Propionzuur (PPA), een antischimmelmiddel en veelgebruikt voedingsadditief, blijkt bij muizen een abnormale neuro-ontwikkeling te veroorzaken, gepaard gaande met gastro-intestinale disfunctie, mogelijk veroorzaakt door dysbiose in de darmen. Er is een verband gesuggereerd tussen blootstelling aan PPA via de voeding en dysbiose van de darmmicrobiota, maar dit is nog niet direct onderzocht. In deze studie onderzochten we PPA-gerelateerde veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota die tot dysbiose kunnen leiden. De darmmicrobiomen van muizen die een onbehandeld dieet (n=9) en een met PPA verrijkt dieet (n=13) kregen, werden geanalyseerd met behulp van long-range metagenomische sequencing om verschillen in microbiële samenstelling en bacteriële metabolische routes te beoordelen. PPA in de voeding bleek geassocieerd te zijn met een toename van de abundantie van belangrijke taxa, waaronder verschillende Bacteroides-, Prevotella- en Ruminococcus-soorten, waarvan leden eerder in verband zijn gebracht met de productie van PPA. De microbiomen van muizen die aan PPA waren blootgesteld, vertoonden ook meer routes gerelateerd aan lipidenmetabolisme en steroïdehormoonsynthese. Onze resultaten wijzen erop dat PPA de darmmicrobiota en de bijbehorende metabolische processen kan veranderen. Deze waargenomen veranderingen benadrukken dat conserveermiddelen die als veilig voor consumptie worden beschouwd, de samenstelling van de darmmicrobiota en daarmee de menselijke gezondheid kunnen beïnvloeden. Afhankelijk van het te analyseren classificatieniveau wordt P, G of S geselecteerd. Om de impact van vals-positieve classificaties te minimaliseren, werd een minimale drempelwaarde voor relatieve abundantie van 1e-4 (1/10.000 reads) gehanteerd. Voorafgaand aan de statistische analyse werden de door Bracken gerapporteerde relatieve abundanties (fraction_total_reads) getransformeerd met behulp van de gecentreerde log-ratio (CLR) transformatie (Aitchison, 1982). De CLR-methode werd gekozen voor datatransformatie omdat deze schaalinvariant is en geschikt voor niet-sparse datasets (Gloor et al., 2017). De CLR-transformatie maakt gebruik van de natuurlijke logaritme. De door Bracken gerapporteerde telgegevens werden genormaliseerd met behulp van de relatieve log-expressie (RLE) (Anders en Huber, 2010). De figuren werden gegenereerd met een combinatie van matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 en sequential logarithms (Gloor et al., 2017), 0.12.2 en stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). De Bacillus/Bacteroidetes-ratio werd voor elk monster berekend met behulp van genormaliseerde bacterietellingen. De waarden in de tabellen zijn afgerond op 4 decimalen. De Simpson-diversiteitsindex werd berekend met behulp van het alpha_diversity.py-script uit het KrakenTools v. 1.2-pakket (Lu et al., 2022). Het Bracken-rapport is opgenomen in het script en de Simpson-index "Si" wordt gebruikt voor de parameter -an. Significante verschillen in abundantie werden gedefinieerd als gemiddelde CLR-verschillen ≥ 1 of ≤ -1. Een gemiddeld CLR-verschil van ±1 duidt op een 2,7-voudige toename in de abundantie van een bepaald monstertype. Het teken (+/-) geeft aan of het taxon respectievelijk in het PPA-monster en het controlemonster overvloediger aanwezig is. De significantie werd bepaald met behulp van de Mann-Whitney U-test (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini en Hochberg, 1995; Seabold en Perktold, 2010) werd gebruikt en de Benjamini-Hochberg-procedure werd toegepast om te corrigeren voor meervoudige toetsing. Een aangepaste p-waarde ≤ 0,05 werd gebruikt als drempel voor het bepalen van statistische significantie.
Het menselijk microbioom wordt vaak "het laatste orgaan van het lichaam" genoemd en speelt een vitale rol in de menselijke gezondheid (Baquero en Nombela, 2012). Met name het darmmicrobioom staat bekend om zijn systemische invloed en rol in vele essentiële functies. Commensale bacteriën komen in grote aantallen voor in de darm, bezetten meerdere ecologische niches, benutten voedingsstoffen en concurreren met potentiële ziekteverwekkers (Jandhyala et al., 2015). Diverse bacteriële componenten van de darmmicrobiota zijn in staat essentiële voedingsstoffen zoals vitaminen te produceren en de spijsvertering te bevorderen (Rowland et al., 2018). Er is ook aangetoond dat bacteriële metabolieten de weefselontwikkeling beïnvloeden en metabolische en immuunroutes versterken (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). De samenstelling van het menselijk darmmicrobioom is extreem divers en hangt af van genetische en omgevingsfactoren zoals voeding, geslacht, medicatie en gezondheidstoestand (Kumbhare et al., 2019).
Het dieet van de moeder is een cruciaal onderdeel van de foetale en neonatale ontwikkeling en een mogelijke bron van stoffen die deze ontwikkeling kunnen beïnvloeden (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Een van deze interessante stoffen is propionzuur (PPA), een kortketenig vetzuur dat als bijproduct ontstaat bij bacteriële fermentatie en als voedingsadditief wordt gebruikt (den Besten et al., 2013). PPA heeft antibacteriële en schimmelwerende eigenschappen en wordt daarom gebruikt als voedselconserveermiddel en in industriële toepassingen om de groei van schimmels en bacteriën te remmen (Wemmenhove et al., 2016). PPA heeft verschillende effecten in verschillende weefsels. In de lever heeft PPA ontstekingsremmende effecten door de cytokine-expressie in macrofagen te beïnvloeden (Kawasoe et al., 2022). Dit regulerende effect is ook waargenomen in andere immuuncellen, wat leidt tot een vermindering van ontstekingen (Haase et al., 2021). In de hersenen is echter het tegenovergestelde effect waargenomen. Eerdere studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PPA autisme-achtig gedrag bij muizen induceert (El-Ansary et al., 2012). Andere studies hebben aangetoond dat PPA gliose kan veroorzaken en pro-inflammatoire routes in de hersenen kan activeren (Abdelli et al., 2019). Omdat PPA een zwak zuur is, kan het door het darmepitheel in de bloedbaan diffunderen en zo restrictieve barrières passeren, waaronder de bloed-hersenbarrière en de placenta (Stinson et al., 2019). Dit benadrukt het belang van PPA als regulerend metaboliet dat door bacteriën wordt geproduceerd. Hoewel de potentiële rol van PPA als risicofactor voor autisme momenteel wordt onderzocht, kunnen de effecten ervan op personen met autisme verder reiken dan alleen het induceren van neurale differentiatie.
