JavaScript is momenteel uitgeschakeld in uw browser. Sommige functies van deze website werken mogelijk niet wanneer JavaScript is uitgeschakeld.
Registreer u met uw specifieke gegevens en het geneesmiddel waarin u geïnteresseerd bent, en wij vergelijken de door u verstrekte informatie met artikelen in onze uitgebreide database. U ontvangt vervolgens direct een pdf-exemplaar per e-mail.
Ban-Lan-Gen-granules verminderen de door dextran-natriumsulfaat geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen door de darmmicrobiota te moduleren en de intestinale SCFA-afgeleide GLP-1-productie te herstellen.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Peking University Shenzhen Hospital Department of Pharmacy, Shenzhen, Volksrepubliek China; 2Shenzhen University Health Science Center School of Pharmacy, Shenzhen, Volksrepubliek China; 3Guizhou Medical University Engineering Technology Research Center of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine Development and Application Ministry of Education, Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang, Volksrepubliek China; 4 Department of Gastroenterology, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Volksrepubliek China; 5 School of Pharmacy, Guizhou Medical University, State Key Laboratory of Medicinal Plant Function and Application, Guiyang; 6 Afdeling Laboratoriumgeneeskunde, Peking Universiteit Shenzhen Ziekenhuis, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Faculteit Farmacie, Guizhou Medische Universiteit, Guizhou, Volksrepubliek China, 550004, E-mail [email protected] Doel: GLP-1-therapie is een nieuwe behandelingsoptie voor inflammatoire darmziekten. Ban-Lan-Gen (BLG)-granulaten zijn een bekende antivirale TCM-formulering die potentiële ontstekingsremmende activiteit vertoont bij de behandeling van verschillende ontstekingsaandoeningen. Het ontstekingsremmende effect ervan op colitis en het werkingsmechanisme zijn echter nog onduidelijk. METHODEN: Het doel was om door dextran-natriumsulfaat (DSS) geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen te induceren. Ziekteactiviteitsindices, histologische markers van schade en niveaus van pro-inflammatoire cytokinen werden gebruikt om het beschermende effect van BLG te beoordelen. De effecten van BLG op de darmmicrobiota en de darm werden gekarakteriseerd door serum GLP-1-niveaus en colone Gcg, GPR41, en GRP43-expressie, samenstelling van de darmmicrobiota, fecale SCFA-niveaus en GLP-1-afgifte door primaire muizencolon-epitheelcellen, SCFA-afgeleide GLP-1-productie. Resultaten: BLG-behandeling verminderde significant gewichtsverlies, DAI, colonverkorting, colonweefselschade en de niveaus van pro-inflammatoire cytokinen TNF-α, IL-1β en IL-6 in het colonweefsel. Bovendien kan BLG-behandeling de colon-Gcg-, GPR41- en GRP43-expressie en de serum-GLP-1-niveaus bij muizen met colitis significant herstellen, door de SCFA-producerende bacteriën zoals Akkermansia en Prevotellaceae_UCG-001 te verhogen en de abundantie van bacteriën zoals Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas en Oscillibacter te verlagen. Daarnaast kan BLG-behandeling het SCFA-niveau in de feces van muizen met colitis significant verhogen. Tegelijkertijd toonden in vitro-experimenten ook aan dat het fecale extract van met BLG behandelde muizen de secretie van GLP-1 door primaire kleine muizencolon-epitheelcellen sterk kan stimuleren. Conclusie: Deze bevindingen suggereren dat BLG een anticolitis-effect heeft. BLG heeft de potentie om ontwikkeld te worden als therapie, althans gedeeltelijk door de darmmicrobiota te moduleren en de intestinale SCFA-afgeleide GLP-1-productie te herstellen. Veelbelovende geneesmiddelen voor chronische recidiverende colitis. Trefwoorden: colitis, Ban-Lan-Gen-granules, darmmicrobiota, korteketenvetzuren, GLP-1
Colitis ulcerosa (CU) is een chronische ontstekingsziekte van de dikke darm en het rectum, gekenmerkt door terugkerende diarree, buikpijn, gewichtsverlies en mucopurulente, bloederige ontlasting.¹ De prevalentie van CU is de laatste tijd toegenomen in landen waar de ziekte voorheen weinig voorkwam, waaronder China, als gevolg van de toenemende populariteit van de westerse levensstijl.² Deze toename vormt een groot probleem voor de volksgezondheid en heeft ernstige gevolgen voor het arbeidsvermogen en de kwaliteit van leven van patiënten. De pathogenese van CU is nog grotendeels onduidelijk, maar algemeen wordt aangenomen dat genetica, omgevingsfactoren, de darmmicrobiota en het immuunsysteem allemaal bijdragen aan de ontwikkeling van CU.³ Er bestaat nog steeds geen genezing voor CU en het doel van de behandeling is klinisch gezien het beheersen van de symptomen, het bereiken en behouden van remissie, het bevorderen van herstel van het slijmvlies en het verminderen van recidieven. Klassieke behandelingen omvatten aminosalicylaten, corticosteroïden, immunosuppressiva en biologicals. Deze geneesmiddelen bereiken echter niet altijd het gewenste effect vanwege hun diverse bijwerkingen.⁴ Recentelijk hebben veel casestudies aangetoond dat traditionele Chinese geneeskunde (TCM) een groot potentieel heeft bij de verlichting van colitis ulcerosa met een lage toxiciteit, wat suggereert dat de ontwikkeling van nieuwe TCM-therapieën een veelbelovende behandelingsstrategie is voor colitis ulcerosa.5-7
