Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
In tegenstelling tot gewervelde dieren wordt algemeen aangenomen dat insecten geen mannelijk-georiënteerde geslachtssteroïdehormonen bezitten. Bij Anopheles gambiae lijkt het ecdyson-steroïde 20-hydroxyecdyson (20E) geëvolueerd te zijn om de eierontwikkeling te reguleren wanneer het door vrouwtjes wordt gesynthetiseerd² en om een ​​paringsresistente periode te induceren wanneer het seksueel wordt overgedragen door mannetjes³. Aangezien eierontwikkeling en paring essentiële reproductieve eigenschappen zijn, kan inzicht in hoe vrouwelijke Anopheles-muggen deze hormonale signalen integreren, het ontwerp van nieuwe malaria-bestrijdingsprogramma's vergemakkelijken. Hier onthullen we dat deze reproductieve functies worden gereguleerd door verschillende geslachtssteroïden via een complex netwerk van ecdysteroïd-activerende/inactiverende enzymen. We identificeerden een mannelijk-specifiek geoxideerd ecdyson, 3-dehydro-20E (3D20E), dat het ouderschap beschermt door de seksuele ontvankelijkheid van vrouwtjes uit te schakelen na seksuele overdracht en activering door defosforylering. Opvallend is dat de overdracht van 3D20E ook de expressie van reproductieve genen induceerde die de eierontwikkeling tijdens de paring in stand houden. Plasmodium-infectie, waarbij de gezondheid van geïnfecteerde vrouwtjes wordt gewaarborgd. Het door vrouwtjes geproduceerde 20E wekt geen seksuele respons op, maar stelt parende individuen in staat eieren te leggen nadat de 20E-remmende kinases zijn geremd. De identificatie van dit mannelijke, specifieke steroïde hormoon bij insecten en de rol ervan in de regulering van de seksuele ontvankelijkheid, vruchtbaarheid en interactie met Plasmodium bij vrouwtjes suggereert de mogelijkheid om het reproductieve succes van malariamuggen te verminderen.
Het aantal gevallen en sterfgevallen door malaria neemt weer toe⁴ als gevolg van wijdverspreide insecticideresistentie bij Anopheles-muggen, de enige vector van malariaparasieten bij de mens. De paringsbiologie van deze muggen is een bijzonder aantrekkelijk doelwit voor nieuwe interventies ter bestrijding van malaria, omdat vrouwtjes slechts één keer paren⁵; het steriel maken van deze ene paring zou een grote potentie hebben om de muggenpopulaties in het veld te verminderen.
Vrouwen raken seksueel gehandicapt na het ontvangen van hoge concentraties steroïde hormonen van mannen. Studies hebben aangetoond dat de trigger voor problemen met verdere paring 20-hydroxyecdyson (20E) is, een steroïde hormoon dat beter bekend staat als regulator van de vervellingscyclus in het larvenstadium. Het vermogen van mannetjes om 20E te synthetiseren en over te dragen is specifiek geëvolueerd in Anopheles-soorten die deel uitmaken van het subgenus Cellia7, dat verspreid is in Afrika en de gevaarlijkste vectoren van malaria omvat, waaronder Anopheles gambiae. Dit is vooral opmerkelijk omdat vrouwtjes in deze soorten ook 20E produceren na elke bloedmaaltijd, en 20E de oogenesecyclus aandrijft (zie ref. 8). Er is echter weinig bekend over de manier waarop vrouwtjes signalen van twee verschillende bronnen van ecdyson (overdracht door mannetjes en inductie van bloedvoeding) integreren zonder hun eigen vermogen tot paring in gevaar te brengen. Sterker nog, als de door de vrouwtjes geproduceerde 20E seksuele intolerantie veroorzaakt, zal dit leiden tot onvruchtbaarheid bij maagdelijke individuen die zich voeden, een zeer veelvoorkomend gedrag bij deze muggen5.
Een mogelijke verklaring is dat A. gambiae-mannetjes een gemodificeerd, mannelijk-specifiek ecdyson overdragen, dat een signaalcascade in het vrouwelijke voortplantingskanaal activeert, wat resulteert in instabiliteit van de paring. Hoewel gewervelde dieren meerdere steroïde hormonen hebben, zoals oestrogeen en androgeen (zie overzicht in ref. 9), zijn er voor zover wij weten nog geen androgeen-georiënteerde steroïden bij insecten geïdentificeerd.
We wilden het repertoire aan steroïdehormonen in de mannelijke accessoire klier (MAG) van seksueel volwassen A. gambiae bepalen, op zoek naar mogelijke modificerende steroïden. Door gebruik te maken van hogedruk-vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandem-massaspectrometrie (HPLC-MS/MS) in plaats van de minder specifieke methode die eerder werd gebruikt, detecteerden we ecdyson (E) en 20E in dit weefsel, waarmee we eerdere resultaten bevestigden. Het monster werd echter gedomineerd door geoxideerde gefosforyleerde steroïden, consistent met de formule 3-dehydro-20E-22-fosfaat (3D20E22P)12 (Figuur 1). Andere vormen zijn onder andere 3-dehydro-20E (3D20E) en 20E-22-fosfaat (20E22P). De HPLC-MS/MS-signaalintensiteit van 3D20E22P was twee ordes van grootte hoger dan die van de gedefosforyleerde vorm, 3D20E, en drie ordes van grootte hoger dan die van E en 20E (Figuur 1). Hoewel in andere delen van het lichaam en het onderste voortplantingskanaal (LRT; Extended Data Fig. 1a). We analyseerden ook ecdysteroïden in pas gesloten (<1 dag oude) mannetjes en vrouwtjes en detecteerden 3D20E en 3D20E22P alleen in MAG; E, 20E en 20E22P waren aanwezig in beide geslachten (Extended Data Fig. 1b). Deze gegevens suggereren dat volwassen mannetjes van A. gambiae hoge titers van modificerende hormonen in hun MAG's produceren die niet door vrouwtjes worden gesynthetiseerd.
MAG en vrouwelijke LRT (inclusief boezems, zaadblaasjes en parovarium) werden gedissecteerd van 4 dagen oude (4 dagen oude) maagdelijke mannetjes en maagdelijke en gepaarde vrouwtjes (0,5, 3 en 12 uur na paring). Ecdyson in deze weefsels werd geanalyseerd met HPLC-MS/MS (gemiddelde ± standaardfout; ongepaarde t-test, tweezijdig, gecorrigeerd voor valse ontdekkingen (FDR); NS, niet significant; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 uur versus 0,5 uur, P = 0,035; 12 uur versus 3 uur, P = 0,0015; 12 uur versus 0,5 uur, P = 0,030. 3D20E22P: 3 uur versus 0,5 uur, P = 0,25; 12 uur vs. 3 uur, P = 0,0032; 12 uur vs. 0,5 uur, P = 0,015). De gegevens zijn afkomstig van drie biologische replicaten. Het piekoppervlak voor elke ecdyson van belang werd berekend en genormaliseerd door het aantal muggen. Ecdyson wordt als volgt weergegeven met kleuren: E, groen; 20E, oranje; 20E22P, paars; 3D20E, blauw; 3D20E22P, roze. De inzet vergroot de schaal op de y-as om lagere ecdysonniveaus weer te geven.