Gastro-intestinale symptomen zoals diarree en constipatie komen vaak voor bij patiënten met neurodevelopmentele stoornissen (Cao et al., 2021). Eerdere studies hebben aangetoond dat het microbioom van patiënten met autismespectrumstoornissen (ASS) verschilt van dat van gezonde personen, wat wijst op de aanwezigheid van dysbiose van de darmmicrobiota (Finegold et al., 2010). Ook de microbioomkenmerken van patiënten met inflammatoire darmziekten, obesitas, de ziekte van Alzheimer, enzovoort, verschillen van die van gezonde personen (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Tot op heden is er echter geen causaal verband vastgesteld tussen het darmmicrobioom en neurologische aandoeningen of symptomen (Yap et al., 2021), hoewel wordt aangenomen dat verschillende bacteriesoorten een rol spelen bij sommige van deze aandoeningen. Zo komen geslachten zoals Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio en andere geslachten vaker voor in de microbiota van patiënten met autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Opvallend is dat van sommige soorten binnen deze geslachten bekend is dat ze genen bezitten die geassocieerd zijn met de productie van PPA (Reichardt et al., 2014; Yun en Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur en Dürre, 2023). Gezien de antimicrobiële eigenschappen van PPA, kan een verhoogde aanwezigheid ervan gunstig zijn voor de groei van PPA-producerende bacteriën (Jacobson et al., 2018). Een PFA-rijke omgeving kan dus leiden tot veranderingen in de darmmicrobiota, waaronder gastro-intestinale pathogenen, die potentiële factoren kunnen zijn die gastro-intestinale symptomen veroorzaken.
Een centrale vraag in microbioomonderzoek is of verschillen in microbiële samenstelling een oorzaak of een symptoom zijn van onderliggende ziekten. De eerste stap om de complexe relatie tussen voeding, het darmmicrobioom en neurologische aandoeningen te ontrafelen, is het beoordelen van de effecten van voeding op de microbiële samenstelling. Daarom hebben we met behulp van long-read metagenomische sequencing de darmmicrobiomen vergeleken van nakomelingen van muizen die een PPA-rijk of PPA-arm dieet kregen. De nakomelingen kregen hetzelfde dieet als hun moeders. We veronderstelden dat een PPA-rijk dieet zou leiden tot veranderingen in de microbiële samenstelling van de darm en in microbiële functionele pathways, met name die gerelateerd aan PPA-metabolisme en/of PPA-productie.
In deze studie werden FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgene muizen (Jackson Laboratories) gebruikt die groen fluorescerend eiwit (GFP) overexpressen onder controle van de glia-specifieke GFAP-promotor, volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) van de University of Central Florida (vergunningsnummer: PROTO202000002). Na het spenen werden de muizen individueel gehuisvest in kooien met 1-5 muizen van elk geslacht per kooi. De muizen kregen ad libitum ofwel een gezuiverd controledieet (aangepast open-label standaarddieet, 16 kcal% vet) ofwel een dieet aangevuld met natriumpropionaat (aangepast open-label standaarddieet, 16 kcal% vet, met 5000 ppm natriumpropionaat). De gebruikte hoeveelheid natriumpropionaat was equivalent aan 5000 mg PFA/kg totaal voergewicht. Dit is de hoogste concentratie PPA die is goedgekeurd voor gebruik als voedselconserveermiddel. Ter voorbereiding op dit onderzoek kregen de moedermuizen gedurende 4 weken vóór de paring beide diëten, en dit werd voortgezet gedurende de gehele zwangerschap van de moeder. De nakomelingen [22 muizen, 9 controlemuizen (6 mannetjes, 3 vrouwtjes) en 13 PPA-muizen (4 mannetjes, 9 vrouwtjes)] werden gespeend en vervolgens gedurende 5 maanden op hetzelfde dieet als de moeders gehouden. De nakomelingen werden op 5 maanden leeftijd geofferd en hun darminhoud werd verzameld en aanvankelijk bewaard in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml bij -20 °C en vervolgens overgebracht naar een vriezer van -80 °C totdat het gastheer-DNA was verwijderd en microbiële nucleïnezuren waren geëxtraheerd.
Gastheer-DNA werd verwijderd volgens een aangepast protocol (Charalampous et al., 2019). Kort gezegd werden de fecale inhoud overgebracht naar 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) en ingevroren bewaard. Verwerk maximaal 1-2 fecale pellets per extractie. De fecale inhoud werd vervolgens mechanisch gehomogeniseerd met een plastic stamper in de buis om een suspensie te vormen. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij 10.000 RCF of totdat de monsters zijn bezinkt, zuig vervolgens het supernatant af en resuspendeer de pellet in 250 µl 1× PBS. Voeg 250 µl 4,4% saponine-oplossing (TCI, productnummer S0019) toe aan het monster als detergent om de eukaryotische celmembranen los te maken. De monsters werden voorzichtig gemengd tot een glad mengsel en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Vervolgens werd, om eukaryotische cellen te verstoren, 350 μl nucleasevrij water aan het monster toegevoegd, 30 seconden geïncubeerd en daarna 12 μl 5 M NaCl toegevoegd. De monsters werden vervolgens 5 minuten gecentrifugeerd bij 6000 RCF. Het supernatant werd afgezogen en de pellet werd geresuspendeerd in 100 μl 1X PBS. Om gastheer-DNA te verwijderen, werden 100 μl HL-SAN-buffer (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nucleasevrij water) en 10 μl HL-SAN-enzym (ArticZymes P/N 70910-202) toegevoegd. De monsters werden grondig gemengd door te pipetteren en gedurende 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd met een Eppendorf™ ThermoMixer C bij 800 rpm. Na incubatie werden ze gedurende 3 minuten gecentrifugeerd bij 6000 RCF en tweemaal gewassen met respectievelijk 800 µl en 1000 µl 1X PBS. Ten slotte werd het pellet geresuspendeerd in 100 µl 1X PBS.