Banlangen Granules (BLG) is een traditioneel Chinees geneesmiddelpreparaat gemaakt van het waterige extract van de Banlangen-wortel.⁸ Naast de antivirale werking vertoont BLG ook potentiële ontstekingsremmende activiteit bij de behandeling van diverse ontstekingsaandoeningen.^9,10 Bovendien zijn glucosinolaten (R,S-goitrine, progoitrine, epiprorubine en glucoside) en nucleosiden (hypoxanthine, adenosine, uridine en guanosine) en indigo-alkaloïden zoals indigo en indirubine geïsoleerd en geïdentificeerd uit waterige extracten van Radix isatidis.^11,12 Eerdere studies hebben ruimschoots aangetoond dat de verbindingen adenosine, uridine en indirubine krachtige anticolitis-effecten vertonen in verschillende diermodellen van colitis.^13-17 Er zijn echter nog geen op bewijs gebaseerde studies uitgevoerd om de werkzaamheid van BLG bij colitis te evalueren. In deze studie onderzochten we het beschermende effect van BLG op dextran-natrium. Er werd onderzoek gedaan naar door sulfaat (DSS) geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij C57BL/6-muizen, en er werd vastgesteld dat orale toediening van BLG de door DSS geïnduceerde chronische recidiverende darmontsteking bij muizen significant verminderde. Ontsteking en de regulerende mechanismen ervan zijn geassocieerd met modulatie van de darmmicrobiota en herstel van de darmproductie van glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1).
BLG-granulaat (suikervrij, NMPA-goedgekeurd Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, China; batchnummer: 20110966) werd gekocht bij apotheken. DSS (moleculair gewicht: 36.000–50.000 Dalton) werd gekocht bij MP Biologicals (Santa Ana, VS). Sulfasalazine (SASP) (≥ 98% zuiverheid), hematoxyline en eosine werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS). Muizen TNF-α, IL-1β en IL-6 Luminex ELISA-assaykits werden gekocht bij R&D Systems (Minneapolis, MN, VS). Azijnzuur, propionzuur en boterzuur werden gekocht bij Aladdin Industries (Shanghai, China). 2-Ethylboterzuur werd gekocht bij Merck KGaA. (Darmstadt, Duitsland).
Mannelijke C57BL/6-muizen van 6-8 weken oud (lichaamsgewicht 18-22 g) werden gekocht bij Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, China) en gehuisvest in een omgeving van 22 ± 2 °C met een licht-donkercyclus van 12 uur. De muizen kregen een standaard knaagdierenvoer en hadden gedurende een week onbeperkt toegang tot drinkwater om te acclimatiseren aan de nieuwe omgeving. Vervolgens werden de muizen willekeurig verdeeld in vier groepen: controlegroep, DSS-modelgroep, SASP-behandelde groep (200 mg/kg, oraal) en BLG-behandelde groep (1 g/kg, oraal). Zoals weergegeven in Figuur 1A, werd volgens ons eerdere onderzoek experimentele chronische recidiverende colitis bij muizen geïnduceerd door drie cycli van 1,8% DSS gedurende 5 dagen, gevolgd door gedestilleerd water gedurende 7 dagen, volgens ons eerdere onderzoek.¹⁸ Muizen in de SASP- en BLG-behandelde groepen werden respectievelijk dagelijks behandeld met SASP en BLG, beginnend op dag 11. 0.Volgens voorlopige experimenten werd de dosis BLG vastgesteld op 1 g/kg. De dosis SASP werd daarentegen vastgesteld op 200 mg/kg, conform de literatuur.4 De controle- en DSS-modelgroepen ontvingen gedurende het hele experiment dezelfde hoeveelheid water.
Figuur 1 BLG verbetert DSS-geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen. (A) Experimenteel ontwerp van chronische recidiverende colitis en behandeling, (B) verandering in lichaamsgewicht, (C) score van de ziekteactiviteitsindex (DAI), (D) lengte van de dikke darm, (E) representatieve afbeelding van de dikke darm, (F) H&E-kleuring van de dikke darm (vergroting, ×100) en (G) histologische score. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 of ###p < 0,001 versus controlegroep (Con); *p < 0,05 of **p < 0,01 of ***p < 0,001 versus DSS-groep.
Het lichaamsgewicht, de consistentie van de ontlasting en rectaal bloedverlies werden dagelijks geregistreerd. De ziekteactiviteitsindex (DAI) werd bepaald door de scores van lichaamsgewicht, consistentie van de ontlasting en rectaal bloedverlies te combineren, zoals eerder beschreven.¹⁹ Aan het einde van het experiment werden alle muizen geëuthanaseerd en werden bloed, ontlasting en dikke darm verzameld voor verder onderzoek.
