Eiwitsortering in het secretoire transportpad is essentieel voor het handhaven van celcompartimentering en homeostase. Naast sortering via de eiwitmantel is de rol van lipiden bij de sortering van kinesine in het secretoire transportproces een fundamentele vraag die al lange tijd onbeantwoord is. In deze studie tonen we met behulp van 3D simultane, meerkleurige, hoge-resolutie real-time beeldvorming in vivo aan dat nieuw gesynthetiseerde, aan glycosylfosfatidylinositol geïmmobiliseerde eiwitten met zeer lange ceramide-lipidengroepen clusteren en worden geclassificeerd in gespecialiseerde endoplasmatische Net-uitgangsplaatsen, die verschillen van die welke door transmembraaneiwitten worden gebruikt. Bovendien laten we zien dat de ketenlengte van ceramide in het endoplasmatisch reticulummembraan cruciaal is voor deze sorteerselectiviteit. Onze studie levert het eerste directe in vivo bewijs voor de classificatie van eiwitladingen op basis van de lipidenketenlengte in selectieve exportplaatsen in het secretoire transportpad.
In eukaryotische cellen worden de eiwitten die in het endoplasmatisch reticulum (ER) worden gesynthetiseerd, vervolgens gesorteerd tijdens het transport door de secretieroute om ze naar hun juiste cellulaire bestemming te brengen (1). Naast sortering via coat-mechanismen werd lange tijd gespeculeerd dat bepaalde lipiden ook als selectieve uitgangspunten kunnen dienen door ze te clusteren in specifieke membraandomeinen die specifieke eiwitten binden (2-5). Er is echter nog steeds een gebrek aan direct in vivo bewijs voor dit mogelijke op lipiden gebaseerde mechanisme. Om dit fundamentele probleem op te lossen, hebben we in gist onderzocht hoe glycosylfosfatidylinositol (GPI)-verankerde eiwitten (GPI-AP's) differentieel uit het ER worden geëxporteerd. GPI-AP's zijn een verscheidenheid aan lipide-verbonden celoppervlakte-eiwitten (6, 7). Een GPI-AP is een gesecreteerd eiwit dat via de glycolipide-eenheid (GPI-anker) aan de buitenste lagen van het plasmamembraan is gehecht. Ze accepteren GPI-ankers als conservatieve post-translationele modificaties in het ER-lumen (8). Na de aanhechting passeert GPI-AP het Golgi-apparaat (5, 9) van het ER naar het plasmamembraan. De aanwezigheid van GPI-ankers zorgt ervoor dat GPI-AP apart van transmembraan gesecreteerde eiwitten (waaronder andere plasmamembraaneiwitten) langs de secretieroute wordt getransporteerd (5, 9, 10). In gistcellen worden GPI-AP's in het endoplasmatisch reticulum gescheiden van andere gesecreteerde eiwitten en vervolgens verpakt in unieke blaasjes die omhuld worden door coatproteïnecomplex II (COPII) (6, 7). De bepalende factoren van dit classificatieproces in het ER-exportproces zijn onduidelijk, maar er wordt gespeculeerd dat dit mechanisme lipiden vereist, met name de structurele hermodellering van het lipidegedeelte van het GPI-anker (5, 8). In gist begint de GPI-lipidehermodellering onmiddellijk nadat de GPI zich heeft aangehecht, en in veel gevallen zorgt dit ervoor dat ceramide zich bindt aan het verzadigde vetzuur met 26 koolstofatomen (C26:0) (11, 12). C26-ceramide is tot nu toe de belangrijkste ceramide die door gistcellen wordt geproduceerd. Het wordt gesynthetiseerd in het ER en het grootste deel ervan wordt via COPII-vesikels naar het Golgi-apparaat geëxporteerd (13). De ER-export van GPI-AP vereist specifiek een voortdurende ceramidesynthese (14, 15), en op zijn beurt is de omzetting van ceramide naar inositol-fosfaatceramide (IPC) in het Golgi-apparaat afhankelijk van de synthese van GPI-ankers (16). Biofysische studies met kunstmatige membranen hebben aangetoond dat ceramiden met zeer lange acylketens kunnen samensmelten tot geordende domeinen met unieke fysische eigenschappen (17, 18). Deze gegevens leiden tot de hypothese dat C26-ceramide en GPI-AP met C26-ceramide hun fysische eigenschappen gebruiken om samen te smelten tot geordende gebieden in de relatief rommelige lipidenomgeving van het ER-membraan. Deze omgeving bestaat voornamelijk uit korte en onverzadigde glycerolipiden (C16:1 en C18:1) (19, 20). Deze regio's zullen selectief gericht zijn op specifieke ER-uitgangsplaatsen (ERES), waar ceramide en ceramide-gebaseerde GPI-AP samen naar het Golgi-apparaat kunnen worden getransporteerd in dezelfde specifieke COPII-vesikel (5).
In deze studie hebben we dit op lipiden gebaseerde mechanisme rechtstreeks getest met behulp van superresolutie confocale real-time beeldvormingsmicroscopie (SCLIM), een geavanceerde microscopietechniek waarmee tegelijkertijd fluorescerend gelabelde eiwitten kunnen worden waargenomen. De drie-kleuren en driedimensionale (3D) beelden hebben een extreem hoge resolutie en snelheid in levende cellen (21, 22).
We hebben eerst SCLIM-technologie toegepast om verder te definiëren hoe normaal GPI-AP met een C26-ceramidegroep werd gescreend uit transmembraan-gesecreteerde eiwitten nadat ze het ER in S. cerevisiae hadden verlaten. Om de classificatie van het ER te controleren, gebruikten we een genetisch systeem dat direct visualisatie mogelijk maakt van nieuw gesynthetiseerde lading die in vivo het ERES binnenkomt (7, 23). Als lading kozen we voor het op C26-ceramide gebaseerde GPI-AP Gas1, gelabeld met groen fluorescerend eiwit (GFP), en het transmembraan-gesecreteerde eiwit Mid2, gelabeld met nabij-infrarood fluorescerend eiwit (iRFP), die beide gericht zijn op het plasmamembraan (24-26). In de temperatuurgevoelige sec31-1-mutant worden deze twee ladingen tot expressie gebracht onder een galactose-induceerbare promotor en een constitutieve ERES-marker. Bij de extreme temperatuur (37 °C) accumuleert nieuw gesynthetiseerde lading in het ER, omdat de sec31-1-mutatie de functie van COPII-coatcomponent Sec31 beïnvloedt en zo de COPII-kieming en ER-export remt (23). Na afkoeling tot een lage temperatuur (24 °C) herstelden de sec31-1 mutantcellen zich van het secretoire gebied, en de geaccumuleerde nieuwe synthetische lading begon vanuit het ER te worden geëxporteerd. CLIM-visualisatie toonde aan dat het grootste deel van de nieuw gesynthetiseerde Gas1-GFP en Mid2-iRFP zich nog steeds in het ER van de sec31-1 mutantcellen ophoopte na incubatie bij 37 °C en vervolgens werd vrijgegeven bij 24 °C gedurende 5 minuten (Figuur 1). Omdat Mid2-iRFP over het gehele ER-membraan is verdeeld en Gas1-GFP geconcentreerd is in het discontinue ER-membraangebied, is hun distributie volledig verschillend (Figuur 1, A tot C en Video S1). Bovendien, zoals weergegeven in Figuur 1D, bevat de Gas1-GFP-cluster geen Mid2-iRFP. Deze resultaten wijzen erop dat GPI-AP en transmembraaneiwitten al vroeg in verschillende ER-membraanregio's werden gescheiden. De Gas1-GFP-cluster bevindt zich naast een specifieke ERES die gelabeld is met mCherry's COPII-mantelproteïne Sec13 (Figuur 1, E en F, en film S1) (23).