Het totale bacteriële DNA werd geïsoleerd met behulp van de New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). De standaardwerkwijze die bij de kit wordt geleverd, is licht aangepast. Incubeer en bewaar nucleasevrij water op 60 °C vóór de uiteindelijke elutie. Voeg 10 µl Proteinase K en 3 µl RNase A toe aan elk monster. Voeg vervolgens 100 µl Cell Lysis Buffer toe en meng voorzichtig. De monsters werden vervolgens geïncubeerd in een Eppendorf™ ThermoMixer C bij 56 °C en 1400 rpm gedurende minimaal 1 uur en maximaal 3 uur. De geïncubeerde monsters werden gedurende 3 minuten gecentrifugeerd bij 12.000 RCF en het supernatant van elk monster werd overgebracht naar een apart microcentrifugebuisje van 1,5 ml met daarin 400 µl bindingsoplossing. De buizen werden vervolgens 5-10 seconden lang met tussenpozen van 1 seconde kort gevortexd. De volledige vloeistofinhoud van elk monster (ongeveer 600-700 µL) werd overgebracht naar een filterpatroon in een doorstroombuis. De buizen werden 3 minuten gecentrifugeerd bij 1000 RCF om initiële DNA-binding mogelijk te maken en vervolgens 1 minuut gecentrifugeerd bij 12.000 RCF om resterende vloeistof te verwijderen. De monsterkolom werd overgebracht naar een nieuwe opvangbuis en vervolgens tweemaal gewassen. Voeg voor de eerste wasbeurt 500 µL wasbuffer toe aan elke buis. Keer de buis 3-5 keer om en centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 12.000 RCF. Gooi de vloeistof uit de opvangbuis weg en plaats het filterpatroon terug in dezelfde opvangbuis. Voeg voor de tweede wasbeurt 500 µL wasbuffer toe aan het filter zonder de buis om te keren. De monsters werden 1 minuut gecentrifugeerd bij 12.000 RCF. Breng het filter over naar een LoBind®-buisje van 1,5 ml en voeg 100 µl voorverwarmd nucleasevrij water toe. De filters werden 1 minuut bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens 1 minuut gecentrifugeerd bij 12.000 RCF. Het geëlueerde DNA werd bewaard bij -80 °C.
De DNA-concentratie werd gekwantificeerd met behulp van een Qubit™ 4.0 Fluorometer. DNA werd bereid met de Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (Cat.nr. Q33231) volgens de instructies van de fabrikant. De lengteverdeling van de DNA-fragmenten werd gemeten met een Agilent™ 4150 of 4200 TapeStation. DNA werd bereid met Agilent™ Genomic DNA Reagents (Cat.nr. 5067-5366) en Genomic DNA ScreenTape (Cat.nr. 5067-5365). De bibliotheekvoorbereiding werd uitgevoerd met de Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) volgens de instructies van de fabrikant. DNA werd gesequenced met een ONT GridION™ Mk1 sequencer met een Min106D flowcel (R 9.4.1). De sequentie-instellingen waren: zeer nauwkeurige basenoproep, minimale q-waarde van 9, barcode-instelling en barcode-trimmen. De monsters werden 72 uur lang gesequenced, waarna de basenoproepgegevens werden ingediend voor verdere verwerking en analyse.
Bioinformatische verwerking werd uitgevoerd met behulp van eerder beschreven methoden (Greenman et al., 2024). De FASTQ-bestanden die verkregen waren uit de sequencing werden onderverdeeld in mappen voor elk monster. Vóór de bioinformatische analyse werden de gegevens verwerkt met behulp van de volgende pipeline: eerst werden de FASTQ-bestanden van de monsters samengevoegd tot één enkel FASTQ-bestand. Vervolgens werden reads korter dan 1000 bp gefilterd met Filtlong v. 0.2.1, waarbij alleen de parameter –min_length 1000 werd gewijzigd (Wick, 2024). Vóór verdere filtering werd de kwaliteit van de reads gecontroleerd met NanoPlot v. 1.41.3 met de volgende parameters: –fastq –plots dot –N50 -o
Voor taxonomische classificatie werden reads en geassembleerde contigs geclassificeerd met behulp van Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Genereer rapporten en uitvoerbestanden voor respectievelijk reads en assemblies. Gebruik de optie –use-names om reads en assemblies te analyseren. De opties –gzip-compressed en –paired worden gespecificeerd voor readsegmenten. De relatieve abundantie van taxa in metagenomen werd geschat met behulp van Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). We hebben eerst een kmer-database gemaakt met 1000 basen met behulp van bracken-build met de volgende parameters: -d
Genannotatie en schatting van de relatieve abundantie werden uitgevoerd met behulp van een aangepaste versie van het protocol beschreven door Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Eerst werden contigs korter dan 500 bp verwijderd uit alle assemblages met behulp van SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). De geselecteerde assemblages werden vervolgens gecombineerd tot een pan-metagenoom. Open leesramen (ORFs) werden geïdentificeerd met behulp van Prodigal v. 1.0.1 (een parallelle versie van Prodigal v. 2.6.3) met de volgende parameters: -d
Genen werden eerst gegroepeerd op basis van KEGG-ortholoog (KO)-identificaties (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) die door eggNOG waren toegekend, om de abundantie van genen in verschillende pathways te vergelijken. Genen zonder knock-outs of genen met meerdere knock-outs werden vóór de analyse verwijderd. Vervolgens werd de gemiddelde abundantie van elke KO per monster berekend en werd een statistische analyse uitgevoerd. Genen die betrokken zijn bij het PPA-metabolisme werden gedefinieerd als elk gen waaraan de rij ko00640 in de KEGG_Pathway-kolom was toegewezen, wat volgens KEGG duidt op een rol in het propionaatmetabolisme. Genen die geassocieerd zijn met PPA-productie staan vermeld in Aanvullende Tabel 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutatietoetsen werden uitgevoerd om genen voor PPA-metabolisme en -productie te identificeren die significant vaker voorkwamen in elk monstertype. Voor elk geanalyseerd gen werden duizend permutaties uitgevoerd. Een p-waarde van 0,05 werd gebruikt als drempelwaarde voor statistische significantie. Functionele annotaties werden toegekend aan individuele genen binnen een cluster op basis van de annotaties van representatieve genen binnen het cluster. Taxa geassocieerd met PPA-metabolisme en/of PPA-productie konden worden geïdentificeerd door contig-ID's in de Kraken2-uitvoerbestanden te vergelijken met dezelfde contig-ID's die tijdens de functionele annotatie met eggNOG werden gebruikt. Significantietoetsing werd uitgevoerd met behulp van de eerder beschreven Mann-Whitney U-toets. Correctie voor meervoudige toetsing werd uitgevoerd met behulp van de Benjamini-Hochberg-procedure. Een p-waarde van ≤ 0,05 werd gebruikt als drempelwaarde voor statistische significantie.