Om te onderzoeken of 3D20E22P en 3D20E tijdens de paring worden overgedragen, hebben we de LRT's van vrouwtjes op verschillende tijdstippen na de paring ontleed. Hoewel ecdyson niet werd aangetroffen bij maagdelijke vrouwtjes, observeerden we aanzienlijke hoeveelheden 3D20E22P in de LRT direct na de paring (0,5 uur na de paring, hpm), die in de loop van de tijd afnamen, terwijl de 3D20E-niveaus significant toenamen (Fig. 1). Met behulp van chemisch gesynthetiseerde 3D20E als standaard bepaalden we dat de niveaus van dit steroïde hormoon in de LRT's tijdens de paring minstens 100 keer hoger waren dan die van 20E (Uitgebreide gegevenstabel 1). 3D20E22P is dus de belangrijkste mannelijke ecdyson die tijdens de paring naar de vrouwelijke LRT wordt overgedragen, en de gedefosforyleerde vorm ervan, 3D20E, wordt kort na de paring zeer overvloedig aanwezig. Dit suggereert een belangrijke rol voor de laatstgenoemde ecdyson in de post-paringsfase van het vrouwtje. biologie.
Na het genereren van een nieuwe RNA-sequencing (RNA-seq) dataset (Fig. 2a), met behulp van een op maat gemaakte bio-informatica-pipeline, zochten we naar ecdysonkinase (EcK), ecdysonoxidase (EO) en het gen voor ecdyson-coderend 20E-gemodificeerd fosfatase (EPP). EPP wordt tot expressie gebracht in voortplantingsweefsels. We identificeerden één kandidaat-EPP-gen en twee potentiële EcK-genen (EcK1 en EcK2), maar konden geen goed kandidaat-EO-gen vinden. Opvallend is dat individuele EPP-genen op een hoog niveau tot expressie werden gebracht (98,9e percentiel) in Gambiaanse MAG's, maar niet in vrouwelijke LRT's (Fig. 2b), in tegenstelling tot onze verwachtingen, aangezien defosforylering van 3D20E22P plaatsvond in dit vrouwelijke weefsel. Daarom denken we dat mannelijk EPP tijdens de paring kan worden overgedragen. We gebruikten inderdaad in vivo stabiele isotopenlabeling om het vrouwelijke eiwit na de paring te maskeren, een enzym dat werd geïdentificeerd door MS in het vrouwelijke atrium (Fig. 2c en aanvullende tabel 1). De aanwezigheid van EPP in MAG en gepaarde (maar niet maagdelijke) vrouwelijke LRT werd ook bevestigd met behulp van specifieke antilichamen (Fig. 2d).
a, Een op maat gemaakte bio-informatica-pipeline om de voortplantingsweefsels van elk geslacht te doorzoeken naar genen die coderen voor EcK's, EO's en EPP's. De getallen naast de pijlen geven het aantal mannelijke en vrouwelijke kandidaten in elke stap aan. Deze analyse identificeerde één EPP-gen (EPP) en één EcK-gen (EcK1) die tot expressie komen bij mannetjes, en één EcK-gen (EcK2) dat tot expressie komt bij beide geslachten, maar geen kandidaat-EO-gen opleverde. b, Heatmap die de expressie van kandidaat-genen vergelijkt in maagdelijke (V) en parende (M) Anopheles gambiae- en Anopheles albicans-weefsels. Spca, bevruchting; MAGs, accessoire klieren bij mannetjes; andere delen van het lichaam, waaronder borsten, vleugels, poten, vetlichamen en inwendige organen bij beide geslachten, en eierstokken bij vrouwtjes. EcK2 wordt sterk tot expressie gebracht in zowel MAG als de boezems van Gambia, terwijl EPP alleen in MAG wordt gevonden. c, Proteomische analyse van de translocatie van mannelijke ejaculaatgroepen naar vrouwelijke boezems na 3, 12 en 24 uur, met de 67 meest voorkomende eiwitten. Vrouwtjes werden grootgebracht op een dieet met 15N om alle eiwitten te labelen (en te maskeren). Niet-gelabelde mannetjes werden gepaard met gelabelde vrouwtjes, en de LRT's van vrouwtjes werden gedissecteerd na 3, 12 en 24 uur voor proteomische analyse (zie Aanvullende Tabel 1 voor een volledige lijst van ejaculatorische eiwitten). Inzet: EPP, Eck1 en EcK2 werden gedetecteerd in de MAG van maagdelijke mannetjes door proteomische analyse van deze weefsels. d, EPP werd gedetecteerd door western blot in MAG en LRT van gepaarde vrouwtjes, maar Niet bij maagdelijke vrouwtjes of mannetjes of de rest van het vrouwelijk lichaam. Membranen werden gelijktijdig onderzocht met anti-actine (laadcontrole) en anti-EPP-antilichamen. Alle mannetjes zijn maagd. Zie Aanvullende Figuur 1 voor gelbrongegevens. Western blots werden tweemaal uitgevoerd met vergelijkbare resultaten.
De ecdysteroïde fosfofosfatase-activiteit van EPP werd geverifieerd na incubatie met 3D20E22P, geïsoleerd uit MAG, door middel van HPLC-MS/MS (Extended Data Fig. 2a). Bovendien detecteerden we, toen we EPP uitschakelden door middel van RNA-gemedieerde interferentie (RNAi), een sterke afname van de fosfatase-activiteit in de voortplantingsweefsels van deze mannetjes (Fig. 3a). Vrouwtjes die gepaard hadden met mannetjes waarbij EPP was uitgeschakeld, vertoonden een significant lager aandeel gedefosforyleerd 3D20E (Fig. 3b), ondanks gedeeltelijke gen-silencing (Extended Data Fig. 2b,c). Daarentegen detecteerden we geen significante veranderingen in de 20E22P/20E-verhouding in dezelfde muggen, wat erop zou kunnen wijzen dat het enzym specifiek is voor 3D20E22P (Fig. 3b).