sec31-1-cellen brengen galactose-geïnduceerde secreties tot expressie, een ceramide met een lange acylketen (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en het transmembraaneiwit Mid2-iRFP (TMP, blauw). Deze constructieve ERES-labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta) werd 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd, vervolgens naar 24 °C gebracht en 5 minuten later met SCLIM gefotografeerd. (A tot en met C) toont een representatief samengevoegd of enkel 2D-beeld van een vlak (A), een 2D-projectiebeeld van 10 z-doorsneden (B) of een 3D-beeld van een celhemisfeer met cargo en ERES-markers (C). Schaalbalk 1 μm (A en B). De schaaleenheid is 0,551 μm (C). Gas1-GFP werd gedetecteerd in discrete ER-regio's of clusters, terwijl Mid2-iRFP werd gedetecteerd en verspreid was over het gehele ER-membraan (C). (D) De grafiek toont de relatieve fluorescentie-intensiteit van Gas1-GFP en Mid2-iRFP in de Gas1-GFP-cluster langs de witte pijllijn (links). AU, willekeurige eenheid. (E en F) representeren de 3D-afbeelding die de goederen en ERES-markering combineert. Gas1-GFP-clusters werden gedetecteerd in de buurt van de specifieke ERES. De schaaleenheid is 0,551 μm. (F) De witte ononderbroken pijl markeert de Gas1-GFP-cluster die geassocieerd is met ERES. De middelste en rechter panelen tonen de samengevoegde, vergrote 3D-afbeelding en een gedraaide weergave van de geselecteerde Gas1-GFP-cluster.
De nauwe ruimtelijke relatie tussen de Gas1-GFP-cluster en een specifieke ERES wijst erop dat Gas1-GFP selectief ERES kan binnengaan, wat verschilt van de selectiviteit waarmee Mid2-iRFP het ER verlaat. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, hebben we de ERES-ratio gekwantificeerd voor slechts één of twee ladingen (Figuur 2, A tot C). We ontdekten dat de meeste ERES (70%) slechts één type lading bevatten. De onderste afbeelding van Figuur 2C toont twee typische voorbeelden van ERES met alleen Gas1-GFP (Figuur 1) of alleen Mid2-iRFP (Figuur 2). Daarentegen bevat ongeveer 20% van de ERES twee ladingen die elkaar in hetzelfde gebied overlappen. Er werd vastgesteld dat sommige ERES (10%) twee soorten lading bevatten, maar deze waren geïsoleerd in duidelijk verschillende gebieden. Deze statistische analyse toont dus aan dat na export uit het ER, GPI-AP Gas1-GFP en de transmembraanlading Mid2-iRFP verdeeld worden over verschillende ERES (Figuur 2D). Deze sorteerefficiëntie is zeer consistent met de eerdere biochemische analyse (6) en morfologische bepaling (7). We kunnen ook het gedrag van de in quarantaine geplaatste lading die ERES binnenkomt observeren (Figuur 2E en Film S2). Figuur 2E laat zien dat slechts een klein deel van Gas1-GFP (paneel 3) of Mid2-iRFP (paneel 4) de ERES vanaf één kant binnenkomt en in een afgebakend gebied wordt opgesloten. Paneel 5 van Figuur 2E laat zien dat Gas1-GFP en Mid2-iRFP soms in dezelfde ERES worden aangetroffen, maar dat ze vanaf verschillende kanten binnenkomen en geconcentreerd zijn in afzonderlijke gebieden die mogelijk verschillende COPII-vesikels vertegenwoordigen. We hebben ook bevestigd dat de waargenomen scheiding en classificatie van C26-ceramide-gebaseerde GPI-AP Gas1 als selectieve ERES specifiek is, omdat een andere transmembraan secretielading, het GFP-gelabelde plasmamembraaneiwit Axl2 (27), een vergelijkbaar gedrag vertoont als Mid2-iRFP. (Afbeelding S1 en Film S3). Het nieuw gesynthetiseerde Axl2-GFP wordt, net als Mid2-iRFP, over het ER-membraan verdeeld (Figuur S1, A en B) en is in de meeste ERES-gebieden co-gelokaliseerd met Mid2-iRFP (Figuur S1, B tot en met D). Panelen 1 en 2 van Figuur 1. S1C toont twee typische voorbeelden van ERES-gebieden waar twee transmembraanladingen elkaar overlappen. In deze gevallen komen beide ladingen samen in ERES terecht (Figuur S1E, paneel 3 en video S3).
De sec31-1-cellen die galactose-induceerbare secreties tot expressie brengen, Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en Mid2-iRFP (TMP, blauw) en constitutieve ERES-labeling Sec13-mCherry (ERES, magenta), werden bij 37 °C geplaatst. Na 30 minuten incubatie bij °C werden ze naar 24 °C gebracht om de secretieblokkade op te heffen en na 20 minuten werden beelden gemaakt met SCLIM. (A tot C) Representatieve 2D-projectiebeelden (A; schaalbalk, 1 μm) of 3D-celhemisfeerbeelden (B en C; schaaleenheid, 0,456 μm) van de lading en 10 z-secties gemarkeerd door ERES. Het onderste paneel in (B) en het paneel in (C) tonen bewerkte beelden om alleen de goederen weer te geven die aanwezig zijn in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grijs) en Mid2-iRFP (lichtblauw)]. (C) Open pijl: ERES draagt ​​slechts één stuk lading (1 tot 4). Grijze pijl: ERES bevat gescheiden lading (5). Witte ononderbroken pijl: ERES met co-located lading. Onder: De geselecteerde enkele ERES bevat alleen Gas1-GFP (1) of Mid2-iRFP (2). Schaalbalk, 100 nm. (D) Kwantificering van de fotomicrograaf beschreven in (C). Het gemiddelde percentage ERES dat slechts één lading bevat (Gas1-GFP of Mid2-iRFP), gescheiden lading en overlappende lading. In drie onafhankelijke experimenten, n=432 in 54 cellen. Foutbalk = SD. Tweezijdige ongepaarde t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-afbeelding van geselecteerde ERES van in quarantaine geplaatste lading gemarkeerd met (C). Gas1-GFP (groen) (3) of Mid2-iRFP (blauw) (4) komt ERES (magenta) binnen vanaf één kant en blijft beperkt tot een klein gebied binnen ERES. Soms komen beide typen lading dezelfde ERES (5) binnen vanaf dezelfde kant en blijven ze beperkt tot een geïsoleerd gebied binnen de ERES. Schaalbalk, 100 nm.