De diversiteit van het darmmicrobioom van muizen werd beoordeeld met behulp van de Simpson-diversiteitsindex. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen de controle- en PPA-monsters wat betreft genus- en soortdiversiteit (p-waarde voor genus: 0,18, p-waarde voor soort: 0,16) (Figuur 1). De microbiële samenstelling werd vervolgens vergeleken met behulp van principale componentenanalyse (PCA). Figuur 2 toont de clustering van monsters op basis van hun fyla, wat aangeeft dat er verschillen waren in de soortensamenstelling van de microbiomen tussen de PPA- en controlemonsters. Deze clustering was minder uitgesproken op genusniveau, wat suggereert dat PPA bepaalde bacteriën beïnvloedt (Aanvullende figuur 1).
Figuur 1. Alfa-diversiteit van de geslachten en de soortensamenstelling van het darmmicrobioom van de muis. Boxplots met Simpson-diversiteitsindices van geslachten (A) en soorten (B) in PPA- en controlemonsters. De significantie werd bepaald met de Mann-Whitney U-test en er werd een correctie voor meervoudige vergelijkingen uitgevoerd met de Benjamini-Hochberg-procedure. ns, p-waarde was niet significant (p>0,05).
Figuur 2. Resultaten van de principale componentenanalyse van de samenstelling van het darmmicrobioom van muizen op soortniveau. De plot van de principale componentenanalyse toont de verdeling van de monsters over hun eerste twee principale componenten. Kleuren geven het monstertype aan: PPA-blootgestelde muizen zijn paars en controlemuizen zijn geel. Principale component 1 en 2 zijn respectievelijk uitgezet op de x-as en de y-as en worden uitgedrukt als hun verklaarde variantieverhouding.
Met behulp van RLE-getransformeerde telgegevens werd een significante afname van de mediane Bacteroidetes/Bacilli-ratio waargenomen bij controlemuizen en PPA-muizen (controle: 9,66, PPA: 3,02; p-waarde = 0,0011). Dit verschil was te wijten aan een hogere abundantie van Bacteroidetes bij PPA-muizen in vergelijking met de controlegroep, hoewel het verschil niet significant was (gemiddelde CLR controle: 5,51, gemiddelde CLR PPA: 6,62; p-waarde = 0,054), terwijl de abundantie van Bacteroidetes vergelijkbaar was (gemiddelde CLR controle: 7,76, gemiddelde CLR PPA: 7,60; p-waarde = 0,18).
Analyse van de abundantie van taxonomische leden van het darmmicrobioom toonde aan dat 1 fylum en 77 soorten significant verschilden tussen PPA- en controlemonsters (aanvullende tabel 2). De abundantie van 59 soorten in PPA-monsters was significant hoger dan die in controlemonsters, terwijl de abundantie van slechts 16 soorten in controlemonsters hoger was dan die in PPA-monsters (figuur 3).
Figuur 3. Verschillende abundantie van taxa in het darmmicrobioom van PPA- en controlemuizen. Vulkaanplots tonen de verschillen in abundantie van geslachten (A) of soorten (B) tussen PPA- en controlemonsters. Grijze stippen geven aan dat er geen significant verschil is in de abundantie van taxa. Gekleurde stippen geven significante verschillen in abundantie aan (p-waarde ≤ 0,05). De 20 taxa met de grootste verschillen in abundantie tussen de monstertypen worden respectievelijk in rood en lichtblauw weergegeven (controle- en PPA-monsters). Gele en paarse stippen waren minstens 2,7 keer zo abundant in controle- of PPA-monsters als in de controlegroep. Zwarte stippen representeren taxa met significant verschillende abundanties, met gemiddelde CLR-verschillen tussen -1 en 1. P-waarden werden berekend met de Mann-Whitney U-test en gecorrigeerd voor meervoudige toetsing met de Benjamini-Hochberg-procedure. Vetgedrukte gemiddelde CLR-verschillen geven significante verschillen in abundantie aan.
Na analyse van de samenstelling van de darmmicrobiota hebben we een functionele annotatie van het microbioom uitgevoerd. Na het filteren van genen van lage kwaliteit werden in totaal 378.355 unieke genen geïdentificeerd in alle monsters. De getransformeerde abundantie van deze genen werd gebruikt voor een principale componentenanalyse (PCA), en de resultaten toonden een hoge mate van clustering van monstertypen op basis van hun functionele profielen (Figuur 4).