Darmweefsel werd gefixeerd met formaline en ingebed in paraffine. Er werden coupes van 5 micrometer dik gemaakt en gekleurd met hematoxyline-eosine (H&E), waarna ze blind werden beoordeeld en gescoord zoals eerder beschreven.¹⁹
Totale RNA uit colonweefsel werd geëxtraheerd met Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), gevolgd door cDNA-extractie met reverse transcriptase (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd met een real-time PCR-systeem met SYBR Green Master (Roche, Basel, Zwitserland). De transcripten van de doelgenen werden genormaliseerd ten opzichte van β-actine en de gegevens werden geanalyseerd met behulp van de 2-ΔΔCT-methode. De primersequenties voor de genen staan ​​vermeld in Tabel 1.
Primaire isolatie en kweek van epitheelcellen uit de dikke darm van muizen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven.²⁰ Kort gezegd werden de dikke darmen van 6-8 weken oude muizen eerst verwijderd na euthanasie door cervicale dislocatie, vervolgens in de lengte geopend, behandeld met Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, zonder calcium en magnesium) en in kleine stukjes van 0,5-1 mm gesneden. Vervolgens werden de weefsels verteerd met 0,4 mg/ml collagenase XI (Sigma, Poole, VK) in DMEM-medium en gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het pellet werd geresuspendeerd in DMEM-medium (aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 eenheden/ml penicilline en 100 µg/ml streptomycine) bij 37 °C en door een nylon gaas (poriegrootte ~250 µm) gehaald. Aliquoten van epitheelcellen uit de dikke darm werden in glazen schaaltjes geplaatst en geïncubeerd met azijnzuur, propionzuur, boterzuur en extracten van muizenuitwerpselen gedurende 2 uur bij 37°C, 5% CO2.
Darmweefsel werd gehomogeniseerd met PBS en de niveaus van de cytokinen IL-6, TNF-α en IL-1β in het darmweefsel werden bepaald met behulp van Luminex ELISA-kits (R&D Systems, Minneapolis, MN, VS). Op dezelfde manier werden de GLP-1-niveaus in serum en kweekmedium van primaire muizen-darm-epitheelcellen bepaald met een ELISA-kit (Bioswamp, Wuhan, China) volgens de instructies van de fabrikant.
Totaal DNA uit feces werd geëxtraheerd met behulp van een DNA-extractiekit (Tiangen, China). De kwaliteit en kwantiteit van het DNA werden gemeten aan de hand van de verhoudingen 260 nm/280 nm en 260 nm/230 nm, respectievelijk. Vervolgens werden, met elk geëxtraheerd DNA als template, specifieke primers 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) en 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) gebruikt om de V3-V4-regio's van het 16S rRNA-gen in verschillende gebieden te amplificeren. PCR-producten werden gezuiverd met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Duitsland), gekwantificeerd door middel van real-time PCR en gesequenced met behulp van het Illumina Miseq PE300-sequencingplatform (Illumina Inc., CA, VS). Voor bio-informatische analyse werd de gegevensverwerking uitgevoerd volgens eerder gerapporteerde protocollen.21,22 Kort gezegd, gebruik Cutadapt (V1.9.1) om ruwe expressie te filteren. De OTU's werden geclusterd met behulp van UPARSE (versie 7.0.1001) met een gelijkenisdrempel van 97%, en UCHIME werd gebruikt om chimere sequenties te verwijderen. De analyse en classificatie van de gemeenschapssamenstelling werden uitgevoerd met behulp van de RDP-classificator (http://rdp.cme.msu.edu/) op basis van de SILVA-database met ribosomale RNA-genen.
De concentraties van kortketenige vetzuren (azijnzuur, propionzuur en boterzuur) werden gemeten zoals eerder beschreven door Tao et al., met enkele aanpassingen.²³ Kort gezegd werden eerst 100 mg feces gesuspendeerd in 0,4 ml gedemineraliseerd water, gevolgd door 0,1 ml 50% zwavelzuur en 0,5 ml 2-ethylboterzuur (interne standaard), waarna het mengsel werd gehomogeniseerd en verwarmd tot 4 °C. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 12.000 tpm bij 25 °C. Het supernatant werd geëxtraheerd met 0,5 ml ether en geïnjecteerd in de GC voor analyse. Voor gaschromatografische (GC) analyse werden de monsters geanalyseerd met behulp van een GC-2010 Plus gaschromatograaf (Shimadzu, Inc.) uitgerust met een vlamionisatiedetector (FID). Scheiding werd bereikt met behulp van een ZKAT-624 kolom, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Gegevens werden verzameld met behulp van GC Solution software (Shimadzu, Inc.). De splitverhouding was 10:1, het draaggas was stikstof en de stroomsnelheid was 6 ml/min. Het injectievolume was 1 μl. De temperatuur van de injector en detector was 300 °C. De oventemperatuur werd gedurende de tijd op 140 °C gehouden. 13,5 minuten, vervolgens verhoogd tot 250 °C met een snelheid van 120 °C/min; de temperatuur werd gedurende 5 minuten aangehouden.