Vervolgens testten we de hypothese dat de lange acylketen ceramide (C26) die aanwezig is in het ER-membraan de specifieke clustering en sortering van Gas1 in selectieve ERES aandrijft. Hiertoe gebruikten we een gemodificeerde giststam GhLag1, waarin de twee endogene ceramidesynthasen Lag1 en Lac1 werden vervangen door GhLag1 (het Lag1-homoloog van katoen), wat resulteerde in een giststam met een celmembraan dat korter is dan dat van het wildtype (Figuur 3A) (28). Massaspectrometrie (MS)-analyse toonde aan dat in wildtype-stammen 95% van de totale ceramide bestaat uit zeer lange (C26) keten ceramide, terwijl in GhLag1 85% van de ceramide zeer lange (C18 en C16) keten ceramide is. Slechts 2% van de ceramide bestaat uit zeer lange (C26) keten ceramide. Hoewel C18- en C16-ceramiden tot nu toe de belangrijkste ceramiden zijn die in het GhLag1-membraan zijn gedetecteerd, bevestigde MS-analyse ook dat het GPI-anker van Gas1-GFP, tot expressie gebracht in de GhLag1-stam, C26-ceramide bevat, wat vergelijkbaar is met wildtype-lipiden. De kwaliteit is hetzelfde (Fig. 3A) (26). Dit betekent dus dat het ceramide-remodellerende enzym Cwh43 zeer selectief is voor C26-ceramide, zoals weergegeven in Figuur 26, en dat het bij voorkeur het GPI-anker inbouwt uit een kleine hoeveelheid C26-ceramide in de GhLag1-stam. S2 (29). Niettemin bevat het celmembraan van GhLag1 in principe alleen C18-C16-ceramide, terwijl Gas1-GFP nog steeds C26-ceramide bevat. Dit feit maakt deze stam een ​​ideaal hulpmiddel om specifiek het probleem van de acylketenlengte van membraanceramide in het ER op te lossen. De hypothetische rol van klasse en sortering. Vervolgens bestudeerden we eerst het vermogen van C26 Gas1-GFP om zich in clusters te accumuleren in GhLag1 met een temperatuurgevoelig mutant allel van sec31-1 door middel van conventionele fluorescentiemicroscopie, waarbij alleen de lange (C18-C16) keten aanwezig is in het ceramide van het ER-membraan (Fig. 3). We observeerden dat in sec31-1 het grootste deel van Gas1-GFP geconcentreerd was in clusters, terwijl Gas1-GFP in sec31-1 GhLag1 met een lang (C18-C16) ceramide ER-membraan voornamelijk niet geclusterd was en verspreid was over het gehele ER-membraan. Om precies te zijn, omdat de op C26 ceramide gebaseerde clustering nauw verband houdt met specifieke ERES (Figuur 1), onderzochten we vervolgens of dit proces ook de functie van het ER-exporteiwitmechanisme zou kunnen omvatten. GPI-AP gebruikt een speciaal COPII-systeem voor ER-export, dat actief wordt gereguleerd door de structurele hermodellering van het glycaangedeelte van het GPI-anker door Ted1 (30, 31). Het recombinante GPI-glycaan wordt vervolgens herkend door het transmembraan cargo-receptor p24-complex, dat op zijn beurt selectief Lst1 rekruteert, een specifieke isovorm van de belangrijkste COPII cargo-bindende subeenheid Sec24, waardoor GPI-AP-rijke COPII-vesikels worden gevormd (31-33). Daarom hebben we een dubbele mutant geconstrueerd die de deletie van deze afzonderlijke eiwitten (het p24-complexcomponent Emp24, het GPI-glycaan-remodellerende enzym Ted1 en de specifieke COPII-subeenheid Lst1) combineert met de sec31-1 mutantstam, en onderzocht of het mogelijk is om Gas1-cluster GFP te vormen (Figuur 3). We observeerden dat in sec31-1emp24Δ en sec31-1ted1Δ Gas1-GFP voornamelijk niet geclusterd is en verspreid is over het ER-membraan, zoals eerder gezien in sec31-1 GhLag1, terwijl in sec31-1lst1Δ Gas1-GFP zich gedraagt ​​als in sec31-1. Deze resultaten geven aan dat, naast de aanwezigheid van C26-ceramide in het ER-membraan, de clustering van Gas1-GFP ook binding aan het p24-complex vereist en geen specifieke Lst1-rekrutering. Vervolgens onderzochten we de mogelijkheid dat de ketenlengte van ceramide in het ER-membraan de binding van Gas1-GFP aan p24 kan reguleren. We ontdekten echter dat de aanwezigheid van C18-C16-ceramide in het membraan geen invloed heeft op de GPI-glycanen die door het p24-complex worden gereconstrueerd (Figuren S3 en S4, A en B) of op de binding aan GPI-AP en het vermogen om GPI-AP te exporteren. Rekruteer COPII-subtype Lst1 (Figuur S4C). Daarom vereist de C26-ceramide-afhankelijke clustering geen eiwitinteracties met verschillende ER-exporteiwitmechanismen, maar ondersteunt het een alternatief sorteermechanisme dat wordt aangedreven door de lengte van het lipide. Vervolgens analyseerden we of de lengte van de ceramide-acylketen in het ER-membraan belangrijk is voor de effectieve classificatie van Gas1-GFP als selectieve ERES. Aangezien Gas1 in de GhLag1-stam met korte ceramideketens het ER verlaat en het plasmamembraan binnengaat (Figuur S5), geloven we dat als de sortering wordt aangedreven door de lengte van de ceramide-acylketen, de Gas1 in de GhLag1-stam kan worden omgeleid en ERES-producten met hetzelfde membraan kan passeren.