a, Verminderde fosfatase-activiteit in MAG veroorzaakt door EPP-silencing met behulp van dubbelstrengs EPP-RNA (dsEPP) of dubbelstrengs GFP-RNA (dsGFP) als controle. Twintig MAG-pools werden gebruikt in elke replicatie (P = 0,0046, gepaarde t-test, tweezijdig), weergegeven door afzonderlijke stippen. b, Vrouwtjes die gepaard waren met EPP-gesilenceerde mannetjes hadden een significant lager aandeel gedefosforyleerd 3D20E na 3 uur (P = 0,0043, ongepaarde t-test, tweezijdig), terwijl de 20E-niveaus niet werden beïnvloed (P = 0,063, ongepaard). t-test, tweezijdig). De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van drie groepen van respectievelijk 13, 16 en 19 vrouwtjes. c, Vrouwtjes die gepaard hadden met EPP-uitgeschakelde mannetjes vertoonden significant hogere percentages herhaalde paring (P = 0,0002, Fisher's exacte toets, tweezijdig). Vrouwtjes werden eerst gedwongen te paren om hun paringsstatus te garanderen; Twee dagen later werden ze in contact gebracht met andere mannetjes die transgeen sperma droegen om de herparingspercentages te beoordelen door middel van kwantitatieve PCR-detectie van het transgen. Vrouwtjes die bloed hadden gedronken en gepaard hadden met EPP-uitgeschakelde mannetjes vertoonden een significant verminderde vruchtbaarheid (P < 0,0001; Mann-Whitney-toets, tweezijdig) en een licht verminderd aantal eieren (P = 0,088, Mann-Whitney-toets, tweezijdig), terwijl de paaifrequentie niet werd beïnvloed (P = 0,94, Fisher's exacte toets, tweezijdig). In alle panelen staat n voor het aantal biologisch onafhankelijke muggenmonsters. NS, niet significant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Vervolgens onderzochten we of de defosforylering van ecdyson belangrijk is voor het induceren van paringsresistentie bij vrouwtjes. Opvallend is dat vrouwtjes die gepaard hadden met EPP-arme mannetjes veel vaker opnieuw paarden (44,9%) dan controlevrouwtjes (10,4%) wanneer ze werden blootgesteld aan extra (transgene) mannetjes (Fig. 3c). We observeerden ook een significante afname van de vruchtbaarheid (Fig. 3d, links) en een lichte afname van het aantal gelegde eieren door deze vrouwtjes (Fig. 3d, midden), terwijl het percentage gelegde eieren (een andere reactie die bij vrouwtjes wordt opgewekt door paring) niet werd beïnvloed (Fig. 3d, rechts). Gezien de waargenomen specificiteit van EPP voor 3D20E22P, suggereren deze resultaten dat de activering van 3D20E door EPP dat tijdens de paring wordt overgedragen, een belangrijke rol kan spelen bij het uitschakelen van de ontvankelijkheid van vrouwtjes voor verdere paring, een gedrag dat eerder werd toegeschreven aan de seksuele overdracht van 20E. Daarom suggereert deze mannelijke-specifieke reactie dat de activering van 3D20E door EPP dat tijdens de paring wordt overgedragen, een belangrijke rol kan spelen bij het uitschakelen van de ontvankelijkheid van vrouwtjes voor verdere paring. Hormonen hebben ook een sterke invloed op de vruchtbaarheid van vrouwen.
Vervolgens vergeleken we de activiteit van 20E en 3D20E in injectie-experimenten bij seksueel rijpe maagden met behulp van chemisch gesynthetiseerde 3D20E (Fig. 4a–c) en commercieel verkrijgbare 20E. We observeerden dat 3D20E significant effectiever was dan 20E in het uitschakelen van de gevoeligheid van vrouwtjes voor paring bij beide concentraties (Fig. 4d). Opvallend is dat de helft van het fysiologische niveau van 3D20E in de LRT (1.066 pg na injectie versus 2.022 pg na paring) een percentage refractaire vrouwtjes induceerde dat 20 keer hoger was dan het fysiologische niveau van 20E (361 pg na injectie) 24 uur na injectie bij de hoogste concentratie van 18 pg na paring; Uitgebreide gegevenstabel 1). Dit resultaat is consistent met de gedachte dat seksuele overdracht van 20E geen paringsrefractaire perioden veroorzaakt, en wijst er verder op dat 3D20E een belangrijke factor is in het waarborgen van de ouder-kindrelatie. 3D20E was ook significant actiever dan 20E in eierlegproeven bij maagdelijke vrouwtjes (Fig. 4e), wat suggereert dat de normale eierlegfrequentie die we waarnamen na gedeeltelijke EPP-onderdrukking te danken was aan de aanwezigheid van residuele 3D20E-activiteit die nog steeds werd geproduceerd door paringsgeïnduceerde vrouwelijke factoren.
(a,b) 3D20E chemisch gesynthetiseerd uit 20E (a) met een zeer hoge conversie/efficiëntie (gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van drie onafhankelijke synthesereacties) (b).c, Massaspectrum (onderste helft) komt exact overeen met ecdyson gevonden in de LRT van gepaarde vrouwtjes (bovenste helft).d, Vergeleken met 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's exacte toets, tweezijdig) en 10% ethanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fisher's exacte toets, tweezijdig), terwijl 20E alleen bij hogere doses significant hoger was dan de controle (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fisher's exacte toets, tweezijdig).e, 3D20E-injectie induceerde significant hogere paaisnelheden bij maagdelijke vrouwtjes dan 10% ethanol-controles (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fisher's exacte toets, tweezijdig), terwijl 20E vergeleken met controles alleen bij hogere doses (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fisher's exacte toets, tweezijdig).3D20E induceerde significant hogere paaisnelheden dan 20E bij hogere doses (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fisher's exacte toets, tweezijdig).In alle panelen vertegenwoordigt n het aantal biologisch onafhankelijke muggen monsters.NS, niet significant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. De gegevens zijn afkomstig van drie herhalingen.
In eerdere studies hebben we vastgesteld dat de seksuele overdracht van steroïde hormonen de expressie induceert van MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenese 11), een vrouwelijk voortplantingsgen dat A. gambiae-vrouwtjes beschermt tegen infectie met P. falciparum 13, de dodelijkste malariaparasiet bij de mens. Gezien het belang van MISO voor de reproductieve fitheid van Anopheles in malaria-endemische gebieden, besloten we te bepalen welk hormoon, 3D20E of 20E, de expressie van dit gen triggert. We ontdekten dat injectie met 20E specifiek of krachtiger bepaalde nucleaire hormoonreceptoren (HR), zoals HR3 en HR4, en typische downstream steroïde targets, zoals de yolkogene genen Vg14, 15 en 16, induceerde, terwijl MISO sterker werd geïnduceerd door 3D20E (Extended Data Fig. 3). De seksuele overdracht van dit androgene steroïde hormoon lijkt dus mechanismen te induceren die vrouwtjes beschermen tegen de ziekte. kosten die gepaard gaan met parasitaire infectie. Bovendien beïnvloedt 3D20E beide isovormen van de E-receptor EcR op een differentiële manier, waarbij EcR-A wordt geïnduceerd en EcR-B wordt onderdrukt, en andere paringsinducerende genen, waaronder HPX15, sterker worden geactiveerd, wat de vruchtbaarheid van vrouwtjes beïnvloedt. Dit zou de significante onvruchtbaarheid kunnen verklaren die wordt waargenomen bij vrouwtjes die gepaard zijn met EPP-gesilenceerde mannetjes (Extended Data Fig. 3). Deze gegevens suggereren het bestaan ​​van downstream-routes die bij voorkeur worden geactiveerd door twee ecdysonhormonen en die mogelijk ten grondslag liggen aan geslachtsspecifieke functies.