De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). De significantie van de gegevens werd beoordeeld met een eenweg-ANOVA, gevolgd door de meervoudige bereiktoets van Duncan. Voor alle berekeningen werd GraphPad Prism 5.0-software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, VS) gebruikt en een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Het is algemeen bekend dat colitis ulcerosa (UC) een chronische, recidiverende vorm van colitis is met ernstige buikpijn, diarree en bloedingen. Daarom werd DSS-geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen opgezet om de anticolitis-werkzaamheid van BLG te evalueren (Fig. 1A). Vergeleken met de controlegroep hadden muizen in de DSS-modelgroep een significant lager lichaamsgewicht en een hogere DAI-score, en deze veranderingen werden significant omgekeerd na 24 dagen BLG-behandeling (Figuur 1B en C). Verkorting van de dikke darm is een belangrijk kenmerk van UC. Zoals weergegeven in Figuur 1D en E, was de lengte van de dikke darm van muizen die DSS kregen significant verkort, maar werd deze verlicht door BLG-behandeling. Vervolgens werd histopathologisch onderzoek uitgevoerd om de ontsteking van de dikke darm te beoordelen. H&E-gekleurde beelden en pathologische scores toonden aan dat DSS-toediening de architectuur van de dikke darm significant verstoorde en resulteerde in cryptvernietiging, terwijl BLG-behandeling de cryptvernietiging en de pathologische scores significant verminderde (Figuur 1F en G). Opmerkelijk is het beschermende effect van BLG bij Een dosis van 1 g/kg was vergelijkbaar met die van SASP bij een dosis van 200 mg/kg. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat BLG effectief is in het verminderen van de ernst van DSS-geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen.
TNF-α, IL-1β en IL-6 zijn belangrijke ontstekingsmarkers voor darmontsteking. Zoals weergegeven in figuur 2A, induceerde DSS een significante toename in de genexpressie van TNF-α, IL-1β en IL-6 in de dikke darm vergeleken met de controlegroep. Toediening van BLG kan deze door DSS veroorzaakte veranderingen significant omkeren. Vervolgens gebruikten we ELISA om de niveaus van de inflammatoire cytokinen TNF-α, IL-1β en IL-6 in het darmweefsel te bepalen. De resultaten toonden ook aan dat de niveaus van TNF-α, IL-1β en IL-6 in de dikke darm significant verhoogd waren bij muizen die met DSS waren behandeld, terwijl behandeling met BLG deze verhogingen verminderde (figuur 2B).
Figuur 2. BLG remt de genexpressie en productie van de pro-inflammatoire cytokinen TNF-α, IL-1β en IL-6 in de dikke darm van met DSS behandelde muizen. (A) Genexpressie van TNF-α, IL-1β en IL-6 in de dikke darm; (B) eiwitniveaus van TNF-α, IL-1β en IL-6 in de dikke darm. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 of ##p < 0,01 of ###p < 0,001 versus controlegroep (Con); *p < 0,05 of **p < 0,01 versus DSS-groep.
Darmdysbiose speelt een cruciale rol in de pathogenese van colitis ulcerosa (UC).²⁴ Om te onderzoeken of BLG de darmmicrobiota van met DSS behandelde muizen moduleert, werd 16S rRNA-sequencing uitgevoerd om de bacteriële gemeenschap van de darminhoud te analyseren. Het Venn-diagram laat zien dat de drie groepen 385 OTU's delen. Tegelijkertijd had elke groep unieke OTU's (Fig. 3A). Bovendien toonden de Chao1-index en de Shannon-index in Figuur 3B en C aan dat de diversiteit van de darmmicrobiota afnam bij met BLG behandelde muizen, aangezien de Shannon-index significant daalde in de met BLG behandelde groep. Hoofdcomponentenanalyse (PCA) en hoofdcoördinatenanalyse (PCoA) werden gebruikt om clusteringpatronen tussen de drie groepen te bepalen en toonden aan dat de gemeenschapsstructuur van met DSS behandelde muizen duidelijk gescheiden was na behandeling met BLG (Figuur 3D en E). Deze gegevens suggereren dat behandeling met BLG de gemeenschapsstructuur van muizen met DSS-geïnduceerde colitis significant beïnvloedde.
Figuur 3. BLG verandert de diversiteit van de darmmicrobiota bij muizen met DSS-geïnduceerde colitis. (A) Venn-diagram van OTU, (B) Chao1-index, (C) Shannon-rijkdomindex, (D) Principal Component Analysis (PCA)-scoreplot van OTU, (E) OTU Principal Coordinate Analysis (PCoA)-score. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 6). **p < 0,01 versus DSS-groep.