(A) Het celmembraan van GhLag1 bevat voornamelijk kortere C18-C16 ceramiden, terwijl het GPI-anker van Gas1-GFP nog steeds dezelfde C26 IPC heeft als wildtypecellen. Boven: analyse van de acylketenlengte van ceramide in het celmembraan van wildtype (Wt) en GhLag1p-stammen door middel van massaspectrometrie (MS). De gegevens vertegenwoordigen het percentage van de totale ceramide. Het gemiddelde van drie onafhankelijke experimenten. Foutbalk = SD. Tweezijdige ongepaarde t-test. **** P < 0,0001. Onderste paneel: MS-analyse van de acylketenlengte van de IPC aanwezig in het Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-anker, tot expressie gebracht in de wildtype- en GhLag1p-stammen. De gegevens vertegenwoordigen het percentage van het totale IPC-signaal. Gemiddelde van vijf onafhankelijke experimenten. Foutbalk = SD. Tweezijdige ongepaarde t-test. ns, niet significant. P = 0,9134. (B) Fluorescentiemicroscopische beelden van sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ en sec31-1lst1Δ cellen die galactose-geïnduceerd Gas1-GFP tot expressie brengen, werden 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd en vervolgens overgebracht naar 24 °C voor routinematig fluorescentiemicroscopisch onderzoek. Witte pijl: ER Gas1-GFP-cluster. Open pijl: Niet-geclusterd Gas1-GFP is verdeeld over het gehele ER-membraan en vertoont de karakteristieke ER-kernringkleuring. Schaalbalk, 5 μm. (C) Kwantificering van de in (B) beschreven fotomicrograaf. Het gemiddelde percentage cellen met een puntvormige Gas1-GFP-structuur. In drie onafhankelijke experimenten, n ≥ 300 cellen. Foutbalk = SD. Tweezijdige ongepaarde t-test. **** P < 0,0001.
Om dit probleem direct op te lossen, hebben we SCLIM-visualisatie uitgevoerd van Gas1-GFP en Mid2-iRFP in GhLag1 met het temperatuurgevoelige mutante allel sec31-1 (Figuur 4 en Video S4). Nadat het ER op 37°C was gehouden en vervolgens op 24°C was vrijgegeven, bleek het grootste deel van de nieuw gesynthetiseerde Gas1-GFP niet geclusterd en verspreid over het ER-membraan, zoals waargenomen met conventionele microscopen (Figuur 4, A en B). Bovendien bevat een groot percentage van de ERES (67%) twee soorten cargo die erin samen voorkomen (Figuur 4D). Panelen 1 en 2 van Figuur 4C tonen twee typische voorbeelden van ERES met overlappende Gas1-GFP en Mid2-GFP. Daarnaast werden beide cargo's in dezelfde ERES opgenomen (Figuur 4E, paneel 3 en video S4). Onze resultaten wijzen er daarom op dat de lengte van de ceramide-acylketen in het ER-membraan een belangrijke bepalende factor is voor de aggregatie en classificatie van ER-eiwitten.
Sec31-1 GhLag1-cellen die galactose-geïnduceerde secreties tot expressie brengen, Gas1-GFP (GPI-AP, groen) en Mid2-iRFP (TMP, blauw) en constitutief ERES-gelabeld Sec13-mCherry (ERES, magenta). Incubeer bij 37 °C. Ga 30 minuten door, verlaag de temperatuur naar 24 °C om de secreties vrij te laten komen en maak na 20 minuten een beeld met SCLIM. (A tot C) Representatieve 2D-projectiebeelden (A; schaalbalk, 1 μm) of 3D-celhemisfeerbeelden (B en C; schaaleenheid, 0,45 μm) van de 10 z-secties gemarkeerd door cargo en ERES. Het onderste paneel in (B) en het paneel in (C) tonen bewerkte beelden om alleen de goederen weer te geven die aanwezig zijn in ERES (magenta) [Gas1-GFP (grijs) en Mid2-iRFP (lichtblauw)]. (C) Witte gevulde pijl: ERES, goederen overlappen elkaar. Open pijl: ERES bevat slechts één item. Onderste paneel: De geselecteerde ERES heeft overlappende goederen (1 en 2) gemarkeerd in (C). Schaalbalk, 100 nm. (D) Kwantificering van de fotomicrograaf beschreven in (C). In de sec31-1 en sec31-1 GhLag1-eenheden is slechts één lading (Gas1-GFP of Mid2-iRFP) opgenomen, en het gemiddelde percentage ERES voor geïsoleerde lading en overlappende lading. In drie onafhankelijke experimenten, n = 432 in 54 cellen (sec31-1) en n = 430 in 47 cellen (sec31-1 GhLag1). Foutbalk = SD. Tweezijdige ongepaarde t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) en ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-afbeelding van geselecteerde ERES met overlappende lading (3) gemarkeerd in (C). Gas1-GFP (groen) en Mid2-iRFP (blauw) benaderen ERES (magenta) vanaf dezelfde kant en blijven in hetzelfde ERES-beperkte gebied. Schaalbalk, 100 nm.
Deze studie levert direct in vivo bewijs dat op lipiden gebaseerde eiwitladingen worden geclassificeerd in selectieve exportplaatsen in het secretoire pad, en onthult het belang van de lengte van de acylketen voor classificatieselectiviteit. Met behulp van een krachtige en geavanceerde microscopietechniek genaamd SCLIM hebben we aangetoond dat het nieuw gesynthetiseerde Gas1-GFP (een belangrijk plasmamembraan GPI-AP met een zeer lange acylketen (C26) ceramide lipidegedeelte) in gistcellen voorkomt. De clusters in afzonderlijke ER's zijn geassocieerd met specifieke ERES, terwijl transmembraan gesecreteerde eiwitten verspreid zijn over het gehele ER-membraan (Figuur 1). Bovendien komen deze twee soorten goederen selectief verschillende ERES binnen (Figuur 2). Wanneer de acylketenlengte van het cellulaire ceramide in het membraan wordt gereduceerd van C26 naar C18-C16, wordt de Gas1-GFP-cluster verstoord in het afzonderlijke ER-gebied, en wordt Gas1-GFP omgeleid om het ER te verlaten met het transmembraaneiwit via dezelfde ERES (Figuur 3 en Figuur 4).
Hoewel GPI-AP een gespecialiseerd eiwitmechanisme gebruikt om het ER te verlaten, ontdekten we dat de C26-ceramide-afhankelijke scheiding niet afhankelijk is van differentiële eiwitinteracties die tot ERES-specialisatie zouden kunnen leiden (Figuren S4 en S5). In plaats daarvan ondersteunen onze bevindingen een alternatief classificatiemechanisme, gedreven door lipide-gebaseerde eiwitclustering en daaropvolgende uitsluiting van andere ladingen. Onze observaties geven aan dat het Gas1-GFP-gebied of -cluster dat geassocieerd is met een specifiek ERES het transmembraan-gesecreteerde eiwit Mid2-iRFP mist, wat erop wijst dat het C26-ceramide-afhankelijke GPI-AP-cluster de toegang tot het betreffende ERES zal vergemakkelijken en tegelijkertijd transmembraan-gesecreteerde eiwitten zal uitsluiten die dit specifieke ERES binnenkomen (Figuren 1 en 2). Daarentegen zorgt de aanwezigheid van C18-C16-ceramides in het ER-membraan er niet voor dat GPI-AP gebieden of clusters vormt, waardoor ze transmembraan-gesecreteerde eiwitten niet uitsluiten of vervangen in hetzelfde ERES (Figuren 3 en 4). Daarom stellen we voor dat C26-ceramide de scheiding en classificatie bevordert door de clustering van eiwitten die aan specifieke ERES zijn gekoppeld te vergemakkelijken.