Vervolgens testten we de functie van de twee EcK-genen die in onze bio-informatica-pipeline waren geïdentificeerd. Het uitschakelen van EcK1 of EcK2 resulteerde in significante sterfte bij mannetjes (Extended Data Fig. 4a), wat suggereert dat ecdysonfosforylering, en daarmee inactivatie, belangrijk is voor overleving. Omdat EcK2 in hogere mate tot expressie kwam dan EcK1 en in MAG's werd gedetecteerd door middel van proteomics (Fig. 2b,c en aanvullende tabel 2), valideerden we de ecdysteroïdekinase-activiteit door het te incuberen met 20E, wat resulteerde in fosforylering 20E22P (Extended Data Fig. 2b). Bij gebruik van 3D20E als substraat konden we het gefosforyleerde product 3D20E22P niet detecteren (Extended Data Fig. 4c), wat suggereert dat 20E in plaats van 3D20E mogelijk het geprefereerde doelwit is van EcK2.
Volgens onze RNA-seq-analyse werd EcK2 ook sterk tot expressie gebracht in de LRT van maagdelijke vrouwtjes, waar het na de paring werd uitgeschakeld (Fig. 2b). We bevestigden deze gegevens en stelden vast dat de EcK2-expressie niet werd beïnvloed door bloedvoeding (Extended Data Fig. 5a). Door onze initiële MS-experimenten uit te breiden, bepaalden we dat de piek van 20E22P nauw verband hield met de piek van 20E (22-26 uur na de bloedmaaltijd; Extended Data Fig. 5b). Het uitschakelen van EcK2 bij maagdelijke vrouwtjes resulteerde in een drievoudige toename van de relatieve verhouding van 20E tot 20E22P 26 uur na de bloedmaaltijd (Extended Data Figuren 2c en 5c), wat bevestigt dat EcK2 ook 20E fosforyleert bij vrouwtjes. Opvallend is dat maagdelijke vrouwtjes met een verlaagd EcK2-gehalte hun volledige seksuele ontvankelijkheid behielden (Extended Data Fig. 5d,e), wat verder suggereert dat de productie van 20E door vrouwtjes geen inductie van de eisprong veroorzaakt. paringsrefractaire perioden. Deze vrouwtjes hadden echter significant hogere eierlegfrequenties vergeleken met de controlegroep, waarbij meer dan 30% van de maagdelijke vrouwtjes eieren legde (Extended Data Fig. 5f). Als injecties met dubbelstrengs Eck2 RNA (dsEcK2) werden uitgevoerd na het bloedzuigen, vond er geen paai plaats, waarbij de 20E-piek als gevolg van bloedinname was afgenomen. Over het geheel genomen ondersteunen deze resultaten een model dat 20E, geproduceerd na bloedzuigen, paai kan induceren, maar alleen wanneer de paaiblokkade (EcK2 en mogelijk andere factoren) wordt opgeheven door de paring. Noch 20E- noch 3D20E-injecties remden de EcK2-expressie bij maagdelijke vrouwtjes (Extended Data Fig. 5g), wat suggereert dat andere factoren de remming van deze kinase mediëren. De 20E-niveaus na het bloedzuigen waren echter niet voldoende om paringsongemak te veroorzaken, maar werden wel effectief getriggerd door hoge titers van seksueel overgedragen 3D20E.
Onze resultaten bieden belangrijke inzichten in de mechanismen die het reproductieve succes van A. gambiae reguleren. Er is een model ontstaan ​​waarin mannetjes geëvolueerd zijn om hoge titers van 3D20E te synthetiseren, een mannelijk-specifiek gemodificeerd ecdyson dat ouderschap verzekert door vrouwtjes ongevoelig te maken voor verdere paring. Tegelijkertijd hebben deze malariamuggen ook een efficiënt systeem ontwikkeld om 3D20E bij vrouwtjes te activeren als reactie op de seksuele overdracht van mannelijk-specifieke EPP. Voor zover wij weten, is dit het eerste voorbeeld van een door mannetjes en vrouwtjes gedomineerd steroïdehormoonsysteem dat een unieke en cruciale functie vervult bij insecten. Een mannelijk-specifieke ecdysonfunctie is gepostuleerd, maar nog niet definitief aangetoond. Een grotendeels weerlegde hypothese 18 is bijvoorbeeld dat deze functies mogelijk worden uitgevoerd door de 20E-precursor E1. Het is bekend dat bij Drosophila monandrie wordt getriggerd door de seksuele overdracht van kleine sekspeptiden19,20 die interageren met neuronen die het vrouwelijke voortplantingskanaal innerveren via specifieke sekspeptidereceptoren21,22. Verder onderzoek is nodig om de stroomafwaartse signaalcascades te bepalen die door 3D20E in A. gambiae-vrouwtjes worden gecontroleerd en om te bepalen of deze cascades behouden blijven tussen muggen en Drosophila.
Gezien de belangrijke rol van 3D20E op de vruchtbaarheid en het gedrag van vrouwtjes, zoals in ons onderzoek is vastgesteld, bieden de routes die leiden tot de synthese en activering van 3D20E nieuwe mogelijkheden voor toekomstige strategieën ter bestrijding van muggen, zoals het genereren van concurrerende steriele mannetjes in steriele insectentechnologieën voor gebruik in het wild of om 3D20E na te bootsen bij de paring van maagdelijke muggen. De mannelijke-specifieke functie van 3D20E is mogelijk geëvolueerd toen A. gambiae en andere Cellia-soorten het vermogen verwierven om hun sperma te laten stollen tot paringspropjes, aangezien dit de efficiënte overdracht van grote aantallen hormonen en hormoonactiverende enzymen mogelijk maakt. Op zijn beurt biedt de evolutie van 3D20E, die monandrie implementeert, een mechanisme voor vrouwtjes (via een hoge expressie van MISO) om hun reproductieve fitheid te bevorderen in gebieden met een hoge malaria-prevalentie, wat indirect bijdraagt ​​aan de overdracht van Plasmodium. Aangezien is aangetoond dat vrouwelijke 20E een diepgaand effect heeft op de overleving en groei van P. falciparum in vrouwelijke Anopheles-muggen,24 zowel mannelijke als vrouwelijke En de signaalroutes van vrouwelijke steroïdehormonen zijn nu belangrijke aspecten van de interactie tussen muggen en parasieten.