Om specifieke veranderingen in de fecale microbiota te beoordelen, analyseerden we de samenstelling van de darmmicrobiota op alle taxonomische niveaus. Zoals weergegeven in Figuur 4A, waren de belangrijkste fyla in alle groepen Firmicutes en Bacteroidetes, gevolgd door Verrucomicrobia. De relatieve abundantie van Firmicutes en de Firmicutes/Bacteroidetes-ratio's waren significant verhoogd in de fecale microbiële gemeenschappen van DSS-behandelde muizen in vergelijking met controlemuizen, en deze veranderingen werden significant omgekeerd na BLG-behandeling. In het bijzonder verhoogde BLG-behandeling de relatieve abundantie van Verrucobacterium in de feces van muizen met DSS-geïnduceerde colitis significant. Op het niveau van de stam werden de fecale microbiële gemeenschappen bezet door Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae en Prevotellaceae (Fig. 4B). In vergelijking met de DSS-groep verhoogde de afname van BLG de abundantie van Akkermansiaceae, maar verlaagde de abundantie van Lachnospiriaceae en Ruminococcaceae. Opvallend is dat de fecale microbiota op genusniveau werd gedomineerd door Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia en Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Deze bevinding toonde ook aan dat de BLG-behandeling de microbiota-onbalans als reactie op DSS-uitdaging effectief herstelde, gekenmerkt door een afname van Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas en Oscillibacter, en een toename van Akkermansia en Prevotellaceae_UCG-001.
Figuur 4. BLG verandert de abundantie van de darmmicrobiota bij muizen met DSS-geïnduceerde colitis. (A) Abundantie van de darmmicrobiota op fylum-niveau; (B) Abundantie van de darmmicrobiota op familie-niveau; (C) Abundantie van de darmmicrobiota op genus-niveau. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 6). #p < 0,05 of ###p < 0,001 versus controlegroep (Con); *p < 0,05 of **p < 0,01 of ***p < 0,001 versus DSS-groep.
Gezien het feit dat kortketenige vetzuren (SCFAs) de belangrijkste metabolieten zijn van Akkermansia en Prevotellaceae_UCG-001, terwijl acetaat, propionaat en butyraat de meest voorkomende SCFAs in het darmlumen zijn, 25-27 bevinden we ons nog steeds in ons onderzoek. Zoals weergegeven in Figuur 5, waren de fecale concentraties van acetaat, propionaat en butyraat significant verlaagd in de met DSS behandelde groep, terwijl de BLG-behandeling deze verlaging grotendeels kon tegengaan.
Figuur 5. BLG verhoogt de niveaus van SCFAs in de ontlasting van muizen met DSS-geïnduceerde colitis. (A) Azijnzuurgehalte in de ontlasting; (B) propionzuurgehalte in de ontlasting; (C) boterzuurgehalte in de ontlasting. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 6). #p < 0,05 of ##p < 0,01 versus controlegroep (Con); *p < 0,05 of **p < 0,01 versus DSS-groep.
We hebben vervolgens de Pearson-correlatiecoëfficiënt berekend tussen differentiële SCFA op genusniveau en fecale microbiota. Zoals weergegeven in Figuur 6, was Akkermansia positief gecorreleerd met de productie van propionzuur (Pearson = 0,4866) en boterzuur (Pearson = 0,6192). Daarentegen waren zowel Enteromonas als Oscillobacter negatief geassocieerd met de acetaatproductie, met Pearson-coëfficiënten van respectievelijk 0,4709 en 0,5104. Evenzo was Ruminococcaceae_UCG-014 negatief gecorreleerd met de productie van propionzuur (Pearson = 0,4508) en boterzuur (Pearson = 0,5842).
Figuur 6 Pearson-correlatieanalyse tussen differentiële SCFAs en darmmicroben. (A) Enteromonas met azijnzuur; (B) Concussion bacillus met azijnzuur; (C) Akkermansia versus propionzuur; (D) Ruminococcus_UCG-014 met propionzuur; (E) Akkermansia met boterzuur; (F) Ruminococcus_UCG-014 met boterzuur.
Glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) is een celtype-specifiek post-translationeel product van proglucagon (Gcg) met ontstekingsremmende eigenschappen.²⁸ Zoals weergegeven in Figuur 7, induceerde DSS een significante afname van de Gcg mRNA-expressie. Behandeling van de dikke darm en BLG kon de door DSS geïnduceerde Gcg-reductie significant omkeren in vergelijking met de controlegroep (Fig. 7A). Tegelijkertijd was het GLP-1-niveau in het serum significant verlaagd in de met DSS behandelde groep, en behandeling met BLG kon deze reductie grotendeels voorkomen (Fig. 7B). Aangezien korteketen vetzuren de GLP-1-secretie kunnen stimuleren via activering van G-proteïne-gekoppelde receptor 43 (GRP43) en G-proteïne-gekoppelde receptor 41 (GRP41), onderzochten we ook GRP41 en GRP43 in de dikke darm van muizen met colitis en vonden we dat de mRNA-expressie van GRP43 en GRP41 in de dikke darm significant was verlaagd na DSS-behandeling. uitdaging, en BLG-behandeling kon deze afnames effectief herstellen (Figuur 7C en D).
