Immunomodulerende metabolieten zijn een belangrijk kenmerk van de tumor-microomgeving (TME), maar op enkele uitzonderingen na blijven hun identiteiten grotendeels onbekend. In deze studie analyseerden we tumoren en T-cellen uit de tumoren en ascitesvloeistof van patiënten met hooggradig sereus carcinoom (HGSC) om het metaboloom van deze verschillende TME-compartimenten te onthullen. Ascitesvloeistof en tumorcellen vertonen grote verschillen in metabolieten. In vergelijking met ascitesvloeistof zijn de tumorinfiltrerende T-cellen significant verrijkt met 1-methylnicotinamide (MNA). Hoewel het MNA-niveau in T-cellen verhoogd is, is de expressie van nicotinamide N-methyltransferase (een enzym dat de overdracht van methylgroepen van S-adenosylmethionine naar nicotinamide katalyseert) beperkt tot fibroblasten en tumorcellen. Functioneel gezien induceert MNA T-cellen tot de secretie van het tumorbevorderende cytokine tumornecrosefactor alfa. Daarom draagt ​​TME-afgeleid MNA bij aan de immuunregulatie van T-cellen en vormt het een potentieel doelwit voor immunotherapie bij de behandeling van menselijke kanker.
Door tumoren geproduceerde metabolieten kunnen een diepgaand remmend effect hebben op de antitumorimmuniteit, en steeds meer bewijs toont aan dat ze ook een belangrijke drijvende kracht kunnen zijn voor de progressie van de ziekte (1). Naast het Warburg-effect is recent onderzoek gestart naar de metabolische toestand van tumorcellen en de relatie daarvan met de immuunstatus van de tumor-microomgeving (TME). Studies met muismodellen en menselijke T-cellen hebben aangetoond dat glutaminemetabolisme (2), oxidatief metabolisme (3) en glucosemetabolisme (4) onafhankelijk van elkaar kunnen werken op verschillende subgroepen van immuuncellen. Verschillende metabolieten in deze pathways remmen de antitumorfunctie van T-cellen. Het is bewezen dat de blokkade van het co-enzym tetrahydrobiopterine (BH4) de proliferatie van T-cellen kan beschadigen, en dat een verhoging van BH4 in het lichaam de antitumorale immuunrespons, gemedieerd door CD4 en CD8, kan versterken. Bovendien kan het immunosuppressieve effect van kynurenine worden opgeheven door toediening van BH4 (5). In glioblastomen met een mutatie in isocitraatdehydrogenase (IDH) remt de secretie van enantiomeer (R)-2-hydroxyglutaraat (R-2-HG) de activering, proliferatie en cytolyse van T-cellen (6). Recent is aangetoond dat methylglyoxal, een bijproduct van de glycolyse, wordt geproduceerd door suppressorcellen van myeloïde oorsprong, en dat de overdracht van methylglyoxal naar T-cellen de functie van effector-T-cellen kan remmen. Bij de behandeling kan neutralisatie van methylglyoxal de activiteit van myeloïde suppressorcellen (MDSC) overwinnen en de checkpointblokkade-therapie in muismodellen synergetisch versterken (7). Deze studies benadrukken gezamenlijk de cruciale rol van TME-afgeleide metabolieten bij het reguleren van de functie en activiteit van T-cellen.
Er is veelvuldig melding gemaakt van T-celdisfunctie bij eierstokkanker (8). Dit is deels te wijten aan de metabolische kenmerken die inherent zijn aan hypoxie en abnormale tumorvasculatuur (9), wat resulteert in de omzetting van glucose en tryptofaan in bijproducten zoals melkzuur en kynurenine. Overmatig extracellulair lactaat vermindert de productie van interferon-γ (IFN-γ) en stimuleert de differentiatie van myelosuppressieve subgroepen (10, 11). De consumptie van tryptofaan remt direct de T-celproliferatie en remt de signalering van de T-celreceptor (12-14). Ondanks deze observaties is veel onderzoek naar het immuunmetabolisme uitgevoerd in in vitro T-celculturen met geoptimaliseerde media, of beperkt gebleven tot homologe muismodellen in vivo, die beide de heterogeniteit van menselijke kankers en de fysiologische macro- en micro-omgeving niet volledig weerspiegelen.
Een veelvoorkomend kenmerk van eierstokkanker is peritoneale verspreiding en het ontstaan ​​van ascites. De ophoping van celvocht in ascites wordt geassocieerd met een gevorderd stadium van de ziekte en een slechte prognose (15). Volgens rapporten is dit unieke compartiment hypoxisch, bevat het hoge concentraties vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), en wordt het geïnfiltreerd door T-regulerende cellen en myeloïde remmende cellen (15-18). De metabolische omgeving van ascites kan verschillen van die van de tumor zelf, waardoor de herprogrammering van T-cellen in de peritoneale ruimte onduidelijk is. Bovendien kunnen de belangrijkste verschillen en heterogeniteit tussen ascites en de metabolieten in de tumoromgeving de infiltratie van immuuncellen en hun functie op tumoren belemmeren, en is verder onderzoek nodig.
Om deze problemen op te lossen, hebben we een gevoelige methode ontwikkeld voor celseparatie en vloeistofchromatografie-tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS) om verschillende celtypen (waaronder CD4+ en CD8+ T-cellen) te bestuderen, zowel binnen als tussen tumoren. De metabolieten van deze methode omvatten cellen in dezelfde ascitesvloeistof en tumoromgeving van de patiënt. We gebruiken deze methode in combinatie met hoogdimensionale flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) om een ​​zeer gedetailleerd beeld te schetsen van de metabolische status van deze belangrijke populaties. Deze methode onthulde een significante toename van het niveau van 1-methylnicotinamide (MNA) in tumor-T-cellen, en in vitro-experimenten toonden aan dat het immunomodulerende effect van MNA op de T-celfunctie voorheen onbekend was. Over het algemeen onthult deze methode de wederzijdse metabolische interacties tussen tumoren en immuuncellen en biedt unieke inzichten in immuunregulerende metabolieten, wat nuttig kan zijn voor de behandeling van T-cel-gebaseerde immunotherapie bij eierstokkanker.
We gebruikten hoogdimensionale flowcytometrie om tegelijkertijd de glucoseopname [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG)] en mitochondriale activiteit [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) te kwantificeren. Dit zijn typische markers die immuuncellen en tumorcelpopulaties van elkaar onderscheiden (Tabel S2 en Figuur S1A). Deze analyse toonde aan dat ascites- en tumorcellen, vergeleken met T-cellen, een hogere glucoseopname hebben, maar kleinere verschillen in mitochondriale activiteit vertonen. De gemiddelde glucoseopname van tumorcellen [CD45-EpCAM (EpCAM)+] is drie tot vier keer zo hoog als die van T-cellen, en de gemiddelde glucoseopname van CD4+ T-cellen is 1,2 keer zo hoog als die van CD8+ T-cellen. Dit wijst erop dat tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL) verschillende metabolische behoeften hebben, zelfs in dezelfde TME (Figuur 1A). Daarentegen is de mitochondriale activiteit in tumorcellen vergelijkbaar met die van CD4+ T-cellen, en is de mitochondriale activiteit van beide celtypen hoger dan die van CD8+ T-cellen (Figuur 1B). Over het algemeen onthullen deze resultaten het metabolische niveau. De metabolische activiteit van tumorcellen is hoger dan die van CD4+ T-cellen, en de metabolische activiteit van CD4+ T-cellen is hoger dan die van CD8+ T-cellen. Ondanks deze effecten tussen de celtypen is er geen consistent verschil in de metabolische status van CD4+ en CD8+ T-cellen of hun relatieve verhoudingen in ascites vergeleken met tumoren (Figuur 1C). Daarentegen nam in de CD45-celfractie het aandeel EpCAM+ cellen in de tumor toe vergeleken met ascites (Figuur 1D). We observeerden ook een duidelijk metabolisch verschil tussen EpCAM+ en EpCAM- celcomponenten. EpCAM+ (tumor)cellen hebben een hogere glucoseopname en mitochondriale activiteit dan EpCAM-cellen, wat veel hoger is dan de metabolische activiteit van fibroblasten in tumorcellen in de TME (Figuur 1, E en F).