A. gambiae G3-stammen werden gekweekt onder standaardomstandigheden voor insecten (26-28 °C, 65-80% relatieve luchtvochtigheid, 12:12 uur licht/donker fotoperiode). Larven werden gevoed met visvoer in poedervorm (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets en Tetra Pond Sticks in een verhouding van 7:7:2). Volwassen muggen werden ad libitum gevoed met een 10% dextroseoplossing en wekelijks met menselijk bloed (bloedcomponenten voor onderzoek). Onbevruchte muggen werden verkregen door de geslachten te scheiden in het popstadium na microscopisch onderzoek van de uiteinden. Mannetjes met het DsRed-transgen zijn eerder beschreven.
Gedwongen paringsexperimenten werden uitgevoerd volgens eerder beschreven protocollen. Voor natuurlijke paring werden 4 dagen oude maagdelijke vrouwtjes twee nachten lang in een verhouding van 1:3 gehouden met seksueel rijpe maagdelijke mannetjes. Voor experimenten waarbij mannetjes werden geïnjecteerd met dsEPP, viel het samen in kooien samen met dag 3-4 na de injectie, wanneer de fosfataseactiviteit maximaal was onderdrukt (Extended Data Fig. 2b).
Muggenweefsels, overgebleven kadavers (rest van het lichaam) of hele lichamen werden gedissecteerd in 100% methanol en gehomogeniseerd met een kralenmolen (2 mm glaskralen, 2400 tpm, 90 sec). De hoeveelheden weefsel en de methanolvolumes waren als volgt: rest van het lichaam, 50 in 1000 µl; MAG, 50–100 in 80 µl; vrouwelijke LRT, 25–50 in 80 µl. Het precipitaat werd onderworpen aan een tweede methanolextractie met hetzelfde volume methanol. Celresten werden verwijderd door centrifugatie. De methanol van beide extracties werd samengevoegd en gedroogd onder een stroom stikstof, waarna het werd geresuspendeerd in de volgende volumes 80% methanol in water: rest van het lichaam, 50 µl; MAG's en vrouwelijke LRT, 30 µl.
De monsters werden geanalyseerd met een massaspectrometer (ID-X, Thermo Fisher) gekoppeld aan een LC-instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl monster werd geïnjecteerd op een kolom van 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) die op 25 °C werd gehouden. De mobiele fasen voor de LC waren A (water, 0,1% mierenzuur) en B (acetonitril, 0,1% mierenzuur). Het LC-gradiënt was als volgt: 5% B gedurende 1 minuut, vervolgens verhoogd tot 100% B over 11 minuten. Na 8 minuten op 100% werd de kolom opnieuw geëquilibreerd met 5% B gedurende 4 minuten. De stroomsnelheid was 0,3 ml min⁻¹. Ionisatie in de MS-bron werd bereikt door verhitte elektrospray-ionisatie in positieve en negatieve modus.
De massaspectrometer meet gegevens in het m/z-bereik van 350 tot 680 met een resolutie van 60.000 in de volledige MS-modus. MS/MS-gegevens werden verzameld op [M + H]+ (alle targets), [M - H2O + H]+ (alle targets) en [M - H]- (gefosforyleerde targets). MS/MS-gegevens werden gebruikt om de ecdyson-eigenschappen te bevestigen van targets waarvoor geen standaard beschikbaar was. Om niet-targeted ecdysteroïden te identificeren, werden MS/MS-gegevens van alle HPLC-pieken met een relatieve abundantie van >15% geanalyseerd. Kwantificering werd uitgevoerd met behulp van standaardcurven gemaakt van zuivere standaarden (20E, 3D20E) om absolute hoeveelheden te berekenen, of verdunningen van één specifiek monster (alle andere targets) om hun equivalentie te berekenen met de hoeveelheden die in één mannetje werden aangetroffen. Voor 3D20E werd kwantificering uitgevoerd met behulp van de som van de volgende adducten: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. De gegevens werden geëxtraheerd en gekwantificeerd met behulp van Tracefinder (versie 4.1). MS/MS-gegevens werden geanalyseerd met Xcalibur (versie 4.4). De MS-spectra van E, 20E en 3D20E werden vergeleken met de respectievelijke standaarden. 3D20E22P werd geanalyseerd door derivatisatie met Girard's reagens. 20E22P werd geanalyseerd op basis van de m/z-verhouding.
3D20E22P werd gezuiverd uit MAG. De zuivering werd uitgevoerd op analytische schaal met behulp van een ultra-performance vloeistofchromatograaf (Acquity, Waters) met een quadrupool massadetector (QDa, Acquity, Waters) onder dezelfde LC-condities als de HPLC-MS/MS-analyse. Fractieverzameling werd gestart wanneer de m/z-waarde die overeenkomt met 3D20E22P werd gedetecteerd op dezelfde retentietijd als eerder bepaald. De zuiverheid van de geëxtraheerde verbindingen werd vervolgens gecontroleerd met HPLC-MS/MS zoals hierboven beschreven.
Totale RNA werd geëxtraheerd uit 10-12 reproductieve weefsels of andere lichaamsdelen (zonder kop) met behulp van TRI-reagens (Thermo Fisher) volgens de instructies van de fabrikant. Het RNA werd behandeld met TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA werd gesynthetiseerd met behulp van Moloney murine leukemie virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) volgens de instructies van de fabrikant. Primers voor reverse transcriptie kwantitatieve PCR (RT-qPCR; Extended Data Tabel 2) werden eerder gepubliceerd24 of ontworpen met behulp van Primer-BLAST26, waarbij de voorkeur werd gegeven aan producten van 70-150 bp groot die exon-exon-overgangen overbruggen of primerparen die exonen scheiden. cDNA-monsters van drie tot vier biologische replicaten werden viermaal verdund in water voor RT-qPCR. Kwantificering werd uitgevoerd in replicareacties van 15 µl die 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers en 5 µl verdund cDNA. De reacties werden uitgevoerd op een QuantStudio 6 Pro real-time PCR-systeem (Thermo Fisher) en de gegevens werden verzameld en geanalyseerd met behulp van Design and Analysis (versie 2.4.3). Zoals in deze studie is aangetoond, werden de relatieve hoeveelheden genormaliseerd ten opzichte van het ribosomale gen RpL19 (AGAP004422), waarvan de expressie niet significant veranderde door bloedvoeding 27 of paring 3.
De RNA-kwaliteit werd gecontroleerd met een Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina paired-end-bibliotheken werden voorbereid en geanalyseerd bij het Broad Institute van MIT en Harvard. Sequentie-reads werden uitgelijnd met het A. gambiae-genoom (PEST-stam, versie 4.12) met behulp van HISAT2 (versie 2.0.5) met standaardparameters. Reads met een mapping quality (MAPQ)-score <30 werden verwijderd met Samtools (versie 1.3.1). Het aantal reads dat aan genen was gekoppeld, werd geteld met htseq-count (versie 0.9.1) met standaardparameters. Genormaliseerde read-aantallen werden berekend en differentiële genexpressie werd geanalyseerd met behulp van het DESeq2-pakket (versie 1.28.1) in R (versie 4.0.3).