Figuur 7. BLG verhoogt de serum-GLP-1-spiegel en de mRNA-expressie van Gcg, GPR41 en GRP43 in de dikke darm van met DSS behandelde muizen. (A) Gcg mRNA-expressie in dikkedarmweefsel; (B) GLP-1-spiegel in serum; (C) GPR41 mRNA-expressie in dikkedarmweefsel; (D) GPR43 mRNA-expressie in dikkedarmweefsel. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 of ##p < 0,01 versus controlegroep (Con); *p < 0,05 versus DSS-groep.
Omdat BLG-behandeling de serum-GLP-1-spiegel, de colon-Gcg-mRNA-expressie en de fecale SCFA-spiegel bij DSS-behandelde muizen kon verhogen, onderzochten we verder de invloed van acetaat, propionaat en butyraat op de afgifte van GLP-1 uit primaire muizencolon-epitheelcellen, evenals van controlemuizen (F-Con), DSS-colitismuizen (F-Con) en BLG-behandelde colitismuizen (F-BLG). Zoals weergegeven in Figuur 8A, stimuleerden primaire muizencolon-epitheelcellen behandeld met respectievelijk 2 mM azijnzuur, propionzuur en boterzuur de GLP-1-afgifte significant, in overeenstemming met eerdere studies.29,30 Evenzo stimuleerden alle F-Con, F-DSS en F-BLG (equivalent aan 0,25 g feces) de afgifte van GLP-1 uit primaire muizencolon-epitheelcellen aanzienlijk. Opvallend is dat de hoeveelheid GLP-1 die vrijkomt uit F-DSS-behandelde primaire muizencolon-epitheelcellen... De hoeveelheid epitheelcellen was veel lager dan die van met F-Con en F-BLG behandelde primaire epitheelcellen van de dikke darm van muizen (Figuur 8B). Deze gegevens suggereren dat de BLG-behandeling de door SCFA's uit de darmen geproduceerde GLP-1 aanzienlijk herstelde.
Figuur 8. Door BLG afgeleide SCFA stimuleert de afgifte van GLP-1 uit primaire epitheelcellen van de dikke darm van muizen. (A) Azijnzuur, propionzuur en boterzuur stimuleerden de afgifte van GLP-1 uit primaire epitheelcellen van de dikke darm van muizen; (B) fecale extracten F-Con, F-DSS en F-BLG stimuleerden primaire epitheelcellen van de dikke darm van muizen. Hoeveelheid vrijgekomen GLP-1. Porties epitheelcellen van de dikke darm werden in petrischalen met glazen bodem geplaatst en behandeld met respectievelijk 2 mM azijnzuur, propionzuur, boterzuur en fecale extracten F-Con, F-DSS en F-BLG (equivalent aan 0,25 g feces). 2 uur bij 37°C, 5% CO2, respectievelijk. De hoeveelheid GLP-1 die vrijkomt uit primaire epitheelcellen van de dikke darm van muizen werd gedetecteerd met behulp van ELISA. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM (n = 3). #p < 0,05 of ##p < 0,01 versus blanco of F-Con; *p < 0,05 versus F-DSS.
Afkortingen: Ace, azijnzuur; Pro, propionzuur; however, boterzuur; F-Con, fecale extract van controlemuizen; F-DSS, fecale extract van muizen met colitis; F-BLG, fecale extracten van met BLG behandelde dikke darm van muizen met ontstekingen.
Colitis ulcerosa staat door de Wereldgezondheidsorganisatie aangemerkt als een moeilijk te behandelen ziekte en vormt een wereldwijd gevaar. Effectieve methoden voor het voorspellen, voorkomen en behandelen van de ziekte zijn echter nog steeds beperkt. Daarom is er een dringende behoefte aan het onderzoeken en ontwikkelen van nieuwe, veilige en effectieve therapeutische strategieën voor colitis ulcerosa (UC). Traditionele Chinese geneesmiddelen zijn een veelbelovende optie, omdat veel traditionele Chinese geneesmiddelen al eeuwenlang effectief zijn gebleken bij de behandeling van UC in de Chinese bevolking. Bovendien zijn het allemaal biologische organische stoffen en natuurlijke materialen die grotendeels onschadelijk zijn voor mens en dier.31,32 Deze studie had als doel een veilig en effectief traditioneel Chinees geneesmiddel te vinden voor de behandeling van UC en het werkingsmechanisme ervan te onderzoeken. BLG is een bekende Chinese kruidenformule die gebruikt wordt bij de behandeling van griep.8,33 Onderzoek in ons laboratorium en elders heeft aangetoond dat indigo, een bewerkt traditioneel Chinees geneesmiddel gemaakt van dezelfde grondstof als BLG, een significante werkzaamheid vertoont bij de behandeling van UC bij mens en dier.4,34 De anticolitis-effecten van BLG en het werkingsmechanisme ervan zijn echter onduidelijk. In de huidige studie tonen onze resultaten aan dat BLG de door DSS geïnduceerde ontsteking van de dikke darm effectief vermindert. wat verband houdt met de modulatie van de darmmicrobiota en het herstel van de door de darmen geproduceerde GLP-1.