Figuur 4. PCA-resultaten met behulp van het functionele profiel van het darmmicrobioom van muizen. De PCA-grafiek toont de verdeling van de monsters over hun eerste twee hoofdcomponenten. Kleuren geven het monstertype aan: PPA-blootgestelde muizen zijn paars en controlemuizen zijn geel. Hoofdcomponenten 1 en 2 zijn respectievelijk uitgezet op de x-as en de y-as en worden uitgedrukt als hun verklaarde variantieverhouding.
Vervolgens onderzochten we de abundantie van KEGG-knockouts in verschillende monstertypen. In totaal werden 3648 unieke knockouts geïdentificeerd, waarvan 196 significant vaker voorkwamen in controlemonsters en 106 significant vaker in PPA-monsters (Figuur 5). In totaal werden 145 genen gedetecteerd in controlemonsters en 61 genen in PPA-monsters, met significant verschillende abundanties. Pathways gerelateerd aan lipide- en aminosuikermetabolisme waren significant meer verrijkt in PPA-monsters (Aanvullende tabel 3). Pathways gerelateerd aan stikstofmetabolisme en zwaveltransportsystemen waren significant meer verrijkt in controlemonsters (Aanvullende tabel 3). De abundantie van genen gerelateerd aan aminosuiker-/nucleotidemetabolisme (ko:K21279) en inositol-fosfaatmetabolisme (ko:K07291) was significant hoger in PPA-monsters (Figuur 5). Controlemonsters hadden significant meer genen gerelateerd aan benzoaatmetabolisme (ko:K22270), stikstofmetabolisme (ko:K00368) en glycolyse/gluconeogenese (ko:K00131) (Figuur 5).
Figuur 5. Verschillende abundantie van KOs in het darmmicrobioom van PPA- en controlemuizen. De vulkaanplot toont de verschillen in abundantie van functionele groepen (KOs). Grijze stippen geven KOs aan waarvan de abundantie niet significant verschilde tussen de monstertypen (p-waarde > 0,05). Gekleurde stippen geven significante verschillen in abundantie aan (p-waarde ≤ 0,05). De 20 KOs met de grootste verschillen in abundantie tussen de monstertypen worden weergegeven in rood en lichtblauw, respectievelijk voor controle- en PPA-monsters. Gele en paarse stippen geven KOs aan die minstens 2,7 keer zo abundant waren in respectievelijk controle- en PPA-monsters. Zwarte stippen geven KOs aan met significant verschillende abundanties, met gemiddelde CLR-verschillen tussen -1 en 1. P-waarden werden berekend met de Mann-Whitney U-test en gecorrigeerd voor meervoudige vergelijkingen met de Benjamini-Hochberg-procedure. NaN geeft aan dat de KO niet tot een pathway in KEGG behoort. Vetgedrukte gemiddelde CLR-verschilwaarden geven significante verschillen in abundantie aan. Voor gedetailleerde informatie over de pathways waartoe de vermelde KO's behoren, zie aanvullende tabel 3.
Van de geannoteerde genen vertoonden 1601 genen significant verschillende abundanties tussen de verschillende monstertypen (p ≤ 0,05), waarbij elk gen minstens 2,7 keer zo abundant was. Van deze genen waren 4 genen abundanter in de controlemonsters en 1597 genen abundanter in de PPA-monsters. Omdat PPA antimicrobiële eigenschappen heeft, hebben we de abundantie van genen die betrokken zijn bij het metabolisme en de productie van PPA tussen de verschillende monstertypen onderzocht. Van de 1332 genen die gerelateerd zijn aan het metabolisme van PPA, waren 27 genen significant abundanter in de controlemonsters en 12 genen abundanter in de PPA-monsters. Van de 223 genen die gerelateerd zijn aan de productie van PPA, was 1 gen significant abundanter in de PPA-monsters. Figuur 6A toont verder de hogere abundantie van genen die betrokken zijn bij het metabolisme van PPA, met een significant hogere abundantie in de controlemonsters en grote effectgroottes, terwijl figuur 6B individuele genen met een significant hogere abundantie in de PPA-monsters weergeeft.
Figuur 6. Verschillende abundantie van PPA-gerelateerde genen in het darmmicrobioom van muizen. Vulkaanplots tonen de verschillen in abundantie van genen geassocieerd met PPA-metabolisme (A) en PPA-productie (B). Grijze stippen geven genen aan waarvan de abundantie niet significant verschilde tussen de monstertypen (p-waarde > 0,05). Gekleurde stippen geven significante verschillen in abundantie aan (p-waarde ≤ 0,05). De 20 genen met de grootste verschillen in abundantie worden respectievelijk in rood en lichtblauw weergegeven (controle- en PPA-monsters). De abundantie van gele en paarse stippen was minstens 2,7 keer groter in controle- en PPA-monsters dan in controlemonsters. Zwarte stippen representeren genen met significant verschillende abundanties, met gemiddelde CLR-verschillen tussen -1 en 1. P-waarden werden berekend met de Mann-Whitney U-test en gecorrigeerd voor meervoudige vergelijkingen met de Benjamini-Hochberg-procedure. De genen komen overeen met representatieve genen in de niet-redundante gencatalogus. Genamen bestaan uit het KEGG-symbool dat een KO-gen aanduidt. Vetgedrukte CLR-verschillen duiden op significant verschillende abundanties. Een streepje (-) geeft aan dat er geen symbool voor het gen in de KEGG-database bestaat.
Taxa met genen gerelateerd aan PPA-metabolisme en/of -productie werden geïdentificeerd door de taxonomische identiteit van de contigs te matchen met de contig-ID van het gen. Op genusniveau bleken 130 genera genen te hebben die gerelateerd zijn aan PPA-metabolisme en 61 genera genen die gerelateerd zijn aan PPA-productie (aanvullende tabel 4). Er werden echter geen significante verschillen in abundantie tussen de genera waargenomen (p > 0,05).