Kandidaten voor ecdysonmodificerende genen werden geïdentificeerd door eerst het A. gambiae-genoom te doorzoeken met behulp van het PSI-BLAST-algoritme (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), met standaardwaarden voor de parameters en de volgende eiwitsequenties: van Bombyx mori (toegangsnummer NP_001038956.1), Musca domestica (toegangsnummer XP_005182020.1, XP_005175332.1 en XP_011294434.1) en Microplitis demolitor (toegangsnummer XP_008552646.1 en XP_008552645.1), EcK van B. mori (toegangsnummer NP_001036900) en Drosophila melanogaster (toegangsnummer NP_651202). Apis mellifera (toegangsnr. XP_394838) en Acyrthosiphon pisum (toegangsnr. XP_001947166); en EPP van B. mori (toegangsnr. XP_001947166) NP_001177919.1 en NP_001243996.1) en EO van D. melanogaster (toegangsnr. NP_572986.1) (stap 1). Vervolgens worden de resultaten gefilterd op basis van hoge mRNA-expressie (>100 fragmenten/kilobase exonen per miljoen gemapte reads (FPKM) of >85%) in reproductief weefsel (vrouwelijke LRT of MAG) in Gambia (stap 2). Om de specificiteit te verbeteren, selecteerden we kandidaat-enzymen die ook tot expressie komen in het voortplantingsweefsel van A. albimanus, een Anopheles-soort die tijdens de paring geen ecdyson synthetiseert of overdraagt. Kandidaatgenen werden gefilterd op basis van een lage expressie (<100 FPKM of <85e percentiel) in het voortplantingsweefsel van A. albimanus (stap 3). Als laatste filter (stap 4) moeten kandidaatgenen aan ten minste één van de volgende criteria voldoen: (1) significant opgereguleerd na de paring (P < 0,05) volgens de analyse van differentieel tot expressie gebrachte genen en (2) in niet-voortplantingsweefsels (< 85% of <100 FPKM).
We hebben eerder beschreven methoden 28,29,30 aangepast om isotopische labeling van het hele organisme te bereiken. Kort gezegd werd wildtype Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) getest in giststikstofbasis (BD Difco, DF0335) met (gew./vol.) 2% glucose (G7528, Sigma), 1,7% aminozuurvrij en ammoniumsulfaat. kweekmedium) en 5% 15N ammoniumsulfaat (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) als enige stikstofbron. De gist werd teruggewonnen door centrifugatie en muggenlarven werden ad libitum gevoed tot de verpopping. Supplementatie met vismeel (0,5 mg per 300 larven) werd toegepast om sterfte in het vierde larvenstadium te voorkomen. Alleen vrouwtjes werden vervolgens gebruikt in paringsexperimenten met ongelabelde mannetjes om het mannelijke proteoom te analyseren dat tijdens de paring werd overgedragen.
Vier tot zes dagen oude, met 15N gemerkte maagdelijke vrouwtjes werden gedwongen te paren met even oude, niet gemerkte maagdelijke mannetjes. Succesvolle paring werd geverifieerd door het detecteren van paringspluggen onder een epifluorescentiemicroscoop. Na 3, 12 en 24 uur werden de boezems van 45-55 gepaarde vrouwtjes gedissecteerd in 50 µl ammoniumbicarbonaatbuffer (pH 7,8) en gehomogeniseerd met een stamper. Het homogenaat werd gecentrifugeerd en het supernatant werd gemengd met 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) in 50 mM ammoniumbicarbonaat. Het supernatant en de pellet van elk monster werden direct ingevroren op droogijs en 's nachts verzonden naar het MacCoss-laboratorium aan de Universiteit van Washington, waar de monstervoorbereiding voor LC-MS/MS werd voltooid. Resuspendeer de pellet in 50 µl van 0,1% RapiGest in 50 mM ammoniumbicarbonaat en sonificatie in een waterbad. De eiwitconcentratie van het pellet en het supernatant werd gemeten met de BCA-assay. De monsters werden gereduceerd met 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), gealkyleerd met 15 mM jodoacetamide (Sigma) en gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd (1:0,50) met trypsinisatie (trypsine:substraatverhouding). RapiGest werd gelyseerd door toevoeging van 200 mM HCl, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 45 minuten en centrifugatie bij 14.000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 °C om celresten te verwijderen. De monsters werden gewassen met behulp van dual-mode solid-phase extraction (Oasis MCX cartridges, Waters) en geresuspendeerd in 0,1% mierenzuur voor een uiteindelijke eiwitconcentratie van 0,33 µg. µl-1. Ongelabelde MAG-proteomen werden op soortgelijke wijze geanalyseerd van maagdelijke mannetjes. Twee analytische replicaten werden voor elk monster geanalyseerd. Vervolgens werd 1 µg van elk geanalyseerd met behulp van een 25 cm lange gesmolten silicakolom met een poriegrootte van 75 µm en een 4 cm lange gesmolten silica Kasil1 (PQ) fritval gevuld met Jupiter C12 reversed-phase hars (Phenomenex) en 180 minuten vloeistofchromatografie. Monsteranalyses – MS/MS werd uitgevoerd op een Q-Exactive HF massaspectrometer (Thermo Fisher) met een nanoACQUITY UPLC-systeem (Waters). De acquisitiegegevens die voor elke run werden gegenereerd, werden geconverteerd naar mzML-formaat met behulp van Proteowizard (versie 3.0.20287) en Comet31 (versie 3.2) tegen de FASTA-database met eiwitsequenties van Anopheles gambiae (VectorBase versie 54), Anopheles coluzzi. Er werd gezocht in Mali-NIH (VectorBase versie 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, maart 2021), A. gambiae RNA-seq en drie-frame vertalingen van bekende menselijke contaminanten. De FDR's (False Discovery Rates) van de peptidekaarten werden bepaald met behulp van Percolator32 (versie 3.05) met een drempelwaarde van 0,01, en peptiden werden samengevoegd tot eiwitidentificaties met behulp van eiwitparsimonie. in Limelight33 (versie 2.2.0). De relatieve eiwitovervloed werd geschat met behulp van de genormaliseerde spectrale abundantiefactor (NSAF), berekend voor elk eiwit in elke run zoals eerder beschreven. De NSAF ten opzichte van elk eiwit werd gemiddeld over monsters van twee verschillende biologische replicaten. 15N-labeling maskeerde met succes het vrouwelijke proteoom, hoewel een kleine hoeveelheid ongelabeld eiwit kon worden gedetecteerd in de gelabelde maagden. We registreerden de detectie van mannelijke eiwitreductie (1-5 spectra) in vrouwelijke ruwe monsters alleen in technische runs, waarbij ruwe monsters werden geanalyseerd na mannelijke/paringsmonsters, als gevolg van HPLC-overdracht. Incidentele eiwitten die als 'verontreinigingen' werden aangetroffen in gelabelde maagden staan ​​vermeld in Aanvullende Tabel 1.
