraties NaHS die in oplossing achterblijven, ook een gunstig effect kunnen hebben. Olson et al. leverden namelijk bewijs dat micromolaire concentraties H2S in het bloed niet fysiologisch zijn en in het nanomolaire bereik zouden moeten liggen of geheel afwezig zouden moeten zijn13. H2S kan werken via eiwitsulfatering, een omkeerbare post-translationele modificatie die de functie, stabiliteit en lokalisatie van veel eiwitten beïnvloedt52,53,54. Onder fysiologische omstandigheden is ongeveer 10% tot 25% van veel levereiwitten gesulfyleerd53. Beide studies erkennen de snelle afbraak van NaHS19,23 maar stellen verrassend genoeg dat “we de concentratie van NaHS in drinkwater onder controle hielden door het dagelijks te vervangen.”23 Eén studie vermeldde per ongeluk dat “NaHS een standaard H2S-donor is en vaak in de klinische praktijk wordt gebruikt om H2S zelf te vervangen.”18
Uit de bovenstaande discussie blijkt dat NaHS uit de oplossing verdwijnt door vervluchtiging, oxidatie en fotolyse. Daarom worden enkele suggesties gedaan om het verlies van H2S uit de oplossing te verminderen. Ten eerste is de verdamping van H2S afhankelijk van het gas-vloeistofgrensvlak13 en de pH van de oplossing11; om het verdampingsverlies te minimaliseren, kan de hals van de waterfles zo klein mogelijk worden gemaakt, zoals eerder beschreven15,19, en kan de pH van het water worden aangepast tot een acceptabele bovengrens (d.w.z. 6,5–8,551) om het verdampingsverlies te minimaliseren11. Ten tweede treedt spontane oxidatie van H2S op door de effecten van zuurstof en de aanwezigheid van overgangsmetaalionen in drinkwater13, waardoor deoxygenatie van drinkwater met argon of stikstof44,45 en het gebruik van metaalchelatoren37,47 de oxidatie van sulfiden kan verminderen. Ten derde kunnen waterflessen worden omwikkeld met aluminiumfolie om de fotodecompositie van H2S te voorkomen; Deze praktijk is ook van toepassing op lichtgevoelige materialen zoals streptozotocine55. Ten slotte kunnen anorganische sulfidezouten (NaHS, Na2S en CaS) via maagsonde worden toegediend in plaats van opgelost in drinkwater, zoals eerder gerapporteerd56,57,58; studies hebben aangetoond dat radioactief natriumsulfide dat via maagsonde aan ratten wordt toegediend, goed wordt geabsorbeerd en verdeeld over vrijwel alle weefsels59. Tot nu toe hebben de meeste studies anorganische sulfidezouten intraperitoneaal toegediend; deze toedieningsroute wordt echter zelden gebruikt in klinische settings60. De orale toedieningsroute is daarentegen de meest voorkomende en geprefereerde toedieningsroute bij mensen61. Daarom raden wij aan de effecten van H2S-donoren bij knaagdieren te evalueren door middel van orale toediening via maagsonde.
Een beperking is dat we sulfide in waterige oplossing en serum hebben gemeten met behulp van de MB-methode. Methoden voor het meten van sulfide omvatten jodiumtitratie, spectrofotometrie, elektrochemische methoden (potentiometrie, amperometrie, coulometrische methode en amperometrische methode) en chromatografie (gaschromatografie en hogedruk-vloeistofchromatografie), waarvan de meest gebruikte methode de spectrofotometrische MB-methode is62. Een beperking van de MB-methode voor het meten van H2S in biologische monsters is dat deze alle zwavelhoudende verbindingen meet en niet vrij H2S63, omdat de meting onder zure omstandigheden wordt uitgevoerd, wat resulteert in de extractie van zwavel uit de biologische bron64. Volgens de American Public Health Association is MB echter de standaardmethode voor het meten van sulfide in water65. Deze beperking heeft daarom geen invloed op onze belangrijkste resultaten met betrekking tot de instabiliteit van oplossingen die NaHS bevatten. Bovendien bedroeg het herstelpercentage van de sulfidemetingen in water- en serummonsters die NaHS bevatten in ons onderzoek respectievelijk 91% en 93%. Deze waarden komen overeen met eerder gerapporteerde bereiken (77–92)66, wat duidt op een acceptabele analytische precisie42. Het is belangrijk op te merken dat we zowel mannelijke als vrouwelijke ratten hebben gebruikt, in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH), om overmatige afhankelijkheid van uitsluitend mannelijke proefdieren in preklinische studies te vermijden67 en om waar mogelijk zowel mannelijke als vrouwelijke ratten te betrekken68. Dit punt is ook door anderen benadrukt69,70,71.
Samenvattend wijzen de resultaten van dit onderzoek erop dat NaHS-oplossingen bereid uit drinkwater niet gebruikt kunnen worden om H2S te genereren vanwege hun instabiliteit. Deze toedieningsroute zou dieren blootstellen aan instabiele en lager dan verwachte concentraties NaHS; daarom zijn de bevindingen mogelijk niet van toepassing op mensen.
De datasets die tijdens dit onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.
Szabo, K. Tijdlijn van waterstofsulfide (H2S)-onderzoek: van milieutoxine tot biologische mediator. Biochemistry and Pharmacology 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. en Kimura, H. Mogelijke rol van waterstofsulfide als endogene neuromodulator. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. en Papapetropoulos, A. Fysiologische rol van waterstofsulfide in zoogdiercellen, -weefsels en -organen. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, en Kashfi, K. De veelbelovende ontwikkeling van cellulaire toedieningssystemen voor stikstofmonoxide en waterstofsulfide: een nieuw tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Langdurige toediening van een langzaam vrijkomende waterstofsulfidedonor kan myocardiale ischemie/reperfusieschade voorkomen. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM en Hermann, A. BK-kanaalfosforylering reguleert de gevoeligheid voor waterstofsulfide (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM en Hermann, A. Waterstofsulfide versterkt de activiteit van calciumgeactiveerde kaliumkanalen (BK-kanalen) in rattenhypofyse-tumorcellen. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Waterstofsulfide versterkt het beschermende effect van nitriet tegen myocardiale ischemie-reperfusieschade bij ratten met diabetes type 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Trends in de chemie van H2S-donoren en de impact daarvan op hart- en vaatziekten. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, en Olson, KR (2012). Passief verlies van waterstofsulfide in biologische experimenten. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Chemische aspecten van waterstofsulfide-metingen in fysiologische monsters. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spectrofotometrische bepaling van waterstofsulfide in natuurlijke wateren. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktische training in de chemie en biologie van waterstofsulfide. “Antioxidanten.” Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).