Hoe wordt deze C26-ceramide-afhankelijke clustering in een specifiek ER-gebied bereikt? De neiging van membraanceramide om zich lateraal te scheiden kan ertoe leiden dat GPI-AP en C26-ceramide kleine en direct geordende lipiden vormen in de meer onregelmatige lipidenomgeving van het ER-membraan, dat kortere en onverzadigde glycerolipiden bevat. Kwaliteitsclusters (17, 18). Deze kleine, tijdelijke clusters kunnen verder fuseren tot grotere, stabielere clusters na binding aan het p24-complex (34). In overeenstemming hiermee hebben we aangetoond dat C26 Gas1-GFP moet interageren met het p24-complex om grotere, zichtbare clusters te vormen (Figuur 3). Het p24-complex is een heterozygoot oligomeer, samengesteld uit vier verschillende p24-transmembraaneiwitten in gist (35), dat zorgt voor multivalente binding, wat kan leiden tot crosslinking van kleine GPI-AP-clusters, waardoor grotere, stabiele clusters ontstaan ​​(34). De interactie tussen de ectodomeinen van de eiwitten van GPI-AP's kan ook bijdragen aan hun aggregatie, zoals aangetoond tijdens hun Golgi-transport in gepolariseerde epitheelcellen van zoogdieren (36). Wanneer echter C18-C16-ceramide aanwezig is in het ER-membraan, zullen er geen grote, afzonderlijke clusters worden gevormd wanneer het p24-complex bindt aan Gas1-GFP. Het onderliggende mechanisme kan afhangen van de specifieke fysische en chemische eigenschappen van het ceramide met lange acylketens. Biofysische studies van kunstmatige membranen tonen aan dat, hoewel zowel ceramiden met lange (C24) als met korte (C18-C16) acylketens fasescheiding kunnen veroorzaken, alleen ceramiden met lange acylketens (C24) een hoge kromming en filmbuiging kunnen bevorderen om de film te hervormen. Door middel van wederzijdse referentie (17, 37, 38). Er is aangetoond dat de transmembraanhelix van TMED2, het menselijke homoloog van Emp24, selectief interageert met C18-ceramide-gebaseerde sfingomyeline in de cytoplasmatische lobuli (39). Met behulp van moleculaire dynamica (MD)-simulaties hebben we vastgesteld dat zowel C18- als C26-ceramide zich ophopen rond de cytoplasmatische lobuli van de transmembraanhelix van Emp24, en dat ze vergelijkbare voorkeuren hebben (Figuur S6). Het is belangrijk op te merken dat dit erop wijst dat de transmembraanhelix van Emp24 kan leiden tot een asymmetrische verdeling van lipiden in het membraan. Dit is een recent resultaat gebaseerd op zoogdiercellen. Vergelijkbare MD-simulaties tonen ook de aanwezigheid van etherlipiden aan (40). Daarom speculeren we dat C26-ceramide in de twee lobuli van ER26 lokaal verrijkt is. Wanneer GPI-AP in de luminale lobuli direct bindt aan multivalente p24 en de accumulatie van C26-ceramide rond p24 in de cytoplasmatische lobuli, kan dit de bijbehorende eiwitaggregatie en membraankromming bevorderen die via de vingers worden gegenereerd (41), waardoor GPI-AP zich scheidt in discrete gebieden naast ERES, wat ook de sterk gekromde gebieden van het ER-membraan bevordert (42). Eerdere rapporten ondersteunden het voorgestelde mechanisme (43, 44). De multivalente binding van oligolectinen, pathogenen of antilichamen aan ceramide-gebaseerde glycosphingolipiden (GSL) op het plasmamembraan triggert grote GSL-aggregatie, versterkt fasescheiding en veroorzaakt membraanvervorming en internalisatie (44). Iwabuchi enz. (43) Er werd vastgesteld dat in de aanwezigheid van lange (C24) maar niet korte (C16) acylketens, de multivalente ligand gebonden aan GSL lactosylceramide de vorming van grote clusters en membraaninvaginatie induceerde, en dat de cytoplasma Lyn-gemedieerde signaaltransductie op de bladen door acylketens in elkaar grijpende gekoppelde neutrofielen wordt veroorzaakt.
In gepolariseerde epitheelcellen van zoogdieren reguleert de concentratie van het anti-Golgi-netwerk (TGN) tot het niveau van het apicale plasmamembraan de scheiding en sortering van GPI-AP (10, 45). Deze aggregatie wordt aangedreven door GPI-AP-oligomerisatie (36), maar kan ook afhangen van de lengte van de ceramideketen die we in gist aantreffen. Hoewel GPI-AP van zoogdieren een anker heeft op basis van etherlipiden en de chemische structuur ervan sterk verschilt van die van de zeer lange acylketenceramide, heeft een recente studie aangetoond dat beide lipiden evolutionair vergelijkbare fysische en chemische eigenschappen en functies hebben (40). Daarom is het etherlipidegedeelte in zoogdiercellen mogelijk vergelijkbaar met de C26-ceramide in gist, en is de rol ervan om zich te binden aan de lange ketenceramide in het membraan om GPI-AP-aggregatie en -sortering te bevorderen. Hoewel deze mogelijkheid nog direct getest moet worden, ondersteunen eerdere bevindingen dat het transport van het lange acylketen-ceramide naar het Golgi-apparaat niet plaatsvindt via cytoplasmatische transferproteïnen, maar afhankelijk is van de synthese van GPI-ankers, net als bij gist. Het evolutionair geconserveerde mechanisme lijkt daarom in staat te zijn om selectief zeer lange acylketen-ceramide en GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) in hetzelfde transportblaasje te transporteren.
In gepolariseerde epitheelcelsystemen van gist en zoogdieren vindt de aggregatie en scheiding van GPI-AP van andere plasmamembraaneiwitten plaats voordat het celoppervlak wordt bereikt. Paladino et al. (48) ontdekten dat op het TGN van gepolariseerde epitheelcellen van zoogdieren de clustering van GPI-AP niet alleen noodzakelijk is voor de selectieve classificatie van GPI-AP's naar het apicale plasmamembraan, maar ook de clusteringorganisatie van GPI-AP's en de biologische activiteit ervan reguleert. In gist toonde deze studie aan dat de C26-ceramide-afhankelijke GPI-AP-cluster op het ER de clusterorganisatie en functionele activiteit van GPI-AP op het plasmamembraan kan reguleren (24, 49). In overeenstemming met dit model zijn GhLag1-cellen allergisch voor GPI-remmers of geneesmiddelen die de integriteit van de celwand beïnvloeden (28), en de behoefte aan functionele Gas1-GFP-clusters (49) van de tipceramide die wordt geprojecteerd bij de paring van gistcellen duidt op mogelijke fysiologische gevolgen van GhLag1-cellen. GPI-AP-fout. Verder onderzoek naar de vraag of de functionele organisatie van het celoppervlak vanuit het ER is geprogrammeerd door middel van een sorteermethode gebaseerd op de lengte van lipiden, zal echter het onderwerp van ons toekomstig onderzoek zijn.