(A en B) Mediaan fluorescentie-intensiteit (MFI) van glucose-opname (2-NBDG) (A) en mitochondriale activiteit van CD4+ T-cellen (MitoTracker donkerrood) (B) Representatieve grafieken (links) en tabelgegevens (rechts), CD8+ T-cellen en EpCAM+ CD45- tumorcellen uit ascites en tumor. (C) De verhouding van CD4+ en CD8+ cellen (van CD3+ T-cellen) in ascites en tumor. (D) Proportie van EpCAM+ tumorcellen in ascites en tumor (CD45−). (E en F) EpCAM+ CD45- tumor en EpCAM-CD45-matrix glucose-opname (2-NBDG) (E) en mitochondriale activiteit (MitoTracker donkerrood) (F) representatieve grafieken (links) en tabelgegevens (rechts) Ascites- en tumorcellen. (G) Representatieve grafieken van CD25-, CD137- en PD1-expressie door flowcytometrie. (H en I) Expressie van CD25, CD137 en PD1 op CD4+ T-cellen (H) en CD8+ T-cellen (I). (J en K) Naïeve, centrale geheugen (Tcm), effector (Teff) en effectorgeheugen (Tem) fenotypes gebaseerd op de expressie van CCR7 en CD45RO. Representatieve afbeeldingen (links) en tabelgegevens (rechts) van CD4+ T-cellen (J) en CD8+ T-cellen (K) in ascites en tumoren. P-waarden bepaald met een gepaarde t-test (*P<0,05, **P<0,01 en ***P<0,001). De lijn geeft de gematchte patiënten weer (n = 6). FMO, fluorescentie minus één; MFI, mediane fluorescentie-intensiteit.
Verdere analyse bracht andere significante verschillen aan het licht tussen de zeer gedetailleerde fenotypische status van T-cellen. De geactiveerde (Figuur 1, G tot I) en effector-geheugencellen (Figuur 1, J en K) komen in tumoren veel vaker voor dan in ascites (aandeel CD3+ T-cellen). Analyse van het fenotype aan de hand van de expressie van activeringsmarkers (CD25 en CD137) en depletiemarkers [programmed cell death protein 1 (PD1)] toonde aan dat, hoewel de metabolische kenmerken van deze populaties verschillen (Figuur S1, B tot E), er geen significante metabolische verschillen consistent werden waargenomen tussen naïeve, effector- of geheugensubsets (Figuur S1, F tot I). Deze resultaten werden bevestigd door het gebruik van machine learning-methoden om automatisch celfenotypes toe te wijzen (21), wat verder de aanwezigheid van een groot aantal beenmergcellen (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) in de ascites van de patiënt aan het licht bracht (Figuur S2A). Van alle geïdentificeerde celtypen vertoonde deze myeloïde celpopulatie de hoogste glucoseopname en mitochondriale activiteit (Figuur S2, B tot G). Deze resultaten benadrukken de sterke metabolische verschillen tussen de verschillende celtypen die in ascites en tumoren bij HGSC-patiënten worden aangetroffen.
De grootste uitdaging bij het begrijpen van de metabonomische kenmerken van TIL is de noodzaak om T-celmonsters van voldoende zuiverheid, kwaliteit en kwantiteit uit tumoren te isoleren. Recente studies hebben aangetoond dat sorteer- en bead-verrijkingsmethoden op basis van flowcytometrie kunnen leiden tot veranderingen in de cellulaire metabolietenprofielen (22-24). Om dit probleem te overwinnen, hebben we de bead-verrijkingsmethode geoptimaliseerd voor het isoleren van TIL uit chirurgisch verwijderde menselijke eierstokkanker vóór analyse met LC-MS/MS (zie Materialen en Methoden; Figuur 2A). Om de algehele impact van dit protocol op metabolietveranderingen te beoordelen, hebben we de metabolietenprofielen van T-cellen geactiveerd door gezonde donoren na de bovengenoemde bead-scheidingsstap vergeleken met cellen die niet met beads waren gescheiden, maar op ijs waren bewaard. Deze kwaliteitscontroleanalyse toonde een hoge correlatie aan tussen deze twee condities (r = 0,77), en de technische herhaalbaarheid van de groep van 86 metabolieten is hoog (Figuur 2B). Deze methoden maken daarom nauwkeurige metabolietenanalyses mogelijk in cellen die een celtypeverrijking ondergaan, en bieden daarmee het eerste platform met hoge resolutie voor het identificeren van specifieke metabolieten in HGSC, waardoor onderzoekers een dieper inzicht kunnen krijgen in het celspecifieke seksuele metabolisme.
(A) Schematische weergave van magnetische kralenverrijking. Vóór analyse met LC-MS/MS ondergaan de cellen drie opeenvolgende rondes van magnetische kralenverrijking of blijven ze op ijs. (B) Het effect van het verrijkingstype op de abundantie van metabolieten. Het gemiddelde van drie metingen voor elk verrijkingstype ± SE. De grijze lijn geeft een 1:1-relatie weer. De intraclasscorrelatie (ICC) van herhaalde metingen wordt weergegeven in de aslabels. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Schematische weergave van de workflow voor patiëntmetabolietenanalyse. Ascites of tumoren worden verzameld bij patiënten en cryogepreserveerd. Een klein deel van elk monster werd geanalyseerd met flowcytometrie, terwijl de resterende monsters drie rondes van verrijking ondergingen voor CD4+, CD8+ en CD45- cellen. Deze celfracties werden geanalyseerd met LC-MS/MS. (D) Heatmap van de gestandaardiseerde metabolietenabundantie. Het dendrogram geeft Wards clustering van Euclidische afstanden tussen monsters weer. (E) Hoofdcomponentenanalyse (PCA) van de metabolietenkaart van het monster, met drie replicaten van elk monster; monsters van dezelfde patiënt zijn met een lijn verbonden. (F) De PCA van het metabolietenprofiel van het monster geconditioneerd op de patiënt (d.w.z. met behulp van gedeeltelijke redundantie); het monstertype wordt beperkt door de convexe omhulling. PC1, hoofdcomponent 1; PC2, hoofdcomponent 2.
Vervolgens pasten we deze verrijkingsmethode toe om 99 metabolieten te analyseren in de CD4+, CD8+ en CD45- celfracties in het primaire ascitesvocht en de tumoren van zes HGSC-patiënten (Figuur 2C, Figuur S3A en Tabel S3 en S4). De populatie van belang vertegenwoordigt 2% tot 70% van de oorspronkelijke grote steekproef van levende cellen, en het aandeel cellen varieert sterk tussen patiënten. Na het scheiden van de kralen vertegenwoordigt de verrijkte fractie van belang (CD4+, CD8+ of CD45-) gemiddeld meer dan 85% van alle levende cellen in de steekproef. Deze verrijkingsmethode stelt ons in staat om celpopulaties uit het metabolisme van menselijk tumorweefsel te analyseren, wat onmogelijk is met grote steekproeven. Met behulp van dit protocol stelden we vast dat l-kynurenine en adenosine, deze twee goed gekarakteriseerde immunosuppressieve metabolieten, verhoogd waren in tumor-T-cellen of tumorcellen (Figuur S3, B en C). Deze resultaten tonen daarom de betrouwbaarheid en het vermogen van onze celseparatie- en massaspectrometrietechnologie aan om biologisch belangrijke metabolieten in patiëntweefsels te vinden.