Op soortniveau bleken 144 bacteriesoorten genen te bezitten die geassocieerd zijn met PPA-metabolisme en 68 bacteriesoorten genen die geassocieerd zijn met PPA-productie (Aanvullende tabel 5). Onder de PPA-metaboliseerders vertoonden acht bacteriën een significante toename in abundantie tussen de verschillende monstertypen, en alle vertoonden significante veranderingen in effect (Aanvullende tabel 6). Alle geïdentificeerde PPA-metaboliseerders met significante verschillen in abundantie waren overvloediger aanwezig in PPA-monsters. Classificatie op soortniveau bracht vertegenwoordigers aan het licht van geslachten die niet significant verschilden tussen de monstertypen, waaronder verschillende Bacteroides- en Ruminococcus-soorten, evenals Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus en Alcaligenes polymorpha. Onder de PPA-producerende bacteriën vertoonden vier bacteriën significante verschillen in abundantie tussen de monstertypen. Soorten met significante verschillen in abundantie waren onder andere Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis en Ruminococcus bovis.
In deze studie onderzochten we de effecten van blootstelling aan PPA op de darmmicrobiota van muizen. PPA kan verschillende reacties bij bacteriën teweegbrengen, omdat het door bepaalde soorten wordt geproduceerd, door andere soorten als voedselbron wordt gebruikt of antimicrobiële effecten heeft. Toevoeging van PPA aan de darmflora via voedingssupplementen kan daarom verschillende effecten hebben, afhankelijk van tolerantie, gevoeligheid en het vermogen om het als voedingsbron te gebruiken. Gevoelige bacteriesoorten kunnen worden geëlimineerd en vervangen door soorten die resistenter zijn tegen PPA of het als voedselbron kunnen gebruiken, wat leidt tot veranderingen in de samenstelling van de darmmicrobiota. Onze resultaten lieten significante verschillen zien in de microbiële samenstelling, maar geen effect op de algehele microbiële diversiteit. De grootste effecten werden waargenomen op soortniveau, met meer dan 70 taxa die significant verschilden in abundantie tussen PPA- en controlemonsters (aanvullende tabel 2). Verdere analyse van de samenstelling van de aan PPA blootgestelde monsters onthulde een grotere heterogeniteit van microbiële soorten in vergelijking met de niet-blootgestelde monsters, wat suggereert dat PPA de groei van bacteriën kan bevorderen en de bacteriële populaties kan beperken die kunnen overleven in PPA-rijke omgevingen. PPA kan dus selectief veranderingen teweegbrengen in plaats van een wijdverspreide verstoring van de diversiteit van de darmmicrobiota te veroorzaken.
Uit eerder onderzoek is gebleken dat voedselconserveermiddelen zoals PPA de abundantie van darmmicrobioomcomponenten veranderen zonder de algehele diversiteit aan te tasten (Nagpal et al., 2021). In dit onderzoek observeerden we de meest opvallende verschillen tussen Bacteroidetes-soorten binnen de stam Bacteroidetes (voorheen bekend als Bacteroidetes), die significant verrijkt waren bij muizen die aan PPA waren blootgesteld. Een verhoogde abundantie van Bacteroides-soorten wordt geassocieerd met een verhoogde afbraak van slijm, wat het risico op infecties kan verhogen en ontstekingen kan bevorderen (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Uit één onderzoek bleek dat pasgeboren mannelijke muizen die behandeld waren met Bacteroides fragilis sociaal gedrag vertoonden dat deed denken aan autismespectrumstoornis (ASS) (Carmel et al., 2023), en andere studies hebben aangetoond dat Bacteroides-soorten de immuunactiviteit kunnen veranderen en kunnen leiden tot auto-immuun inflammatoire cardiomyopathie (Gil-Cruz et al., 2019). Soorten behorende tot de geslachten Ruminococcus, Prevotella en Parabacteroides waren ook significant toegenomen bij muizen die waren blootgesteld aan PPA (Coretti et al., 2018). Bepaalde Ruminococcus-soorten worden in verband gebracht met ziekten zoals de ziekte van Crohn door de productie van pro-inflammatoire cytokinen (Henke et al., 2019), terwijl Prevotella-soorten zoals Prevotella humani in verband worden gebracht met stofwisselingsziekten zoals hypertensie en insulinegevoeligheid (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Ten slotte ontdekten we dat de verhouding tussen Bacteroidetes (voorheen bekend als Firmicutes) en Bacteroidetes significant lager was bij muizen die aan PPA waren blootgesteld dan bij controlemmuizen, als gevolg van een hogere totale abundantie van Bacteroidetes-soorten. Deze verhouding is eerder aangetoond als een belangrijke indicator voor de intestinale homeostase, en verstoringen in deze verhouding zijn in verband gebracht met verschillende ziektebeelden (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), waaronder inflammatoire darmziekten (Stojanov et al., 2020). Over het algemeen lijken soorten van de stam Bacteroidetes het sterkst te worden beïnvloed door een verhoogde inname van PPA via de voeding. Dit kan te wijten zijn aan een hogere tolerantie voor PPA of het vermogen om PPA als energiebron te gebruiken, wat is aangetoond voor ten minste één soort, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Als alternatief zou blootstelling van de moeder aan PPA de foetale ontwikkeling kunnen bevorderen door de darmen van muizenjongen vatbaarder te maken voor kolonisatie door Bacteroidetes; ons onderzoeksontwerp stond een dergelijke beoordeling echter niet toe.