Twee antigene peptiden, QTTDRVAPAPDQQQ (binnen isotype PA) en MESDGTTPSGDSEQ (binnen isotype PA en PB) in Genscript. De twee peptiden werden gecombineerd, vervolgens geconjugeerd aan het dragereiwit KLH en geïnjecteerd in Nieuw-Zeelandse konijnen. De konijnen werden na de vierde injectie geofferd en de totale IgG werd geïsoleerd door middel van affiniteitszuivering. De IgG van het konijn met de meest EPP-specifieke reactie werd gebruikt voor verdere western blotting.
Voor western blots werden MAG (n = 10, waarbij n het aantal biologisch onafhankelijke muggenmonsters vertegenwoordigt) en vrouwelijke LRT (n = 30) van 4 dagen oude maagdelijke mannetjes en maagdelijke of gedwongen gepaarde vrouwtjes (<10 dagen na paring) afzonderlijk toegevoegd. Eiwitextractiebuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% natriumdeoxycholaat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteaseremmercocktail (Roche)) werd afzonderlijk toegevoegd. De monsters werden direct na dissectie gehomogeniseerd met een kralenmolen (2 mm glaskralen, 2400 rpm, 90 sec). Onoplosbaar materiaal werd verwijderd door centrifugatie bij 20.000 g bij 4 °C. De eiwitten werden gekwantificeerd met de Bradford-assay (Bio-Rad). Vervolgens werd 20 µg MAG-eiwit, 40 µg LRT-eiwit en 20 µg resterend bulkproteïne werden gedenatureerd en gescheiden door 10% Bis-Tris NuPAGE met MOPS-buffer. De proteïnen werden overgebracht naar polyvinylideenfluoride-membranen met behulp van het iBlot2-transfersysteem (Thermo Fisher). De membranen werden tweemaal gewassen in 1× PBS-T (0,1% Tween-20 in PBS) en vervolgens gedurende 1 uur bij 22 °C geblokkeerd in Odyssey-blokkeerbuffer (Li-Cor). De membranen werden een nacht bij 4 °C geschud met een op maat gemaakt polyklonaal konijn-anti-EPP-primair antilichaam (1:700 in blokkeerbuffer) en een monoklonaal rat-anti-actine-primair antilichaam MAC237 (Abeam; 1:4000). De membranen werden gewassen met PBS-T en vervolgens geïncubeerd met secundaire antilichamen (ezel-anti-konijn 800CW en geit-anti-rat 680LT (Li-Cor), beide 1:20.000) in blokkeerbuffer. De membranen werden gedurende 1 uur bij 22 °C geïncubeerd met een oplossing van 0,01% SDS en 0,2% Tween-20. Vervolgens werden de membranen gewassen met PBS-T en gescand met een Odyssey CLx scanner. De beelden werden verzameld en verwerkt in Image Studio (versie 5.2). Er werd geen specifieke band gedetecteerd die overeenkomt met het EPP-RA-isomeer (82 kDa).
De coderende gebieden van EPP (als isovorm AGAP002463-RB met histidinefosfatasedomein, NCBI-zoekopdracht naar geconserveerde domeinen 34) en EcK2 (AGAP002181) werden gekloneerd in het pET-21a(+) plasmide (Novagen Millipore Sigma); De primers staan ​​vermeld in Extended Data Tabel 2. Acht GS4-linkers (in tandem) werden ingevoegd vóór de C-terminale 6xHis-tag van het pET-21a(+)-EcK2-construct. Recombinante eiwitten werden geproduceerd met behulp van de NEBExpress celvrije E. coli-eiwitsynthesereactie (New England BioLabs). Recombinante eiwitten werden gezuiverd met behulp van NEBExpress Ni-spincolumns (New England BioLabs). Het dihydrofolaatreductase (DHFR)-controle-eiwit werd geproduceerd met behulp van een DNA-template uit de NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. De eiwitten werden maximaal 3 maanden bewaard in 50% glycerol in PBS bij -20 °C.
De fosfatase-activiteit van EPP en weefselextracten werd gemeten met behulp van 4-nitrofenylfosfaat (pNPP; Sigma-Aldrich). De reactiebuffer bevatte 25 mM Tris, 50 mM azijnzuur, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA en 1 mM DTT. Weefsel werd gehomogeniseerd in de reactiebuffer en celresten werden verwijderd door centrifugatie. De reactie werd gestart door enzym of weefselextract toe te voegen aan de reactiebuffer die 2,5 mg ml-1 pNPP bevatte. Het reactiemengsel werd bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd en de hoeveelheid pNP die uit pNPP was omgezet, werd gekwantificeerd door de absorptie bij 405 nm op verschillende tijdstippen te meten.
Voor de in vitro EcK-activiteit werd het eiwit geïncubeerd met 0,2 mg 20E of 3D20E in 200 µl buffer (pH 7,5) met 10 mM HEPES-NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP en 10 mM MgCl2 gedurende 2 uur bij 27 °C. De reactie werd gestopt door toevoeging van 800 µl methanol, waarna het mengsel gedurende 1 uur werd afgekoeld tot -20 °C en vervolgens gedurende 10 minuten bij 4 °C werd gecentrifugeerd met 20.000 g. Het supernatant werd vervolgens geanalyseerd met HPLC-MS/MS. Om de eiwitten in de controlegroep te inactiveren door verhitting, werden de eiwitten gedurende 20 minuten bij 95 °C geïncubeerd in 50% glycerol in PBS.
Voor de in vitro EPP-activiteit werd het eiwit geïncubeerd met 3D20E22P (equivalent aan de hoeveelheid die werd aangetroffen in 18 paren MAG, gezuiverd met HPLC-MS/MS) in 100 µl buffer (pH 7,5) met 25 mM Tris, 50 mM azijnzuur, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA en 1 mM DTT gedurende 3 uur bij 27 °C. De reactie werd gestopt door toevoeging van 400 µl methanol en gedurende 1 uur afgekoeld tot -20 °C, waarna gedurende 10 minuten bij 4 °C werd gecentrifugeerd met 20.000 g. Het supernatant werd geanalyseerd met HPLC-MS/MS.