Onze analyse bracht ook een sterke metabole scheiding van celtypen binnen en tussen patiënten aan het licht (Figuur 2D en Figuur S4A). In het bijzonder vertoonde patiënt 70, vergeleken met andere patiënten, andere metabole kenmerken (Figuur 2E en Figuur S4B), wat erop wijst dat er mogelijk aanzienlijke metabole heterogeniteit tussen patiënten bestaat. Het is opmerkelijk dat de totale hoeveelheid ascites die bij patiënt 70 werd verzameld (80 ml) kleiner was dan bij andere patiënten (1,2 tot 2 liter; Tabel S1). De controle van de heterogeniteit tussen patiënten tijdens de principale componentenanalyse (bijvoorbeeld met behulp van partiële redundantieanalyse) toont consistente veranderingen tussen celtypen, en de celtypen en/of microomgeving zijn duidelijk geaggregeerd op basis van het metabolietenprofiel (Figuur 2F). De analyse van afzonderlijke metabolieten benadrukte deze effecten en onthulde significante verschillen tussen celtypen en microomgeving. Het is opmerkelijk dat het meest extreme verschil wordt waargenomen bij MNA, dat doorgaans verrijkt is in CD45-cellen en in CD4+ en CD8+ cellen die de tumor infiltreren (Figuur 3A). Voor CD4+ cellen is dit effect het duidelijkst, en de MNA in CD8+ cellen lijkt ook sterk beïnvloed te worden door de omgeving. Dit is echter niet relevant, omdat slechts drie van de zes patiënten geëvalueerd konden worden op CD8+ scores in de tumor. Naast MNA zijn in verschillende celtypen in ascites en tumoren ook andere metabolieten, die slecht gekarakteriseerd zijn in TIL, differentieel verrijkt (Figuren S3 en S4). Deze gegevens onthullen daarom een ​​veelbelovende reeks immunomodulerende metabolieten voor verder onderzoek.
(A) Genormaliseerde hoeveelheid MNA in CD4+, CD8+ en CD45- cellen uit ascites en tumor. De boxplot toont de mediaan (lijn), de interkwartielafstand (scharnierpunt) en het gegevensbereik, tot 1,5 keer de interkwartielafstand (snorhaar). Zoals beschreven in de patiëntenmaterialen en -methoden, wordt de limma-waarde van de patiënt gebruikt om de P-waarde te bepalen (*P<0,05 en **P<0,01). (B) Schematisch diagram van het MNA-metabolisme (60). Metabolieten: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteïne; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridon-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridon-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzymen (groen): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuïnes; NAMPT, nicotinamide fosforibosyltransferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mononucleotide adenylaattransferase; Pnp1, purine nucleoside fosforylase. (C) t-SNE van scRNA-seq van ascites (grijs) en tumor (rood; n = 3 patiënten). (D) NNMT-expressie in verschillende celpopulaties geïdentificeerd met behulp van scRNA-seq. (E) Expressie van NNMT en AOX1 in SK-OV-3, humane embryonale niercellen (HEK) 293T, T-cellen en met MNA behandelde T-cellen. De gevouwen expressie wordt weergegeven ten opzichte van SK-OV-3. Het expressiepatroon met SEM wordt weergegeven (n = 6 gezonde donoren). Ct-waarden groter dan 35 worden als niet detecteerbaar (UD) beschouwd. (F) Expressie van SLC22A1 en SLC22A2 in SK-OV-3, HEK293T, T-cellen en T-cellen behandeld met 8 mM MNA. De gevouwen expressie wordt weergegeven ten opzichte van SK-OV-3. Het expressiepatroon met SEM wordt weergegeven (n = 6 gezonde donoren). Ct-waarden groter dan 35 worden als niet detecteerbaar (UD) beschouwd. (G) MNA-gehalte in geactiveerde T-cellen van gezonde donoren na 72 uur incubatie met MNA. Het expressiepatroon met SEM wordt weergegeven (n = 4 gezonde donoren).
MNA wordt geproduceerd door de overdracht van de methylgroep van S-adenosyl-1-methionine (SAM) naar nicotinamide (NA) door nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Figuur 3B). NNMT wordt overmatig tot expressie gebracht in diverse menselijke kankers en is geassocieerd met proliferatie, invasie en metastase (25-27). Om de bron van MNA in T-cellen in de tumoromgeving beter te begrijpen, hebben we scRNA-seq gebruikt om de expressie van NNMT in verschillende celtypen in het ascitesvocht en de tumoren van drie HGSC-patiënten te karakteriseren (Tabel S5). Analyse van ongeveer 6500 cellen toonde aan dat in de ascites- en tumoromgeving de NNMT-expressie beperkt was tot de vermoedelijke fibroblast- en tumorcelpopulaties (Figuur 3, C en D). Het is belangrijk op te merken dat er geen duidelijke NNMT-expressie is in populaties die PTPRC (CD45+) tot expressie brengen (Figuur 3D en Figuur S5A), wat erop wijst dat de in het metabolietenspectrum gedetecteerde MNA in T-cellen is geïntroduceerd. De expressie van aldehyde-oxidase 1 (AOX1), dat MNA omzet in 1-methyl-2-pyridon-5-carboxamide (2-PYR) of 1-methyl-4-pyridon-5-carboxamide (4-PYR); Figuur 3B) is ook beperkt tot de populatie fibroblasten die COL1A1 tot expressie brengen (Figuur S5A), wat er samen op wijst dat T-cellen niet in staat zijn tot conventioneel MNA-metabolisme. Het expressiepatroon van deze MNA-gerelateerde genen werd geverifieerd met behulp van een tweede onafhankelijke dataset van cellen uit ascites van HGSC-patiënten (Figuur S5B; n = 6) (16). Bovendien toonde kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyse van T-cellen van gezonde donoren die met MNA waren behandeld aan dat, vergeleken met controle SK-OV-3 eierstoktumorcellen, NNMT of AOX1 vrijwel niet tot expressie kwam (Figuur 3E). Deze onverwachte resultaten wijzen erop dat MNA mogelijk door fibroblasten of tumoren wordt afgescheiden in aangrenzende T-cellen in de tumormicroomgeving.
Hoewel de kandidaten de familie van organische kationtransporters 1 tot 3 (OCT1, OCT2 en OCT3) omvatten, gecodeerd door de familie van oplosbare dragers 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 en SLC22A3), zijn de potentiële transporters van MNA nog steeds onbekend (28). QPCR van mRNA uit T-cellen van gezonde donoren toonde lage expressieniveaus van SLC22A1, maar ondetecteerbare niveaus van SLC22A2, wat bevestigde dat dit eerder in de literatuur was gerapporteerd (Figuur 3F) (29). Daarentegen vertoonde de SK-OV-3 eierstoktumorcellijn hoge expressieniveaus van beide transporters (Figuur 3F).
Om de mogelijkheid te testen dat T-cellen vreemd MNA kunnen opnemen, werden gezonde donor-T-cellen 72 uur lang gekweekt in aanwezigheid van verschillende concentraties MNA. Zonder exogeen MNA kon het cellulaire MNA-gehalte niet worden gedetecteerd (Figuur 3G). Geactiveerde T-cellen die met exogeen MNA werden behandeld, vertoonden echter een dosisafhankelijke toename van het MNA-gehalte in de cellen, tot 6 mM MNA (Figuur 3G). Dit resultaat geeft aan dat TIL, ondanks het lage expressieniveau van de transporter en het ontbreken van het belangrijkste enzym dat verantwoordelijk is voor het intracellulaire MNA-metabolisme, toch MNA kunnen opnemen.