Metagenomische analyse van de inhoud onthulde significante verschillen in de abundantie van genen geassocieerd met PPA-metabolisme en -productie. Muizen die aan PPA waren blootgesteld, vertoonden een hogere abundantie van genen die verantwoordelijk zijn voor PPA-productie, terwijl muizen die niet aan PPA waren blootgesteld een hogere abundantie vertoonden van genen die verantwoordelijk zijn voor PAA-metabolisme (Figuur 6). Deze resultaten suggereren dat het effect van PPA op de microbiële samenstelling mogelijk niet uitsluitend te wijten is aan het gebruik ervan, anders zou de abundantie van genen geassocieerd met PPA-metabolisme hoger moeten zijn geweest in het darmmicrobioom van aan PPA blootgestelde muizen. Een mogelijke verklaring is dat PPA de bacteriële abundantie voornamelijk beïnvloedt via zijn antimicrobiële effecten in plaats van via het gebruik ervan als voedingsstof door bacteriën. Eerdere studies hebben aangetoond dat PPA de groei van Salmonella Typhimurium dosisafhankelijk remt (Jacobson et al., 2018). Blootstelling aan hogere concentraties PPA kan leiden tot selectie van bacteriën die resistent zijn tegen de antimicrobiële eigenschappen ervan en die het mogelijk niet kunnen metaboliseren of produceren. Zo lieten verschillende Parabacteroides-soorten bijvoorbeeld een significant hogere abundantie zien in PPA-monsters, maar werden er geen genen gedetecteerd die verband houden met het metabolisme of de productie van PPA (aanvullende tabellen 2, 4 en 5). Bovendien is de productie van PPA als fermentatiebijproduct wijdverspreid onder verschillende bacteriën (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Een hogere bacteriële diversiteit zou de reden kunnen zijn voor de hogere abundantie van genen die verband houden met het PPA-metabolisme in de controlemonsters (Averina et al., 2020). Verder werd voorspeld dat slechts 27 (2,14%) van de 1332 genen uitsluitend geassocieerd waren met het PPA-metabolisme. Veel genen die geassocieerd zijn met het PPA-metabolisme zijn ook betrokken bij andere metabolische routes. Dit toont verder aan dat de abundantie van genen die betrokken zijn bij het PPA-metabolisme hoger was in de controlemonsters; deze genen functioneren mogelijk in routes die niet leiden tot PPA-gebruik of -vorming als bijproduct. In dit geval vertoonde slechts één gen dat geassocieerd is met PPA-productie significante verschillen in abundantie tussen de verschillende monstertypen. In tegenstelling tot genen die geassocieerd zijn met PPA-metabolisme, werden merkergenen voor PPA-productie geselecteerd omdat ze direct betrokken zijn bij het bacteriële pad voor PPA-productie. Bij muizen die aan PPA waren blootgesteld, bleken alle soorten een significant verhoogde abundantie en capaciteit tot PPA-productie te hebben. Dit ondersteunt de voorspelling dat PPA's PPA-producenten zouden selecteren en dus dat de PPA-productiecapaciteit zou toenemen. Genabundantie correleert echter niet noodzakelijkerwijs met genexpressie; hoewel de abundantie van genen die geassocieerd zijn met PPA-metabolisme hoger is in controlemonsters, kan de expressiesnelheid dus verschillen (Shi et al., 2014). Om de relatie tussen de prevalentie van PPA-producerende genen en PPA-productie te bevestigen, zijn studies naar de expressie van genen die betrokken zijn bij PPA-productie nodig.
Functionele annotatie van de PPA- en controlemetagenomen bracht enkele verschillen aan het licht. PCA-analyse van de geninhoud onthulde discrete clusters tussen PPA- en controlemonsters (Figuur 5). Clustering binnen de monsters liet zien dat de geninhoud van de controlemonsters diverser was, terwijl de PPA-monsters samen clusterden. Clustering op basis van geninhoud was vergelijkbaar met clustering op basis van soortensamenstelling. Verschillen in pathway-abundantie zijn dus consistent met veranderingen in de abundantie van specifieke soorten en stammen daarbinnen. In de PPA-monsters waren twee pathways met een significant hogere abundantie gerelateerd aan aminosuiker-/nucleotidesuikermetabolisme (ko:K21279) en meerdere lipidenmetabolisme-pathways (ko:K00647, ko:K03801; Aanvullende tabel 3). Genen geassocieerd met ko:K21279 staan erom bekend geassocieerd te zijn met het geslacht Bacteroides, een van de geslachten met een significant hoger aantal soorten in de PPA-monsters. Dit enzym kan de immuunrespons ontwijken door capsulepolysacchariden tot expressie te brengen (Wang et al., 2008). Dit kan de toename van Bacteroidetes verklaren die werd waargenomen bij muizen die aan PPA waren blootgesteld. Dit sluit aan bij de toegenomen vetzuursynthese die werd waargenomen in het PPA-microbioom. Bacteriën gebruiken de FASIIko:K00647 (fabB)-route om vetzuren te produceren, wat de metabole processen van de gastheer kan beïnvloeden (Yao en Rock, 2015; Johnson et al., 2020), en veranderingen in het lipidenmetabolisme kunnen een rol spelen bij de neuroontwikkeling (Yu et al., 2020). Een andere route die een verhoogde abundantie vertoonde in PPA-monsters was de biosynthese van steroïdehormonen (ko:K12343). Er is steeds meer bewijs dat er een omgekeerde relatie bestaat tussen het vermogen van de darmmicrobiota om hormoonspiegels te beïnvloeden en om door hormonen te worden beïnvloed, zodat verhoogde steroïdespiegels gevolgen kunnen hebben voor de gezondheid (Tetel et al., 2018).