PCR-fragmenten voor EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) en EcK2 (556 bp) werden geamplificeerd uit cDNA bereid uit onthoofde muggenlijken van beide geslachten. Het PCR-fragment van de eGFP-controle (495 bp) werd geamplificeerd uit de eerder beschreven pCR2.1-eGFP; De PCR-primers staan ​​vermeld in Tabel 2 van de uitgebreide gegevens. Het PCR-fragment werd ingevoegd tussen de geïnverteerde T7-promotors op het pL4440-plasmide. Plasmideconstructen werden verkregen uit competente NEB 5-α E. coli (New England Biolabs) en vóór gebruik geverifieerd door middel van DNA-sequencing (zie Aanvullende gegevens 1 voor de insertsequentie). Primers die overeenkomen met de T7-promotor (Tabel 2 van de uitgebreide gegevens) werden gebruikt om het insert van het op pL4440 gebaseerde plasmide te amplificeren. De grootte van het PCR-product werd bevestigd door middel van agarosegelelektroforese. dsRNA werd getranscribeerd van PCR-templates met behulp van de Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) en gezuiverd volgens de instructies van de fabrikant met de eerder beschreven aanpassingen.
Voor de dsRNA-injectie werd 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) geïnjecteerd met een concentratie van 10 ng nl-1 in de thorax van volwassen mannetjes of vrouwtjes (Nanoject III, Drummond) binnen 1 dag na het uitkomen. De mate van genonderdrukking werd bepaald in ten minste drie biologische replicaten door middel van RNA-extractie, cDNA-synthese en RT-qPCR. Voor de ecdyson-injectie werden 4 dagen oude maagdelijke of 6 dagen oude maagdelijke, met bloed gevoede vrouwtjes geïnjecteerd met 0,13, 0,21 of 0,63 µg 20E of 3D20E (Nanoject III, Drummond) met concentraties van respectievelijk 1,3, 2,1, afhankelijk van het experimentele ontwerp, of 6,3 ng nl-1. Injecteer 100 nl van 10% (vol/vol) ethanol in water; 100 nl 3D20E22P in 10% ethanol (gelijk aan 75% van de hoeveelheid die in een paar MAG's wordt aangetroffen). Muggen werden willekeurig toegewezen aan de injectiegroep.
Voor de paaiproeven werden 3 dagen oude vrouwtjes onbeperkt gevoed met menselijk bloed. Muggen die gedeeltelijk of niet gevoed waren, werden verwijderd. Afhankelijk van de behandeling werden de vrouwtjes gedurende vier nachten in aparte paaibekers geplaatst, minimaal 48 uur na de bloedmaaltijd. De eieren werden geteld onder een stereomicroscoop (Stemi 508, Zeiss); bij bevruchte vrouwtjes werden eieren die uitkwamen tot larven als vruchtbaar beschouwd.
Voor de paringsproeven kregen de vrouwtjes, afhankelijk van de behandeling, minimaal 2 dagen de tijd om resistentie tegen paring te ontwikkelen. Vervolgens werden wildtype mannetjes van dezelfde leeftijd in dezelfde kooi geplaatst. Twee nachten later werden de bevruchte blaasjes van de vrouwtjes gedissecteerd en werd het genomische DNA vrijgemaakt door vries-ontdooiing en sonificatie in een buffer die 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA en 25 mM NaCl (pH 8,2) bevatte. De monsters werden gedurende 15 minuten bij 55 °C geïncubeerd met Proteinase K (0,86 µg µl-1), gevolgd door 10 minuten bij 95 °C. De ruwe genomische DNA-preparaten werden 10 keer verdund en onderworpen aan qPCR-detectie van Y-chromosoomsequenties; de primers staan ​​vermeld in Tabel 2 van de uitgebreide gegevens. Afwezigheid van een Y-chromosoomsequentie duidt op geen paring.
Voor de herparingsproeven werden gedwongen gepaarde vrouwtjes onderzocht op de aanwezigheid van paringspluggen om de paringsstatus te bevestigen. Ze kregen vervolgens twee dagen de tijd om refractair te worden voor paring in afwezigheid van mannetjes, zoals eerder beschreven 36. Mannetjes met DsRed-transgeen sperma werden vervolgens in de kooien van de vrouwtjes geplaatst. Twee nachten later werden de bevruchtingsblaasjes uit de vrouwtjes verwijderd en werd genomisch DNA bereid zoals hierboven beschreven en onderworpen aan qPCR-detectie van het DsRed-transgeen; de primers staan ​​vermeld in Extended Data Tabel 2. De afwezigheid van het DsRed-transgeen gaf aan dat er geen herparing had plaatsgevonden.
3D20E werd gesynthetiseerd zoals eerder beschreven 37. Kort gezegd werd 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) opgelost in 10 ml water, waarna 30 mg platinazwart (in poedervorm, Sigma-Aldrich) werd toegevoegd. Een zachte stroom O2 werd continu door het reactiemengsel geleid, dat bij kamertemperatuur werd geroerd. Na 6 uur werd 30 ml methanol toegevoegd om de reactie te stoppen. Het mengsel werd gecentrifugeerd om katalysatordeeltjes te verwijderen. De supernatant werd onder vacuüm bij kamertemperatuur tot droogte verdampt. Het gedroogde reactieproduct werd opgelost in 10% ethanol en methanol voor injectie voor HPLC-MS/MS-analyse. De omzettingsgraad (van 20E naar 3D20E) was ongeveer 97% (Fig. 4b), en het MS-spectrum van de gesynthetiseerde 3D20E kwam overeen met dat van gepaarde vrouwtjes (Fig. 4c).
De legenda bevat specifieke details over de uitgevoerde statistische tests. GraphPad (versie 9.0) werd gebruikt voor het uitvoeren van de Fisher's exact test, de Mantel-Cox test en de Student's t-test. Cochran-Mantel-Haenszel tests werden uitgevoerd met behulp van een aangepast R-script (beschikbaar op https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). De normaliteit van de dataverdeling werd getest met de Shapiro-Wilk test met een significantiedrempel van 0,05. Indien de data niet aan de normaliteitstest voldeden, werd de Mann-Whitney test uitgevoerd. Overlevingsdata werden geanalyseerd met de Mantel-Cox test. Het DESeq2-pakket (versie 1.28.1) werd gebruikt voor het uitvoeren van RNA-seq gen-niveau differentiële expressieanalyse. De horizontale balk in de grafiek geeft de mediaan weer. Een significantiewaarde van P = 0,05 werd gebruikt als drempel voor alle tests.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie het abstract van het Nature Research Report dat aan dit artikel is gekoppeld.
MS-proteomische gegevens zijn gedeponeerd bij het ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) via de PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) met de dataset-identificatiecode PXD032157.
De RNA-seq-dataset is gedeponeerd in de Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) onder serienummer GSE198665.
Aanvullende datasets die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, kunnen op redelijk verzoek worden verkregen bij de betreffende auteurs. Dit artikel bevat de brongegevens.
De Loof, A. Ecdysteroïden: Verwaarloosde insectengeslachtssteroïden? Mannetjes: Zwarte Doos. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone en de ontwikkeling van de eierstokken bij Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).