Het spectrum aan metabolieten in de T-cellen van patiënten en in vitro MNA-absorptie-experimenten vergroten de kans dat kankerverwekkende fibroblasten (CAF) MNA afscheiden en dat tumorcellen het fenotype en de functie van TIL kunnen reguleren. Om het effect van MNA op T-cellen te bepalen, werden T-cellen van gezonde donoren in vitro geactiveerd in aanwezigheid of afwezigheid van MNA, waarna hun proliferatie en cytokineproductie werden geëvalueerd. Na 7 dagen toevoeging van MNA in de hoogste dosis was het aantal populatieverdubbelingen matig verminderd, terwijl de vitaliteit bij alle doses behouden bleef (Figuur 4A). Bovendien resulteerde behandeling met exogene MNA in een toename van het percentage CD4+ en CD8+ T-cellen die tumornecrosefactor-α (TNFα) tot expressie brachten (Figuur 4B). Daarentegen was de intracellulaire productie van IFN-γ significant verminderd in CD4+ T-cellen, maar niet in CD8+ T-cellen, en was er geen significante verandering in interleukine 2 (IL-2; Figuur 4, C en D). Daarom toonde een enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA) van de supernatantvloeistoffen van deze met MNA behandelde T-celculturen een significante toename van TNFα, een afname van IFN-γ en geen verandering in IL-2 (Figuur 4, E tot G). De afname van IFN-γ duidt erop dat MNA mogelijk een rol speelt bij het remmen van de antitumoractiviteit van T-cellen. Om het effect van MNA op T-celgemedieerde cytotoxiciteit te simuleren, werden chimere antigeenreceptor T-cellen (FRα-CAR-T-cellen) gericht op foliumzuurreceptor α en CAR-T-cellen (GFP-gereguleerd door groen fluorescerend eiwit (GFP)-CAR-T-cellen) geproduceerd uit mononucleaire cellen van perifeer bloed (PBMC) van gezonde donoren. CAR-T-cellen werden 24 uur gekweekt in aanwezigheid van MNA en vervolgens samen gekweekt met humane SK-OV-3 ovariumtumorcellen die foliumzuurreceptor α tot expressie brengen in een effector-targetverhouding van 10:1. De MNA-behandeling resulteerde in een significante afname van de dodende activiteit van FRα-CAR-T-cellen, vergelijkbaar met FRα-CAR-T-cellen behandeld met adenosine (Figuur 4H).
(A) Totaal aantal levensvatbare cellen en populatieverdubbeling (PD) rechtstreeks uit de kweek op dag 7. Het staafdiagram geeft het gemiddelde ± SEM weer van zes gezonde donoren. De gegevens zijn afkomstig van ten minste n = 3 onafhankelijke experimenten. (B tot en met D) CD3/CD28 en IL-2 werden gebruikt om T-cellen te activeren bij hun respectievelijke MNA-concentraties gedurende 7 dagen. Vóór de analyse werden de cellen gedurende 4 uur gestimuleerd met PMA/ionomycine met GolgiStop. TNFα (B) expressie in T-cellen. Voorbeeldafbeelding (links) en tabelgegevens (rechts) van TNFα-expressie in levende cellen. IFN-γ (C) en IL-2 (D) expressie in T-cellen. De expressie van cytokinen werd gemeten met flowcytometrie. Het staafdiagram geeft het gemiddelde (n = 6 gezonde donoren) ± SEM weer. Gebruik een eenzijdige variantieanalyse en herhaalde metingen (*P<0,05 en **P<0,01) om de P-waarde te bepalen. Representeert gegevens van ten minste n = 3 onafhankelijke experimenten. (E tot en met G) CD3/CD28 en IL-2 werden gebruikt om T-cellen te activeren bij hun respectievelijke MNA-concentraties gedurende 7 dagen. Het medium werd verzameld vóór en na 4 uur PMA/ionomycine-stimulatie. De concentraties van TNFα (E), IFN-γ (F) en IL-2 (G) werden gemeten met ELISA. Het staafdiagram geeft het gemiddelde (n = 5 gezonde donoren) ± SEM weer. P-waarde bepaald met behulp van een eenzijdige variantieanalyse en herhaalde metingen (*P<0,05). De stippellijn geeft de detectielimiet aan. (H) Cellysisassay. FRα-CAR-T- of GFP-CAR-T-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met adenosine (250 μM) of MNA (10 mM), of onbehandeld gelaten (Ctrl). Het percentage celdoding van SK-OV-3-cellen werd gemeten. De p-waarde is bepaald met behulp van de Welch t-toets (*P<0,5 en **P<0,01).
Om een ​​mechanistisch inzicht te verkrijgen in de MNA-afhankelijke regulatie van TNFα-expressie, werden de veranderingen in TNFα-mRNA van met MNA behandelde T-cellen geëvalueerd (Figuur 5A). Gezonde donor-T-cellen die met MNA werden behandeld, vertoonden een tweevoudige toename in TNFα-transcriptieniveaus, wat aangeeft dat MNA afhankelijk is van de transcriptionele regulatie van TNFα. Om dit mogelijke regulatiemechanisme te onderzoeken, werden twee bekende transcriptiefactoren die TNFα reguleren, namelijk geactiveerde T-celkernfactor (NFAT) en specifiek proteïne 1 (Sp1), geëvalueerd als reactie op de binding van MNA aan de proximale TNFα-promotor (30). De TNFα-promotor bevat 6 geïdentificeerde NFAT-bindingsplaatsen en 2 Sp1-bindingsplaatsen, die elkaar overlappen op één plaats [-55 basenparen (bp) van de 5'-cap] (30). Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) toonde aan dat de binding van Sp1 aan de TNFα-promotor drievoudig toenam na behandeling met MNA. De incorporatie van NFAT nam ook toe en benaderde een belangrijk niveau (Figuur 5B). Deze gegevens geven aan dat MNA de expressie van TNFα reguleert via Sp1-transcriptie, en in mindere mate de expressie van NFAT.
(A) Vergeleken met T-cellen gekweekt zonder MNA, de vouwverandering van TNFα-expressie in T-cellen behandeld met MNA. Het expressiepatroon met SEM wordt weergegeven (n = 5 gezonde donoren). Representatieve gegevens van ten minste n = 3 onafhankelijke experimenten. (B) De TNFα-promotor van T-cellen behandeld met of zonder 8 mM MNA nadat NFAT en Sp1 gecombineerd waren met (Ctrl) en PMA/ionomycine-stimulatie gedurende 4 uur. Immunoglobuline G (IgG) en H3 werden respectievelijk gebruikt als negatieve en positieve controle voor immunoprecipitatie. De kwantificering van ChIP toonde aan dat de binding van Sp1 en NFAT aan de TNFα-promotor in met MNA behandelde cellen meerdere malen was toegenomen in vergelijking met de controle. Representatieve gegevens van ten minste n = 3 onafhankelijke experimenten. P-waarde bepaald door meervoudige t-toetsen (*** P < 0,01). (C) In vergelijking met het ascitesvocht van HGSC vertoonden T-cellen (niet-cytotoxisch) een verhoogde expressie van TNF in de tumor. De kleuren vertegenwoordigen verschillende patiënten. De weergegeven cellen zijn willekeurig geselecteerd tot 300 en gejitterd om overtekening te beperken (** Padj = 0,0076). (D) Voorgesteld model van MNA voor eierstokkanker. MNA wordt geproduceerd in tumorcellen en fibroblasten in de tumormicroomgeving en wordt opgenomen door T-cellen. MNA verhoogt de binding van Sp1 aan de TNFα-promotor, wat leidt tot verhoogde TNFα-transcriptie en TNFα-cytokineproductie. MNA veroorzaakt ook een afname van IFN-γ. Remming van de T-celfunctie leidt tot een verminderd dodend vermogen en versnelde tumorgroei.
Volgens rapporten heeft TNFα zowel front- als back-afhankelijke antitumorale effecten, maar het is ook bekend dat het een rol speelt bij het bevorderen van de groei en metastase van eierstokkanker (31-33). Volgens rapporten is de concentratie van TNFα in ascites en tumorweefsel bij patiënten met eierstokkanker hoger dan in goedaardig weefsel (34-36). Mechanistisch gezien kan TNFα de activering, functie en proliferatie van witte bloedcellen reguleren en het fenotype van kankercellen veranderen (37, 38). In overeenstemming met deze bevindingen toonde differentiële genexpressieanalyse aan dat TNF significant verhoogd was in T-cellen in tumorweefsel vergeleken met ascites (Figuur 5C). De toename in TNF-expressie was alleen zichtbaar in T-celpopulaties met een niet-cytotoxisch fenotype (Figuur S5A). Samenvattend ondersteunen deze gegevens de opvatting dat MNA een dubbel immunosuppressief en tumorbevorderend effect heeft in HGSC.