Deze studie kent beperkingen en aandachtspunten. Een belangrijk verschil is dat we geen fysiologische metingen bij de dieren hebben uitgevoerd. Het is daarom niet mogelijk om direct te concluderen of veranderingen in het microbioom verband houden met een bepaalde ziekte. Een ander aandachtspunt is dat de muizen in deze studie hetzelfde dieet kregen als hun moeders. Toekomstige studies zouden kunnen uitwijzen of het overschakelen van een PPA-rijk dieet naar een PPA-vrij dieet de effecten op het microbioom verbetert. Een beperking van onze studie, net als bij vele andere, is de beperkte steekproefomvang. Hoewel er valide conclusies kunnen worden getrokken, zou een grotere steekproefomvang een grotere statistische power opleveren bij de analyse van de resultaten. We zijn ook voorzichtig met het trekken van conclusies over een verband tussen veranderingen in het darmmicrobioom en een bepaalde ziekte (Yap et al., 2021). Verstorende factoren zoals leeftijd, geslacht en dieet kunnen de samenstelling van micro-organismen aanzienlijk beïnvloeden. Deze factoren kunnen de inconsistenties verklaren die in de literatuur worden waargenomen met betrekking tot de associatie van het darmmicrobioom met complexe ziekten (Johnson et al., 2019; Lagod en Naser, 2023). Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat leden van het geslacht Bacteroidetes zowel in verhoogde als verlaagde aantallen voorkomen bij dieren en mensen met ASS (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Evenzo hebben studies naar de darmsamenstelling bij patiënten met inflammatoire darmziekten zowel verhogingen als verlagingen van dezelfde taxa gevonden (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Om de impact van genderbias te beperken, hebben we geprobeerd een gelijke vertegenwoordiging van beide geslachten te garanderen, zodat verschillen hoogstwaarschijnlijk werden veroorzaakt door het dieet. Een uitdaging bij functionele annotatie is het verwijderen van redundante gensequenties. Onze methode voor genclustering vereist 95% sequentie-identiteit en 85% lengte-overeenkomst, evenals 90% alignment-dekking om valse clustering te elimineren. In sommige gevallen observeerden we echter COG's met dezelfde annotaties (bijv. MUT) (Fig. 6). Verder onderzoek is nodig om te bepalen of deze orthologen verschillend zijn, geassocieerd met specifieke geslachten, of dat dit een beperking is van de genclusteringsmethode. Een andere beperking van functionele annotatie is mogelijke verkeerde classificatie; het bacteriële gen mmdA is een bekend enzym dat betrokken is bij de propionaatsynthese, maar KEGG associeert het niet met de propionaatmetabolische route. De orthologen scpB en mmcD zijn daarentegen wel verwant. Het grote aantal genen zonder aangewezen knockouts kan ertoe leiden dat PPA-gerelateerde genen niet kunnen worden geïdentificeerd bij het beoordelen van de genovervloed. Toekomstig onderzoek zal baat hebben bij metatranscriptoomanalyse, die een dieper inzicht kan geven in de functionele kenmerken van de darmmicrobiota en genexpressie kan koppelen aan potentiële downstream-effecten. Voor studies naar specifieke neurologische ontwikkelingsstoornissen of inflammatoire darmziekten zijn fysiologische en gedragsmatige beoordelingen van dieren nodig om veranderingen in de samenstelling van het microbioom aan deze aandoeningen te koppelen. Aanvullende studies waarbij het darmmicrobioom wordt getransplanteerd naar kiemvrije muizen zouden ook nuttig zijn om te bepalen of het microbioom een drijvende kracht of een kenmerk van de ziekte is.
Samenvattend hebben we aangetoond dat PPA in de voeding een rol speelt bij het veranderen van de samenstelling van de darmmicrobiota. PPA is een door de FDA goedgekeurd conserveermiddel dat veelvuldig voorkomt in diverse voedingsmiddelen en dat bij langdurige blootstelling de normale darmflora kan verstoren. We vonden veranderingen in de hoeveelheid van verschillende bacteriën, wat suggereert dat PPA de samenstelling van de darmmicrobiota kan beïnvloeden. Veranderingen in de microbiota kunnen leiden tot veranderingen in de niveaus van bepaalde metabolische processen, wat fysiologische veranderingen teweeg kan brengen die relevant zijn voor de gezondheid van de gastheer. Verder onderzoek is nodig om te bepalen of de effecten van PPA in de voeding op de microbiële samenstelling kunnen leiden tot dysbiose of andere ziekten. Deze studie legt de basis voor toekomstig onderzoek naar de mogelijke impact van PPA op de darmsamenstelling op de menselijke gezondheid.
De datasets die in dit onderzoek worden gepresenteerd, zijn beschikbaar in online repositories. De naam en het toegangsnummer van de repository zijn: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Dit dieronderzoek is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) van de University of Central Florida (vergunningsnummer: PROTO202000002). Dit onderzoek voldoet aan de lokale wetten, voorschriften en institutionele eisen.
NG: Conceptualisering, Gegevensverzameling, Formele analyse, Onderzoek, Methodologie, Software, Visualisatie, Schrijven (origineel concept), Schrijven (revisie en redactie). LA: Conceptualisering, Gegevensverzameling, Methodologie, Middelen, Schrijven (revisie en redactie). SH: Formele analyse, Software, Schrijven (revisie en redactie). SA: Onderzoek, Schrijven (revisie en redactie). Hoofdjury: Onderzoek, Schrijven (revisie en redactie). SN: Conceptualisering, Projectadministratie, Middelen, Supervisie, Schrijven (revisie en redactie). TA: Conceptualisering, Projectadministratie, Supervisie, Schrijven (revisie en redactie).
De auteurs verklaren dat zij geen financiële steun hebben ontvangen voor het onderzoek, het schrijven en/of de publicatie van dit artikel.
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder commerciële of financiële belangen die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden beschouwd. Niet van toepassing.
Alle meningen die in dit artikel worden geuit, zijn uitsluitend die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van hun instellingen, uitgevers, redacteuren of recensenten. Producten die in dit artikel worden beoordeeld, of beweringen van fabrikanten daarvan, worden niet gegarandeerd of onderschreven door de uitgever.
Aanvullend materiaal voor dit artikel is online te vinden: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionzuur induceert gliose en neuro-inflammatie door regulering van de PTEN/AKT-route bij autismespectrumstoornissen. Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistische analyse van samenstellingsgegevens. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-ratio als risicofactor voor borstkanker. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differentiële expressieanalyse van sequentietellinggegevens. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Fecale microbiota en het metaboloom bij kinderen met autisme en pervasieve ontwikkelingsstoornis niet anderszins gespecificeerd. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bacteriële neurometabole kenmerken van de darmmicrobiota bij jonge kinderen met autismespectrumstoornissen. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Het microbioom als menselijk orgaan. Klinische microbiologie en infectie 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Nieuwe inzichten in de fysiologie van propionzuurproducerende bacteriën: Anaerotignum propionicum en Anaerotignum neopropionicum (voorheen Clostridium propionicum en Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Maternale voeding en ontwikkeling van de foetus. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., en Hochberg, J. (1995). Het beheersen van het vals-positieve percentage: een praktische en efficiënte aanpak voor meervoudig testen. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Geplaatst op: 18 april 2025