De Saccharomyces cerevisiae-stammen die in dit werk zijn gebruikt, staan ​​vermeld in Tabel S1. De MMY1583- en MMY1635-stammen van SCLIM voor live-celbeeldvorming werden geconstrueerd in de W303-achtergrond. Deze stammen, die Sec13-mCherry met een fluorescerend eiwitlabel tot expressie brengen, werden geconstrueerd met behulp van een op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde methode met het pFA6a-plasmide als template (23). De stam die Mid2-iRFP, gelabeld met een fluorescerend eiwit onder controle van de GAL1-promotor, tot expressie brengt, werd als volgt geconstrueerd: PCR-amplificatie van de iRFP-KanMx-sequentie uit de pKTiRFP-KAN-vector (geschonken door E. O'Shea, Addgene-plasmidenummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; research resource identifier (RRID): Addgene_64687) en ingevoegd in het C-uiteinde van endogeen Mid2. Nadat de Mid2-iRFP-genoomsequentie was geamplificeerd en gekloneerd in de GAL1-promotor, werd deze geïntegreerd in de Not I-Sac I-site van het integratieplasmide pRS306. Het resulterende plasmide pRGS7 werd gelineariseerd met Pst I om te integreren in het URA3-locus.
Het Gas1-GFP-fusiegen wordt tot expressie gebracht onder controle van de GAL1-promotor in het centromeer (CEN)-plasmide, dat als volgt is geconstrueerd. De Gas1-GFP-sequentie werd door middel van PCR geamplificeerd uit het pRS416-GAS1-GFP-plasmide (24) (geschonken door L. Popolo) en gekloneerd in de Xma I–Xho I-site van het CEN-plasmide pBEVY-GL LEU2 (geschonken door C. Miller; Addgene-plasmidenummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Het resulterende plasmide werd pRGS6 genoemd. Het Axl2-GFP-fusiegen wordt ook tot expressie gebracht onder controle van de GAL1-promotor van de pBEVY-GL LEU2-vector, en de constructie ervan is als volgt. De Axl2-GFP-sequentie werd geamplificeerd uit het pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmide (23) door middel van PCR en gekloneerd in de Bam HI-Pst I-site van de pBEVY-GL LEU2-vector. Het resulterende plasmide werd pRGS12 genoemd. De sequentie van de oligonucleotiden die in dit onderzoek zijn gebruikt, staat vermeld in tabel S2.
De stam werd aangevuld met 0,2% adenine en 2% glucose [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose], een gistextract-eiwitrijk medium (YP) (1% gistextract en 2% eiwit (YPR)) of 2% galactose [YP-galactose (YPG)] als koolstofbron, of in een synthetisch minimaal medium (0,15% giststikstofbasis en 0,5% ammoniumsulfaat) om de benodigde aminozuren en basen voor de voeding aan te vullen, en met 2% glucose (synthetisch glucose-minimaal medium) of 2% galactose (synthetisch galactose-minimaal medium) als koolstofbron.
Voor realtime beeldvorming werden temperatuurgevoelige sec31-1 mutantcellen, die het construct tot expressie brachten onder de GAL1-promotor, 's nachts gekweekt in YPR-medium bij 24°C tot de midden-logaritmische fase. Na inductie in YPG bij 24°C gedurende 1 uur werden de cellen 30 minuten geïncubeerd in SG bij 37°C en vervolgens overgebracht naar 24°C om de secretieblokkade op te heffen. Concanavaline A werd gebruikt om de cellen op een objectglas te fixeren en vervolgens met SCLIM te visualiseren. SCLIM is een combinatie van een Olympus IX-71 omgekeerde fluorescentiemicroscoop en een UPlanSApo 100×1,4 numerieke apertuur olielens (Olympus), een snelle roterende schijf confocale scanner met een hoge signaal-ruisverhouding (Yokogawa Electric), een aangepaste spectrometer en een aangepast koelsysteem. De beeldversterker van het systeem (Hamamatsu Photonics) kan een vergrootlenssysteem leveren met een uiteindelijke vergroting van ×266,7 en een CCD-camera die elektronen vermenigvuldigt (Hamamatsu Photonics) (21). Beeldacquisitie wordt uitgevoerd door aangepaste software (Yokogawa Electric). Voor 3D-beelden gebruikten we een op maat gemaakte piëzo-elektrische actuator om de objectieflens verticaal te laten trillen en verzamelden we de optische onderdelen met een tussenafstand van 100 nm in een stapel. De Z-stack-afbeelding wordt omgezet in 3D-voxelgegevens en de theoretische puntspreidingsfunctie die gebruikt wordt voor de roterende schijf-confocale microscoop wordt gebruikt voor de deconvolutieverwerking met behulp van Volocity-software (PerkinElmer). Door Volocity-software te gebruiken om automatisch drempelwaarden toe te passen voor co-locatieanalyse, werd ERES inclusief lading gemeten. Lijnscananalyse werd uitgevoerd met behulp van MetaMorph-software (Molecular Devices).
Gebruik GraphPad Prism-software om de statistische significantie te bepalen. Voor de tweezijdige Student's t-test en de gewone eenweg-variantieanalyse (ANOVA) worden verschillen tussen groepen als significant beschouwd bij P < 0,05 (*).
Voor fluorescentiemicroscopie van Gas1-GFP werden de logaritmische groeifasecellen een nacht gekweekt in YPD en verzameld door centrifugatie, tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing en gedurende ten minste 15 minuten op ijs geïncubeerd, waarna ze onder de microscoop werden onderzocht zoals eerder beschreven Check (24). Voor de opname werd gebruik gemaakt van de Leica DMi8-microscoop (HCX PL APO 1003/1.40 olie PH3 CS) uitgerust met een objectief, L5 (GFP)-filter, Hamamatsu-camera en Application Suite X (LAS X)-software.