Fluorescente labeling op basis van flowcytometrie is de belangrijkste methode geworden voor het bestuderen van het metabolisme van tumorinfiltrerende lymfocyten (TIL). Uit deze studies is gebleken dat muizen- en menselijke TIL, vergeleken met lymfocyten uit perifeer bloed of T-cellen uit secundaire lymfoïde organen, een grotere neiging hebben tot glucoseopname (4, 39) en een geleidelijk verlies van mitochondriale functie (19, 40). Hoewel we in deze studie vergelijkbare resultaten hebben waargenomen, is de belangrijkste ontwikkeling het vergelijken van het metabolisme van tumorcellen en TIL uit hetzelfde verwijderde tumorweefsel. In overeenstemming met enkele van deze eerdere rapporten hebben tumorcellen (CD45-EpCAM+) uit ascites en tumoren een hogere glucoseopname dan CD8+ en CD4+ T-cellen, wat ondersteunt dat de hoge glucoseopname van tumorcellen vergelijkbaar is met die van T-cellen. Het concept van T-celcompetitie. De mitochondriale activiteit van tumorcellen is echter hoger dan die van CD8+ T-cellen, maar vergelijkbaar met die van CD4+ T-cellen. Deze resultaten versterken het opkomende thema dat oxidatief metabolisme belangrijk is voor tumorcellen (41, 42). Ze suggereren ook dat CD8+ T-cellen mogelijk gevoeliger zijn voor oxidatieve disfunctie dan CD4+ T-cellen, of dat CD4+ T-cellen andere koolstofbronnen dan glucose gebruiken om de mitochondriale activiteit te behouden (43, 44). Het is belangrijk op te merken dat we geen verschil in glucoseopname of mitochondriale activiteit hebben waargenomen tussen CD4+ T-effectorcellen, T-effectorgeheugencellen en T-centrale geheugencellen in ascites. Evenzo heeft de differentiatiestatus van CD8+ T-cellen in tumoren niets te maken met veranderingen in glucoseopname, wat het significante verschil benadrukt tussen in vitro gekweekte T-cellen en humane TIL in vivo (22). Deze observaties werden ook bevestigd door het gebruik van onbevooroordeelde automatische celpopulatietoewijzing, waaruit verder bleek dat CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ cellen met een hogere glucoseopname en mitochondriale activiteit dan tumorcellen veel voorkomen, maar een metabolisch actieve celpopulatie vormen. Deze populatie vertegenwoordigt mogelijk de veronderstelde subpopulatie van myeloïde suppressorcellen of plasmacytoïde dendritische cellen die in de scRNA-seq-analyse zijn geïdentificeerd. Hoewel beide zijn gerapporteerd in menselijke ovariumtumoren [45], is verder onderzoek nodig om deze myeloïde subpopulatie te beschrijven.
Hoewel op flowcytometrie gebaseerde methoden de algemene verschillen in glucose- en oxidatief metabolisme tussen celtypen kunnen verduidelijken, zijn de precieze metabolieten die door glucose of andere koolstofbronnen worden geproduceerd voor mitochondriaal metabolisme in de tumormicroomgeving (TME) nog niet vastgesteld. Het toewijzen van de aanwezigheid of afwezigheid van metabolieten aan een bepaalde TIL-subgroep vereist zuivering van de celpopulatie uit het geëxcideerde weefsel. Daarom kan onze celverrijkingsmethode in combinatie met massaspectrometrie inzicht geven in de metabolieten die differentieel verrijkt zijn in T-cellen en tumorcelpopulaties in overeenkomende patiëntmonsters. Hoewel deze methode voordelen heeft ten opzichte van fluorescentie-geactiveerde celsortering, kunnen bepaalde metabolietenbibliotheken worden beïnvloed door inherente stabiliteit en/of een snelle omzetsnelheid (22). Desondanks was onze methode in staat om twee bekende immunosuppressieve metabolieten, adenosine en kynurenine, te identificeren, omdat deze sterk variëren tussen verschillende monstertypen.
Onze metabonomische analyse van tumoren en TIL-subtypen biedt meer inzicht in de rol van metabolieten in de ovariële tumoromgeving. Ten eerste hebben we met behulp van flowcytometrie vastgesteld dat er geen verschil is in mitochondriale activiteit tussen tumoren en CD4+ T-cellen. LC-MS/MS-analyse bracht echter significante veranderingen aan het licht in de abundantie van metabolieten tussen deze populaties, wat aangeeft dat conclusies over het TIL-metabolisme en de algehele metabolische activiteit ervan zorgvuldig moeten worden geïnterpreteerd. Ten tweede is MNA de metaboliet met het grootste verschil tussen CD45-cellen en T-cellen in ascites, maar niet in tumoren. Compartimentalisatie en tumorlocatie kunnen dus verschillende effecten hebben op het TIL-metabolisme, wat de mogelijke heterogeniteit in een gegeven microomgeving benadrukt. Ten derde is de expressie van het MNA-producerende enzym NNMT voornamelijk beperkt tot CAF's, wat in mindere mate tumorcellen betreft, maar detecteerbare MNA-niveaus worden waargenomen in tumor-afgeleide T-cellen. De overexpressie van NNMT in ovariële CAF heeft een bekend kankerbevorderend effect, deels vanwege de bevordering van het CAF-metabolisme, tumorinvasie en metastase (27). Hoewel het algehele niveau van TIL matig is, is de expressie van NNMT in CAF nauw gerelateerd aan het mesenchymale subtype van de Cancer Genome Atlas (TCGA), dat geassocieerd wordt met een slechte prognose (27, 46, 47). Ten slotte is de expressie van het enzym AOX1, verantwoordelijk voor de afbraak van MNA, ook beperkt tot de CAF-populatie, wat aangeeft dat T-cellen niet in staat zijn MNA te metaboliseren. Deze resultaten ondersteunen het idee dat, hoewel verder onderzoek nodig is om deze bevinding te verifiëren, hoge niveaus van MNA in T-cellen kunnen wijzen op de aanwezigheid van een immunosuppressieve CAF-microomgeving.
Gezien de lage expressie van MNA-transporters en de ondetecteerbare niveaus van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij het MNA-metabolisme, is de aanwezigheid van MNA in T-cellen onverwacht. Noch NNMT noch AOX1 konden worden gedetecteerd door scRNA-seq-analyse en gerichte qPCR van twee onafhankelijke cohorten. Deze resultaten wijzen erop dat MNA niet door T-cellen wordt gesynthetiseerd, maar wordt opgenomen uit de omringende tumormicroomgeving. In vitro-experimenten tonen aan dat T-cellen de neiging hebben om exogene MNA te accumuleren.
Uit onze in vitro-studies is gebleken dat exogeen MNA de expressie van TNFα in T-cellen induceert en de binding van Sp1 aan de TNFα-promotor versterkt. Hoewel TNFα zowel antitumorale als antitumorale functies heeft, kan TNFα bij eierstokkanker de groei van eierstokkanker bevorderen (31-33). Neutralisatie van TNFα in eierstoktumorcelculturen of eliminatie van het TNFα-signaal in muismodellen kan de TNFα-gemedieerde productie van inflammatoire cytokinen verbeteren en de tumorgroei remmen (32, 35). In dit geval kan TME-afgeleid MNA dus fungeren als een pro-inflammatoir metaboliet via een TNFα-afhankelijk mechanisme door middel van de autocriene lus, waardoor het ontstaan ​​en de verspreiding van eierstokkanker worden bevorderd (31). Op basis van deze mogelijkheid wordt TNFα-blokkade onderzocht als een potentieel therapeutisch middel voor eierstokkanker (37, 48, 49). Bovendien vermindert MNA de cytotoxiciteit van CAR-T-cellen ten opzichte van eierstoktumorcellen, wat verder bewijs levert voor MNA-gemedieerde immuunsuppressie. Gezamenlijk suggereren deze resultaten een model waarin tumoren en CAF-cellen MNA afscheiden in de extracellulaire TME. Door (i) TNF-geïnduceerde groeistimulatie van eierstokkanker en (ii) MNA-geïnduceerde remming van de cytotoxische activiteit van T-cellen kan dit een dubbel tumoreffect hebben (Figuur 5D).