Het is algemeen bekend dat colitis ulcerosa (UC) wordt gekenmerkt door terugvallen met typische klinische kenmerken, zoals gewichtsverlies, diarree, rectale bloedingen en uitgebreide beschadiging van het colonslijmvlies.³⁵ Daarom werd chronische recidiverende colitis geïnduceerd door drie cycli van 1,8% DSS gedurende vijf dagen toe te dienen, gevolgd door zeven dagen drinkwater. Zoals weergegeven in Figuur 1B, duidden fluctuerend gewichtsverlies en DAI-scores op een succesvolle inductie van chronische recidiverende colitis. Muizen in de groep behandeld met BLG vertoonden vanaf dag 8 een verbetering van het herstel, wat significant verschilde van dag 24. Dezelfde veranderingen werden ook waargenomen in de DAI-score, wat wijst op een verbetering van de klinische toestand van de colitis. Wat betreft colonbeschadiging en ontstekingsstatus, waren de colonlengte, de schade aan het colonweefsel en de genexpressie en productie van de pro-inflammatoire cytokinen TNF-α, IL-1β en IL-6 in het colonweefsel ook sterk verbeterd na behandeling met BLG. Samenvattend tonen deze resultaten duidelijk aan dat BLG effectief is bij de behandeling van chronische colitis ulcerosa. Terugkerende colitis bij muizen.
Hoe oefent BLG zijn farmacologische effecten uit? Talrijke eerdere studies hebben aangetoond dat de darmmicrobiota een sleutelrol speelt in de pathogenese van colitis ulcerosa (UC), en op het microbioom gebaseerde en op het microbioom gerichte therapieën zijn naar voren gekomen als een zeer aantrekkelijke strategie voor de behandeling van UC. In de huidige studie hebben we aangetoond dat behandeling met BLG resulteerde in significante veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota, wat suggereert dat het beschermende effect van BLG tegen DSS-geïnduceerde colitis verband houdt met modulatie van de darmmicrobiota. Deze observatie is consistent met het idee dat het herprogrammeren van de homeostase van de darmmicrobiota een belangrijke benadering is om de werkzaamheid van TCM-preparaten te begrijpen.36,37 Met name Akkermansia is een Gram-negatieve en strikt anaërobe bacterie die leeft in de slijmlaag van de darm, waar het mucines afbreekt, propionzuur produceert, de differentiatie van slijmproducerende cellen stimuleert en het slijmvlies in stand houdt. functie van de barrière-integriteit.26 Meerdere klinische en diergegevens suggereren dat Akkermansia sterk geassocieerd is met een gezond slijmvlies,38 en orale toediening van Akkermansia spp. kan de ontsteking van het slijmvlies aanzienlijk verbeteren.39 Onze huidige gegevens suggereren dat de relatieve abundantie van Akkermansia significant toeneemt na behandeling met BLG. Daarnaast is Prevotellaceae_UCG-001 een SCFA-producerende bacterie.27 Verschillende studies hebben aangetoond dat Prevotellaceae_UCG-001 in lage relatieve abundantie werd aangetroffen in de ontlasting van dieren met colitis.40,41 Onze huidige gegevens tonen ook aan dat behandeling met BLG de relatieve abundantie van Prevotellaceae_UCG-001 in de dikke darm van met DSS behandelde muizen significant kan verhogen. Oscillibacter daarentegen is een mesofiele, strikt anaërobe bacterie.42 Er werd gerapporteerd dat de relatieve abundantie van Oscillibacter significant was toegenomen bij muizen met colitis ulcerosa en significant positief gecorreleerd was met IL-6- en IL-1β-niveaus en pathologische scores.43,44 Opvallend is dat behandeling met BLG de relatieve abundantie van Oscillibacter in de ontlasting van met DSS behandelde muizen significant verminderde. BLG-gemodificeerde bacteriën produceerden de meeste SCFA's. Talrijke eerdere studies hebben de potentiële gunstige effecten van SCFA's op darmontsteking en de bescherming van de integriteit van het darmepitheel aangetoond.45,46 Onze huidige gegevens laten ook zien dat de concentraties van SCFA-acetaat, propionaat en butyraat in DSS-behandelde ontlasting sterk verhoogd waren bij BLG-behandelde muizen. Samengevat tonen deze bevindingen duidelijk aan dat BLG-behandeling de door DSS geïnduceerde SCFA-producerende bacteriën effectief kan versterken bij muizen met chronische recidiverende colitis.