De monsters werden gedenatureerd met SDS-monsterbuffer bij 65°C gedurende 10 minuten en vervolgens gescheiden door SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE). Voor immunoblotting-analyse werd 10 μl monster per lane geladen. Primaire antilichamen: konijn polyklonaal anti-Gas1 in een verdunning van 1:3000, konijn polyklonaal anti-Emp24 in een verdunning van 1:500 en konijn polyklonaal anti-GFP (een geschenk van H. Riezman) in een verdunning van 1:3000. Het muis monoklonale anti-Pgk1 antilichaam werd gebruikt in een verdunning van 1:5000 (een geschenk van J. de la Cruz). Secundair antilichaam: mierrettichperoxidase (HRP)-geconjugeerd geiten-anti-konijn immunoglobuline G (IgG) gebruikt in een verdunning van 1:3000 (Pierce). HRP-geconjugeerd geiten-anti-muis IgG werd gebruikt in een verdunning van 1:3000 (Pierce). De immuunresponszone werd waargenomen met behulp van de chemiluminescentiemethode van het SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Zoals beschreven in (31), werd een natuurlijk immunoprecipitatie-experiment uitgevoerd op de verrijkte ER-fractie. Kort gezegd werden gistcellen tweemaal gewassen met TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride en proteaseremmermengsel] bij 600 nm (OD600) bij een optische dichtheid van 100. De cellen werden gebroken met glasparels, waarna de celresten en glasparels door centrifugatie werden verwijderd. Het supernatant werd vervolgens gedurende 15 minuten bij 17.000 g gecentrifugeerd bij 4°C. De pellet werd opnieuw gesuspendeerd in TNE en digitalis saponine werd toegevoegd tot een eindconcentratie van 1%. De suspensie werd gedurende 1 uur onder roeren bij 4°C geïncubeerd, waarna de onoplosbare componenten werden verwijderd door centrifugatie bij 13.000 g gedurende 60 minuten bij 4°C. Voor Gas1-GFP-immunoprecipitatie wordt het monster eerst 1 uur bij 4°C voorgeïncubeerd met lege agarosekorrels (ChromoTek), en vervolgens 3 uur bij 4°C met GFP-Trap_A (ChromoTek). De geïmmunoprecipiteerde korrels werden vijfmaal gewassen met TNE met 0,2% digoxigenine, geëlueerd met SDS-monsterbuffer, gescheiden door SDS-PAGE en geanalyseerd met immunoblotting.
Zoals beschreven in (31), werd de crosslinking-bepaling uitgevoerd op de verrijkte ER-fractie. Kort gezegd werd de verrijkte ER-fractie geïncubeerd met 0,5 mM dithiobis(succinimidylpropionaat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, VS; 20°C, 20 min). De crosslinking-reactie werd gestopt door toevoeging van glycine (50 mM eindconcentratie, 5 minuten, 20°C).
Zoals eerder beschreven (50), werd MS-analyse van ceramide in wildtype- en GhLag1-stammen uitgevoerd. Kort gezegd werden cellen gekweekt tot de exponentiële fase (3 tot 4 OD600-eenheden/ml) in YPD bij 30 °C, en werden 25 × 10⁷ cellen geoogst. Hun metabolisme werd gestopt met trichloorazijnzuur. Gebruik extractieoplosmiddel [ethanol, water, ether, pyridine en 4,2 N ammoniumhydroxide (15:15:5:1:0,018 v/v)] en 1,2 nmol interne standaard C17-ceramide (860517, Avanti polar lipid) kwaliteit). Gebruik monomethylaminereagens [methanol, water, n-butanol en methylamineoplossing (4:3:1:5 v/v)] om een ​​milde alkalische hydrolyse van het extract uit te voeren, en gebruik vervolgens waterverzadigde n-butanol om te ontzouten. Ten slotte werd het extract opnieuw opgelost in een oplosmiddel voor de positieve modus [chloroform/methanol/water (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetaat] en geïnjecteerd in de massaspectrometer. Multi-reactiemonitoring (MRM) werd uitgevoerd voor de identificatie en kwantificering van sfingolipidenmoleculen. De TSQ Vantage tertiaire quadrupoolmassaspectrometer (Thermo Fisher Scientific) is uitgerust met een robotgestuurde nanoflow-ionenbron Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) voor lipidenanalyse. De botsingsenergie is geoptimaliseerd voor elke ceramidecategorie. MS-gegevens werden verkregen in de positieve modus. Voor elke biologische replicatie is het lipidsignaal de mediaan van drie onafhankelijke metingen.
Zoals beschreven in (31), werden de cellen (800×107) die Gas1-GFP tot expressie brachten, onderworpen aan natuurlijke immunoprecipitatie. Het gezuiverde Gas1-GFP werd gescheiden door SDS-PAGE en overgebracht naar een polyvinylideenfluoride (PVDF)-membraan. Het eiwit werd gevisualiseerd door PVDF te kleuren met amidezwart. De Gas1-GFP-band werd uit het PVDF geknipt en 5 keer gewassen met methanol en eenmaal met LC-MS-kwaliteit water. Door de membraanstrip gedurende 3 uur bij 37 °C te incuberen met 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer en 500 μl vers opgelost 1 M natriumnitrietmengsel, wordt de lipidefractie van Gas1-GFP vrijgemaakt en gelyseerd. Vrijgave van inosinefosfaatceramide tussen glucosamine en inositol (51). Daarna werd de membraanstrip viermaal gewassen met LC-MS-kwaliteit water, gedroogd bij kamertemperatuur en bewaard in een stikstofatmosfeer bij -80 °C tot de analyse. Als controle werd voor elk experiment een blanco PVDF-membraanmonster gebruikt. Het uit Gas1-GFP geëxtraheerde lipide werd vervolgens geanalyseerd met MS zoals beschreven (50). Kort gezegd werden PVDF-strips met GPI-lipide geresuspendeerd in 75 μl negatief matrijs-oplosmiddel [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammoniumacetaat] en onderworpen aan elektrospray-ionisatie (ESI)-MRM/MS-analyse van sfingolipidesoorten (TSQ Vantage). In dit geval werden MS-gegevens verkregen in de negatieve ionenmodus.
Zoals eerder vermeld, werd het lipidegedeelte van het GPI-anker gescheiden van het [3H]-inositol-gelabelde GPI-AP (16). De lipiden werden gescheiden door dunne-laagchromatografie met behulp van een oplossingssysteem (55:45:10 chloroform-methanol-0,25% KCl) en gevisualiseerd met behulp van FLA-7000 (Fujifilm).