Samenvattend heeft deze studie, door een combinatie van snelle celverrijking, single-cell sequencing en metabolische profilering toe te passen, de enorme immunometabolomische verschillen tussen tumorcellen en ascitescellen bij HGSC-patiënten aan het licht gebracht. Deze uitgebreide analyse toonde aan dat er verschillen zijn in glucoseopname en mitochondriale activiteit tussen T-cellen, en identificeerde MNA als een niet-cel-autonoom immuunregulerend metaboliet. Deze gegevens hebben implicaties voor de manier waarop de tumormicroomgeving (TME) het T-celmetabolisme in menselijke kankers beïnvloedt. Hoewel er sprake is van directe concurrentie om voedingsstoffen tussen T-cellen en kankercellen, kunnen metabolieten ook fungeren als indirecte regulatoren die de tumorprogressie bevorderen en mogelijk endogene immuunreacties onderdrukken. Een verdere beschrijving van de functionele rol van deze regulerende metabolieten kan alternatieve strategieën opleveren voor het versterken van de antitumorale immuunrespons.
Patiëntmonsters en klinische gegevens werden verkregen via de door het Canadian Tissue Repository Network gecertificeerde tumorweefselbank van British Columbia. Volgens het protocol dat is goedgekeurd door de BC Cancer Research Ethics Committee en de University of British Columbia (H07-00463), is voor alle patiëntmonsters en klinische gegevens schriftelijke toestemming verkregen of is formeel afstand gedaan van toestemming. De monsters worden bewaard in de gecertificeerde biobank (BRC-00290). Gedetailleerde patiëntkenmerken worden weergegeven in tabellen S1 en S5. Voor cryopreservatie wordt een scalpel gebruikt om het tumorweefsel van de patiënt mechanisch te verkleinen en vervolgens door een filter van 100 micron te persen om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen te verkrijgen. Het ascitesvocht van de patiënt werd gedurende 10 minuten bij 1500 tpm en 4 °C gecentrifugeerd om de cellen te bezinken en het supernatant te verwijderen. Cellen afkomstig uit tumoren en ascitesvocht werden cryogepreserveerd in 50% warmte-geïnactiveerd humaan AB-serum (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) en 10% dimethylsulfoxide. Deze geconserveerde celsuspensies werden ontdooid en gebruikt voor metabolomics en metabolietbepaling zoals hieronder beschreven.
Het complete medium bestaat uit 0,22 μm gefilterd 50:50 aangevuld RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd humaan AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific), 1 x Penicilline Streptomycine (PenStrep) oplossing (Thermo Fisher Scientific) en 50 μM-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) is aangevuld met 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) en 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). De kleurbuffer voor de flowcytometer bestond uit 0,22 μm gefilterde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Invitrogen) aangevuld met 3% warmte-geïnactiveerd AB-humaan serum (Sigma). De celverrijkingsbuffer is samengesteld uit 0,22 μm gefilterde PBS en aangevuld met 0,5% warmte-geïnactiveerd humaan AB-serum (Sigma-Aldrich).
In een compleet medium van 37 °C werden cellen gedurende 30 minuten gekleurd met 10 nM MT DR en 100 μM 2-NBDG. Vervolgens werden de cellen gedurende 15 minuten bij 4 °C gekleurd met de vitaliteitskleurstof eF506. Resuspendeer de cellen in FC Block (eBioscience) en Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), verdun in flowcytometrie-kleurbuffer (volgens de instructies van de fabrikant) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de cellen gedurende 20 minuten bij 4 °C met een set antilichamen (Tabel S2) in flowcytometrie-kleurbuffer. Resuspendeer de cellen in flowcytometrie-kleurbuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-configuratie) vóór analyse. Gebruik SpectroFlo en FlowJo V10 om de celtellinggegevens te analyseren en GraphPad Prism 8 om de gegevens te genereren. De mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van 2-NBDG en MT DR werd logaritmisch genormaliseerd, waarna een gepaarde t-toets werd gebruikt voor statistische analyse om rekening te houden met gematchte patiënten. Alle populaties met minder dan 40 gebeurtenissen werden uit de analyse verwijderd; voor alle negatieve waarden werd een MFI-waarde van 1 ingevoerd alvorens de statistische analyse en datavisualisatie werden uitgevoerd.
Om de handmatige gatingstrategie van het bovenstaande procespaneel aan te vullen, hebben we de volledige annotatie door de vormbeperkingsboom (FAUST) (21) gebruikt om cellen automatisch aan de populatie toe te wijzen na het verwijderen van dode cellen in FlowJo. We beheren de uitvoer handmatig om populaties die verkeerd lijken te zijn toegewezen (een combinatie van PD1+ en PD1- tumorcellen) en behouden populaties samen te voegen. Elk monster bevat gemiddeld meer dan 2% cellen, wat resulteert in een totaal van 11 populaties.
Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugatie werd gebruikt om PBMC te scheiden van leukocytenscheidingsproducten (STEMCELL Technologies). CD8+ T-cellen werden geïsoleerd uit PBMC met behulp van CD8 MicroBeads (Miltenyi) en gedurende 2 weken geëxpandeerd in compleet medium met TransAct (Miltenyi) volgens de instructies van de fabrikant. De cellen werden 5 dagen in compleet medium met IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) gehouden en vervolgens opnieuw gestimuleerd met TransAct. Op dag 7 werden, volgens de instructies van de fabrikant, humane CD45 MicroBeads (Miltenyi) gebruikt om cellen in drie opeenvolgende rondes te verrijken. De cellen werden gealiquoteerd voor flowcytometrie-analyse (zoals hierboven beschreven) en één miljoen cellen werden driemaal gealiquoteerd voor LC-MS/MS-analyse. De monsters werden verwerkt met LC-MS/MS zoals hieronder beschreven. We schatten de ontbrekende metabolietwaarde met een ionenaantal van 1000. Elk monster wordt genormaliseerd door het totale aantal ionen (TIC), logaritmisch omgerekend en automatisch genormaliseerd in MetaboAnalystR vóór de analyse.
De celsuspensie van elke patiënt werd ontdooid en door een 40 μm filter gefilterd in compleet medium (zoals hierboven beschreven). Volgens het protocol van de fabrikant werden drie opeenvolgende rondes van positieve selectie door magnetische scheiding met behulp van MicroBeads (Miltenyi) gebruikt om de monsters te verrijken met CD8+, CD4+ en CD45- cellen (op ijs). Kort gezegd worden de cellen opnieuw gesuspendeerd in celverrijkingsbuffer (zoals hierboven beschreven) en geteld. De cellen werden gedurende 15 minuten bij 4°C geïncubeerd met humane CD8-kralen, humane CD4-kralen of humane CD45-kralen (Miltenyi) en vervolgens gewassen met celverrijkingsbuffer. Het monster wordt door de LS-kolom (Miltenyi) geleid en de positieve en negatieve fracties worden verzameld. Om de duur te verkorten en het celherstel te maximaliseren, wordt de CD8-fractie vervolgens gebruikt voor de tweede ronde van CD4+-verrijking en de CD4-fractie voor de daaropvolgende CD45-verrijking. Bewaar de oplossing tijdens het hele scheidingsproces op ijs.
Om monsters voor metabolietenanalyse voor te bereiden, werden de cellen eenmaal gewassen met een ijskoude zoutoplossing. Aan elk monster werd 1 ml 80% methanol toegevoegd, waarna de monsters werden geschud en snel ingevroren in vloeibare stikstof. De monsters werden driemaal ingevroren en ontdooid en vervolgens gedurende 15 minuten bij 4°C gecentrifugeerd met 14.000 tpm. Het supernatant met de metabolieten werd ingedampt tot droog. De metabolieten werden opnieuw opgelost in 50 μl 0,03% mierenzuur, geschud om te mengen en vervolgens gecentrifugeerd om deeltjes te verwijderen.