GLP-1 is een incretine die voornamelijk in het ileum en de dikke darm wordt geproduceerd en een belangrijke rol speelt bij het vertragen van de maaglediging en het verlagen van de postprandiale bloedglucose.47 Er zijn aanwijzingen dat dipeptidylpeptidase (DPP)-4, een GLP-1-receptoragonist, en een GLP-1-nanomedicijn darmontsteking bij muizen effectief kunnen verlichten.48-51 Zoals gerapporteerd in eerdere studies, werden hoge SCFA-concentraties geassocieerd met plasma-GLP-1-spiegels bij mensen en muizen.52 Onze huidige gegevens tonen aan dat na BLG-behandeling de serum-GLP-1-spiegels en de Gcg-mRNA-expressie significant waren verhoogd. Evenzo was de GLP-1-secretie significant verhoogd in colonculturen na stimulatie met fecale extracten van met BLG behandelde colitismuizen in vergelijking met stimulatie met fecale extracten van met DSS behandelde colitismuizen. Hoe beïnvloeden SCFA's de afgifte van GLP-1? Gwen Tolhurst et al. Er is gerapporteerd dat SCFA de GLP-1-secretie kan stimuleren via GRP43 en GPR41.29 Onze huidige gegevens tonen ook aan dat BLG-behandeling de mRNA-expressie van GRP43 en GPR41 in de dikke darm van DSS-behandelde muizen significant verhoogt. Deze gegevens suggereren dat BLG-behandeling de door SCFA bevorderde GLP-1-productie kan herstellen door GRP43 en GPR41 te activeren.
BLG is een geneesmiddel dat al lange tijd zonder recept verkrijgbaar is in China. De maximaal verdraagbare dosis BLG bij Kunming-muizen is 80 g/kg, en er is geen acute toxiciteit waargenomen.53 Momenteel is de aanbevolen dosis BLG (zonder suiker) bij mensen 9-15 g/dag (3 keer per dag). Onze studie toonde aan dat BLG bij 1 g/kg de door DSS geïnduceerde chronische recidiverende colitis bij muizen verbeterde. Deze dosis ligt dicht bij de klinisch gebruikte BLG-dosis. Onze studie wees ook uit dat het werkingsmechanisme, ten minste gedeeltelijk, wordt gemedieerd door veranderingen in de darmmicrobiota, met name SCFA-producerende bacteriën, zoals Akkermansia en Prevotellaceae_UCG-001, om de door de darm geproduceerde GLP-1 te herstellen. Deze bevindingen suggereren dat BLG verder onderzoek verdient als een potentieel therapeutisch middel voor de klinische behandeling van colitis. Het exacte mechanisme waarmee het de darmmicrobiota moduleert, moet echter nog worden bevestigd door middel van microbiota-deficiënte muizen en fecale bacteriële transplantatie.
Ace, azijnzuur; but, boterzuur; BLG, pandan; DSS, dextran-natriumsulfaat; DAI, ziekteactiviteitsindex; DPP, dipeptidylpeptidase; FID, vlamionisatiedetector; F-Con, controle fecale extracten van muizen; F-DSS, fecale extracten van DSS-colitismuizen; F-BLG, fecale extracten van BLG-behandelde colitismuizen; GLP-1, glucagon-achtig peptide-1; Gcg, glucagon; gaschromatografie, gaschromatografie; GRP43, G-proteïne-gekoppelde receptor 43; GRP41, G-proteïne-gekoppelde receptor 41; H&E, hematoxyline-eosine; HBSS, Hanks' Balanced Salt Solution; OTC, OTC; PCA, principale componentenanalyse; PCoA, principale coördinatenanalyse; Pro, propionzuur; SASP, sulfasalazine; SCFA, korteketen vetzuren; Chinese geneeskunde, traditionele Chinese geneeskunde; UC, colitis ulcerosa.
Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van het Peking University Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, China) in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en voorschriften voor dierproeven (ethisch nummer A2020157).
Alle auteurs hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan de conceptie en het ontwerp, de gegevensverzameling of de data-analyse en -interpretatie; hebben meegewerkt aan het opstellen van het artikel of het kritisch herzien van belangrijke inhoudelijke aspecten; hebben ingestemd met de indiening van het manuscript bij dit tijdschrift; hebben de definitieve versie voor publicatie goedgekeurd; en zijn verantwoordelijk voor alle aspecten van het werk.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81560676 en 81660479), het eersteklas project van de Universiteit van Shenzhen (86000000210), het Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026), het Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 en A2020272), het Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province Key Laboratory (YWZJ2020-01) en het Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Therapeutisch potentieel van triptolide als ontstekingsremmend middel bij door dextran-natriumsulfaat geïnduceerde experimentele colitis bij muizen. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. De wereldwijde ziektelast van IBD: van 2015 tot 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue, et al. Plantaardige alkaloïden: veelbelovende ziektemodificatoren bij inflammatoire darmziekten. Prepharmacology. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis remt oxidatieve stress in de dikke darm en Th1/Th17-reacties bij DSS-geïnduceerde colitis bij muizen. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Werkzaamheid en veiligheid van het Chinese kruidengeneesmiddel Sophora flavescens (Sophora flavescens) bij de behandeling van colitis ulcerosa: klinisch bewijs en mogelijke mechanismen. Prepharmacology. 2020;11:603476. doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Natuurlijke producten: experimenteel effectieve geneesmiddelen voor de behandeling van inflammatoire darmziekten. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Reflecties over de adjuvante behandeling van colitis ulcerosa met traditionele Chinese geneeskunde. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Werkzaamheid en veiligheid van Banlangen-granulaat bij de behandeling van seizoensgriep: een studieprotocol voor een gerandomiseerde, gecontroleerde studie. trial.2015;16:126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x