De cellen die Gas1-GFP tot expressie brachten (600×10⁷) werden tweemaal gewassen met TNE-buffer en vervolgens opengebroken met glasparels. Daarna werd gecentrifugeerd om celresten en glasparels te verwijderen. Het supernatant werd vervolgens gedurende 1 uur bij 17.000 g gecentrifugeerd bij 4°C. De pellet werd gewassen met TNE en gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd met 1 U PI-PLC (Invitrogen) in TNE met 0,2% digitalissaponine. Na de enzymbehandeling werd het membraan verwijderd door centrifugatie gedurende 1 uur bij 17.000 g bij 4°C. Om Gas1-GFP te immunoprecipiteren, werd het supernatant 's nachts bij 4°C geïncubeerd met GFP-Trap_A (ChromoTek). Het gezuiverde Gas1-GFP, gescheiden door SDS-PAGE, werd gekleurd met Coomassie brilliant blue. De Gas1-GFP-kleuringsband werd uitgesneden uit de grijze omgeving van het aquaduct. Na alkylering met jodoacetamide en reductie met dithiothreitol werd in-gel digestie met trypsine uitgevoerd. Trypsinepeptiden en peptiden met GPI-glycanen werden geëxtraheerd en gedroogd. Het gedroogde peptide werd opgelost in 20 μl water. Een deel (8 μl) werd in de LC geïnjecteerd. Een octadecylsilaan (ODS)-kolom (Develosil 300ODS-HG-5; binnendiameter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, prefectuur Aichi, Japan) werd gebruikt om peptiden te scheiden onder specifieke gradiëntcondities. De mobiele fase bestond uit oplosmiddel A (0,08% mierenzuur) en oplosmiddel B (0,15% mierenzuur in 80% acetonitril). Een Accela HPLC-systeem (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) werd gebruikt om de kolom te elueren met oplosmiddel A binnen 55 minuten bij een stroomsnelheid van 50 μl min-1 gedurende 5 minuten, waarna de concentratie van oplosmiddel B werd verhoogd tot 40%. Het eluaat werd continu in de ESI-ionenbron gebracht en de trypsinepeptiden en peptiden met GPI-glycanen werden geanalyseerd met een LTQ Orbitrap XL (hybride lineaire ionenval-orbitrap massaspectrometer; Thermo Fisher Scientific). In de MS-opstelling werd de spanning van de capillaire bron ingesteld op 4,5 kV en de temperatuur van de transfercapillaire buis op 300 °C gehouden. De capillaire spanning en de buislensspanning werden respectievelijk ingesteld op 15 V en 50 V. MS-gegevens werden verkregen in de positieve ionenmodus (resolutie van 60.000; massa-nauwkeurigheid van 10 delen per miljoen) in een massabereik van 300/m/z massa/ladingsverhouding (m/z) 3000. De MS/MS-gegevens werden verkregen via de ionenval in de LTQ Orbitrap XL [de eerste 3 cijfers waarop de gegevens gebaseerd zijn, botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID)].
MD-simulaties werden uitgevoerd met behulp van de GROMACS-software (52) en het MARTINI 2-krachtveld (53-55). Vervolgens werd de CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) gebruikt om een ​​dubbellaag te construeren die dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) en Cer C18 of DOPC en Cer C26 bevat. De topologie en coördinaten van Cer C26 zijn afgeleid van DXCE door de extra kralen van de sfingosinestaart te verwijderen. Gebruik het hieronder beschreven proces om de dubbellaag in evenwicht te brengen en de simulatie uit te voeren. Gebruik vervolgens de laatste coördinaten van het systeem om een ​​systeem te bouwen dat Emp24 bevat. Het transmembraandomein van gist Emp24 (residuen 173 tot 193) werd geconstrueerd als een α-helix met behulp van de Visual MD (VMD) tool Molecular Structure (58). Na het verwijderen van de overlappende lipiden werd het eiwit grof gegranuleerd en in de dubbellaag ingevoegd met behulp van CHARMM GUI. Het uiteindelijke systeem bevat 1202 DOPC en 302 Cer C26 of 1197 DOPC en 295 Cer C18 en Emp24. Ioniseer het systeem tot een concentratie van 0,150 M. Er werden vier onafhankelijke replicaten gemaakt voor twee dubbellaagsamenstellingen.
De lipide dubbellaag wordt gebalanceerd met behulp van het CHARMM GUI-proces. Dit proces omvat het minimaliseren en balanceren van 405.000 stappen, waarbij de positiebeperkingen geleidelijk worden verminderd en geëlimineerd, en de tijdstap wordt verhoogd van 0,005 ps naar 0,02 ps. Na equilibratie produceert het 6 µs met een tijdstap van 0,02 ps. Na het invoegen van Emp24 wordt hetzelfde CHARMM GUI-proces gebruikt om het systeem te minimaliseren en te balanceren, waarna het 8 s in productie wordt uitgevoerd.
Voor alle systemen wordt de druk tijdens het balanceringsproces geregeld door de Berendsen-barostaat (59), en tijdens het productieproces door de Parrinello-Rahman-barostaat (60). In alle gevallen is de gemiddelde druk 1 bar en wordt een semi-isotropisch drukkoppelingsschema gebruikt. Tijdens het balancerings- en productieproces wordt een thermostaat (61) met snelheidskalibratie gebruikt om de temperatuur van respectievelijk eiwit-, lipide- en oplosmiddeldeeltjes te koppelen. Gedurende de gehele operatie is de streeftemperatuur 310 K. De niet-bindende interactie wordt berekend door een koppelingslijst te genereren met behulp van het Verlet-schema met een buffertolerantie van 0,005. De Coulomb-term wordt berekend met behulp van het reactieveld en een afsnijafstand van 1,1 nm. De Vander Waals-term gebruikt een afsnijschema met een afsnijafstand van 1,1 nm, en het Verlet-afsnijschema wordt gebruikt voor potentiële drift (62).
Met behulp van VMD wordt de grensgolflengte tussen DOPC-fosfaatkralen of ceramide AM1-kralen en het eiwit op 0,7 nm gebracht, en wordt het aantal lipiden dat met het eiwit interageert berekend. Volgens de volgende formule wordt de depletie-verrijkingsfactor (DE-factor) berekend zoals in (63): DE-factor = (de hoeveelheid totale lipiden in het eiwit 0,7) in het eiwit 0,7 (de hoeveelheid Cer in totale lipiden)
De gerapporteerde waarde is verkregen als een gemiddelde, en de foutbalken zijn vier onafhankelijke kopieën van SE. De statistische significantie van de DE-factor wordt berekend met een t-toets [(gemiddeldeDE-factor-1)/SE]. Bereken de P-waarde uit de eenzijdige verdeling.
De GROMACS-tool werd gebruikt om de 2D laterale dichtheidskaart van het systeem met Emp24 te berekenen binnen de laatste 250 ns van de meting. Om de verrijkings-/verarmingskaart van ceramide te verkrijgen, werd de dichtheidskaart van Cer gedeeld door de som van de kaarten van Cer en DOPC, en vervolgens gedeeld door de concentratie van Cer in het lichaam. Dezelfde kleurenschaal werd gebruikt.
Voor aanvullend materiaal bij dit artikel kunt u terecht op http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dit is een open access-artikel dat is gepubliceerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License. Deze licentie staat gebruik, verspreiding en reproductie in elk medium toe, zolang het uiteindelijke gebruik niet commercieel is en ervan uitgaat dat het originele werk correct is. Referentie.
Let op: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u de pagina aanbeveelt weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat het geen spam is. We zullen geen e-mailadressen opslaan.
Deze vraag wordt gebruikt om te controleren of u een bezoeker bent en om automatische spaminzendingen te voorkomen.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-beeldvorming met hoge resolutie en realtime weergave onthult het belang van de lengte van de ceramideketen voor de sortering van eiwitten op selectieve uitvoerlocaties.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-beeldvorming met hoge resolutie en realtime weergave onthult het belang van de lengte van de ceramideketen voor de sortering van eiwitten op selectieve uitvoerlocaties.
©2020 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap. alle rechten voorbehouden. AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.