Extraheer metabolieten zoals hierboven beschreven. Breng het supernatant over naar een fles voor hogedruk-vloeistofchromatografie voor metabolomics-onderzoek. Gebruik een willekeurig behandelingsprotocol om elk monster met een vergelijkbaar aantal cellen te behandelen en zo batch-effecten te voorkomen. We hebben een kwalitatieve beoordeling van de globale metabolieten uitgevoerd die eerder zijn gepubliceerd op de AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Chromatografische analyse en piekoppervlakte-integratie werden uitgevoerd met behulp van MultiQuant versie 2.1 software (Applied Biosystems SCIEX).
Een ionentelling van 1000 werd gebruikt om de ontbrekende metabolietwaarde te schatten, en de TIC van elk monster werd gebruikt om het genormaliseerde piekoppervlak van elke gedetecteerde metaboliet te berekenen om te corrigeren voor veranderingen die door de instrumentele analyse als gevolg van de monsterverwerking werden geïntroduceerd. Nadat de TIC is genormaliseerd, wordt MetaboAnalystR(51) (standaardparameter) gebruikt voor logaritmische conversie en automatische schaling van de normlijn. We gebruikten PCA met het vegan R-pakket om een ​​verkennende analyse uit te voeren van metaboloomverschillen tussen monstertypen, en gebruikten partiële redundantieanalyse om patiënten te analyseren. We gebruikten de Ward-methode om een ​​heatmap-dendrogram te construeren om de Euclidische afstand tussen monsters te clusteren. We gebruikten limma (52) op gestandaardiseerde metabolietabundantie om differentieel abundante metabolieten te identificeren in het gehele celtype en microomgeving. Om de uitleg te vereenvoudigen, gebruiken we de parameter 'groepsgemiddelde' om het model te specificeren en beschouwen we de celtypen in de microomgeving als elke groep (n = 6 groepen); Voor de significantietoets hebben we voor elke metaboliet drie herhaalde metingen uitgevoerd. Om valse replicatie te voorkomen, werd de patiënt als obstakel opgenomen in het limma-ontwerp. Om de verschillen in metabolieten tussen verschillende patiënten te controleren, hebben we het limma-model aangepast door de patiënten op een vaste manier op te nemen. We rapporteren de significantie van het vooraf gespecificeerde contrast tussen het celtype en de microomgeving van Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-correctie).
Na verrijking van de vitaliteit met behulp van de Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% levensvatbaarheid), werd single-cell transcriptoomsequencing uitgevoerd op de totale levende, bevroren ascites- en tumormonsters met behulp van een 10x 5'-genexpressieprotocol. Vijf gevallen met overeenkomende tumoren en ascites werden geanalyseerd, hoewel de lage levensvatbaarheid van één tumormonster de inclusie ervan verhinderde. Om meerdere patiënten te kunnen selecteren, combineerden we de monsters van elke patiënt in de lanes van de 10x chroomcontroller en analyseerden we de ascites- en tumorlocaties afzonderlijk. Na sequencing [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; een gemiddelde van 73.488 en 41.378 reads per cel voor respectievelijk tumor en ascites]], gebruikten we CellSNP en Vireo (53) (gebaseerd op CellSNP als De gemeenschappelijke menselijke SNP (VCF) geleverd door GRCh38 krijgt een donoridentiteit toegewezen. We gebruiken SNPRelate om de dichtstbijzijnde identiteit (IBS) van de genotypestatus (IBS) van de patiënt af te leiden, waarbij niet-toegewezen cellen en cellen die als duplexen zijn geïdentificeerd worden uitgesloten en donoren tussen ascites- en tumormonsters worden gematcht (54). Op basis van deze taak hebben we drie gevallen met een overvloedige celrepresentatie in de tumor en ascites behouden voor verdere analyse. Na het uitvoeren van een massafiltratiestap in de scater (55) en scran (56) BioConductor-verpakking leverde dit 6975 cellen op (2792 en 4183 cellen uit respectievelijk tumor en ascites) voor analyse. We gebruiken igraph's (57) Louvain-clustering van gedeelde nearest neighbor-netwerken (SNN) gebaseerd op basis van de Jaccard-afstand om cellen te clusteren op basis van expressie. De clusters werden handmatig geannoteerd tot vermoedelijke celtypen op basis van de expressie van markergenen en gevisualiseerd met t-SNE. Cytotoxische T-cellen worden gedefinieerd door de expressie van CD8A en GZMA, met uitzondering van subclusters met een lage ribosomale eiwitexpressie. We hebben de gepubliceerde gegevens van Izar et al. (16) geraadpleegd, inclusief hun t-SNE-embedding, waarmee de expressie-overlap tussen immuuncelmarkers en NNMT-expressie kan worden gecontroleerd.
PBMC's werden gescheiden van leukocytenseparatieproducten (STEMCELL Technologies) door middel van Ficoll-gradiëntcentrifugatie. CD3+-cellen werden geïsoleerd uit PBMC's met behulp van CD3-kralen (Miltenyi). In aanwezigheid of afwezigheid van MNA werden CD3+-cellen geactiveerd met plaatgebonden CD3 (5 μg/ml), oplosbaar CD28 (3 μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Op de laatste dag van de expansie werden de levensvatbaarheid (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) en proliferatie (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) geëvalueerd met behulp van flowcytometrie. Evalueer de effectorfunctie door cellen gedurende 4 uur te stimuleren met PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1 μg/ml) met GolgiStop, en monitor CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) en TNFα-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (MAb11, BD). Stimuleer qPCR- en ChIP-cellen gedurende 4 uur met PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1 μg/ml). Het ELISA-supernatant werd verzameld vóór en na stimulatie met PMA (20 ng/ml) en ionomycine (1 μg/ml) gedurende 4 uur.
Volg het protocol van de fabrikant om RNA te isoleren met behulp van de RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Gebruik de QIAshredder (QIAGEN) om het monster te homogeniseren. Gebruik de high-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) om complementair DNA (cDNA) te synthetiseren. Gebruik de TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) om genexpressie te kwantificeren (volgens het protocol van de fabrikant) met de volgende probes: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-fosfaat off Hydrogen (GAPDH)] en Hs01010726_m1 (SLC22A2). De monsters werden geanalyseerd met behulp van het StepOnePlus real-time PCR-systeem (Applied Biosystems) in een MicroAmp fast optical 96-wells reactieplaat (Applied Biosystems) met MicroAmp optische film. Elke Ct-waarde die hoger is dan 35 wordt beschouwd als boven de detectiedrempel en wordt gemarkeerd als niet detecteerbaar.
Voer ChIP uit zoals eerder beschreven (58). Kort gezegd werden de cellen behandeld met formaldehyde (eindconcentratie 1,42%) en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Gebruik aangevulde zwelbuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl en 0,1% NP-40) op ijs gedurende 10 minuten en resuspendeer vervolgens in immunoprecipitatiebuffer zoals beschreven (58). Het monster werd vervolgens gesoniceerd met de volgende cycli: 10 cycli (20 pulsen van 1 seconde) en een statische tijd van 40 seconden. Incubeer ChIP-geschikte immunoglobuline G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histone H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) en SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antilichamen met het monster gedurende de nacht bij 4 °C onder schudden. Incubeer de proteïne A-parels (Thermo Fisher Scientific) met het monster gedurende 1 uur bij 4 °C onder zacht schudden. Gebruik vervolgens Chelex-parels (Bio-Rad) om het DNA te verrijken en proteinase K (Thermo Fisher) voor de eiwitvertering. De TNFα-promotor werd gedetecteerd met PCR: forward primer, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; reverse primer, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp product). De beelden werden gegenereerd met Image Lab (Bio-Rad) en gekwantificeerd met ImageJ-software.
Het celkweeksupernatant werd verzameld zoals hierboven beschreven. De bepaling werd uitgevoerd volgens de procedures van de fabrikant van de humane TNFα ELISA-kit (Invitrogen), de humane IL-2 ELISA-kit (Invitrogen) en de humane IFN-γ ELISA-kit (Abcam). Volgens het protocol van de fabrikant werd het supernatant 1:100 verdund voor de detectie van TNFα en IL-2, en 1:3 voor de detectie van IFN-γ. Gebruik de EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) om de absorptie bij 450 nm te meten.
PBMC's werden gescheiden van leukocytenscheidingsproducten (STEMCELL Technologies) door middel van Ficoll-gradiëntdichtheidscentrifugatie. CD3+-cellen werden geïsoleerd uit PBMC's met behulp van CD3-beads (Miltenyi). In aanwezigheid of afwezigheid van MNA werden CD3+-cellen gedurende 3 dagen geactiveerd met plaatgebonden CD3 (5 μg/ml), oplosbaar CD28 (3 μg/ml) en IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Na 3 dagen werden de cellen verzameld en gewassen met 0,9% zoutoplossing, waarna de pellet direct werd ingevroren. Het aantal cellen werd bepaald met flowcytometrie (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-configuratie) met behulp van 123count eBeads.
Extraheer de metabolieten zoals hierboven beschreven. Het gedroogde extract werd gereconstitueerd tot een concentratie van 4000 cel-equivalenten/μl. Analyseer het monster met behulp van omgekeerde-fasechromatografie (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) en een CORTECS T3-kolom (2,1 × 150 mm, deeltjesgrootte 1,6 μm, poriegrootte 120 Å; #186008500, Waters). Gebruik een polaire massaspectrometer (6470, Agilent), waarin elektrospray-ionisatie in de positieve modus werkt. Mobiele fase A bestaat uit 0,1% mierenzuur (in H₂O), mobiele fase B bestaat uit 90% acetonitril en 0,1% mierenzuur. De LC-gradiënt is als volgt: 0 tot 2 minuten voor 100% A, 2 tot 7,1 minuten voor 99% B en 7,1 tot 8 minuten voor 99% B. Vervolgens wordt de kolom opnieuw geëquilibreerd met mobiele fase A met een stroomsnelheid van 0,6 ml/min gedurende 3 minuten. De stroomsnelheid is 0,4 ml/min en de kolomkamer wordt verwarmd tot 50 °C. Gebruik de zuivere chemische standaard van MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) om de retentietijd (RT) en transformatie vast te stellen (RT = 0,882 minuten, transformatie 1 = 137→94,1, transformatie 2 = 137→92, transformatie 3 = 137→78). Wanneer alle drie de transities op de juiste retentietijd plaatsvinden, wordt transitie 1 gebruikt voor kwantificering om specificiteit te garanderen. De standaardcurve van MNA (Toronto Research Chemical Company) werd gegenereerd door zes seriële verdunningen van de stamoplossing (1 mg/ml) om standaarden te verkrijgen van respectievelijk 0,1, 1,0, 10 en 100 ng/ml en 1,0 en 10 μg/ml in vloeibare vorm. De detectielimiet is 1 ng/ml en de lineaire respons ligt tussen 10 ng/ml en 10 μg/ml. Elke injectie van twee microliter monster en standaard wordt gebruikt voor LC/MS-analyse, en elke acht injecties wordt een gemengd kwaliteitscontrolemonster meegenomen om de stabiliteit van het analyseplatform te waarborgen. De MNA-responsen van alle met MNA behandelde celmonsters vielen binnen het lineaire bereik van de assay. De data-analyse werd uitgevoerd met behulp van de kwantitatieve analyse software MassHunter (v9.0, Agilent).
De tweede generatie αFR-CAR-constructie is afkomstig van Song et al. (59). Kort gezegd bevat de constructie de volgende onderdelen: CD8a-leidersequentie, een humaan αFR-specifiek enkelstrengs variabel fragment, CD8a-scharnier- en transmembraanregio, CD27-intracellulair domein en CD3z-intracellulair domein. De volledige CAR-sequentie werd gesynthetiseerd door GenScript en vervolgens gekloneerd in de tweede generatie lentivirale expressievector stroomopwaarts van de GFP-expressiecassette die gebruikt werd om de transductie-efficiëntie te evalueren.
Lentivirus wordt geproduceerd door transfectie van HEK293T-cellen [American Type Culture Collection (ATCC)], gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% PenStrep, en met gebruik van de CAR-GFP-vector en de verpakkingsplasmiden (psPAX2 en pMD2.G, Addgene) met behulp van lipofectie-amine (Sigma-Aldrich). Het virusbevattende supernatant werd 48 en 72 uur na transfectie verzameld, gefilterd en geconcentreerd door ultracentrifugatie. Bewaar het geconcentreerde virale supernatant bij -80 °C tot de transductie.
PBMC's worden gescheiden van leukocytenproducten van gezonde donoren (STEMCELL Technologies) door middel van Ficoll-gradiëntcentrifugatie. Gebruik positieve selectie CD8-microkralen (Miltenyi) om CD8+-cellen uit PBMC's te isoleren. Stimuleer T-cellen met TransAct (Miltenyi) in TexMACS-medium [Miltenyi; aangevuld met 3% warmte-geïnactiveerd humaan serum, 1% PenStrep en IL-2 (300 U/ml)]. Vierentwintig uur na stimulatie werden de T-cellen getransduceerd met lentivirus (10 μl geconcentreerd virussupernatant per 10⁶ cellen). 1 tot 3 dagen na transductie op Cytek Aurora (op FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) wordt de GFP-expressie van de cellen geëvalueerd om een ​​transductie-efficiëntie van ten minste 30% aan te tonen.
CAR-T-cellen werden 24 uur gekweekt in Immunocult (STEMCELL Technologies; aangevuld met 1% PenStrep) onder de volgende omstandigheden: onbehandeld, behandeld met 250 μM adenosine of 10 mM MNA. Na de voorbehandeling werden de CAR-T-cellen gewassen met PBS en gecombineerd met 20.000 SK-OV-3-cellen [ATCC; in McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) aangevuld met 10% FBS en 1% PenStrep in een verhouding van 10: De effector-target-ratio van 1 werd in drievoud vermenigvuldigd in aangevuld Immunocult-medium. SK-OV-3-cellen en SK-OV-3-cellen gelyseerd met digitalissaponine (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) werden respectievelijk gebruikt als negatieve en positieve controle. Na 24 uur co-cultivatie werd het supernatant verzameld en werd de lactaatdehydrogenase (LDH) gemeten volgens de instructies van de fabrikant (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Het LDH-supernatant werd 1:50 verdund in LDH-buffer. Het percentage celdoding werd berekend met de volgende formule: percentage celdoding = percentage correctie / maximale celdoding x 100%, waarbij percentage correctie = co-cultuur - alleen T-cellen, en maximale celdoding = positieve controle - negatieve controle.
Zoals beschreven in de tekst of de methoden en technieken, gebruikt u GraphPad Prism 8, Microsoft Excel of R v3.6.0 voor statistische analyses. Als er meerdere monsters van dezelfde patiënt worden verzameld (zoals ascites en tumor), gebruiken we een gepaarde t-toets of nemen we de patiënt op als een willekeurig effect in een lineair of gegeneraliseerd model, afhankelijk van wat het meest geschikt is. Voor metabolomics-analyses wordt de belangrijkheidstoets in drievoud uitgevoerd.
Voor aanvullend materiaal bij dit artikel kunt u terecht op http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dit is een open access-artikel dat is gepubliceerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License. Deze licentie staat gebruik, verspreiding en reproductie in elk medium toe, zolang het uiteindelijke gebruik niet commercieel is en ervan uitgaat dat het originele werk correct is. Referentie.
Let op: we vragen u alleen om uw e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u de pagina aanbeveelt weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat het geen spam is. We zullen geen e-mailadressen opslaan.
Deze vraag wordt gebruikt om te controleren of u een bezoeker bent en om automatische spaminzendingen te voorkomen.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draagt ​​bij aan de immuunonderdrukking van T-cellen en vormt een potentieel doelwit voor immunotherapie bij de behandeling van menselijke kanker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA draagt ​​bij aan de immuunonderdrukking van T-cellen en vormt een potentieel doelwit voor immunotherapie bij de behandeling van menselijke kanker.
©2021 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap. alle rechten voorbehouden. AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER. Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.